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近年来，侵袭性真菌感染（IFD）的发病率和病死率逐年增高，临床上常见的侵袭性真菌主要有以念珠菌为主的酵母样真菌和以曲霉为主的丝状真菌。而念珠菌引起的IFD的总发病率达0.03%~0.50%，病死率可达35%~80%[1]，白念珠菌（Candida albicans）是侵袭性真菌感染中最常见的致病真菌，约占40.1%[2]。尽管目前已研发出有效的抗真菌药物可供临床治疗，但仍存在着耐药性、价格昂贵、毒性大等问题亟需解决[3]。随着抗真菌药物经年累月使用，耐药性问题越发突出。唑类药物是临床常用的抗真菌药物，疗效好、毒性低，但因应用历史较长，临床上对其耐药的真菌越来越多[4]。目前，临床可选择的药物数量有限，解决真菌对药物的耐药性问题便成为一个必须攻克的难关。联合用药是一种有效的克服药物耐药性的方法，两者的协同作用不仅可以克服药物的耐药性，还可以增强原有药物的抗真菌作用[4]。
去甲泽拉木醛（DMZ）是从雷公藤根皮中提取的三萜类单体化合物，是雷公藤中含量较高的单体成分，其分子式是C29H36O6（图1）。DMZ具有抗炎、抗癌、免疫调节、抗生育、雌激素代谢调节等药理活性[5]，但其在抗真菌方面的研究尚未见报道。本研究发现，DMZ具有良好的广谱抗真菌活性，并且与氟康唑联合使用具有协同抗耐药真菌作用。
图 1 DMZ的化学结构
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白念珠菌实验株SC5314来自美国Georgetown大学。白念珠菌（C. albicans）临床株103、7879、9161、10066、9296、10060、10061、7654、901、904、632，耳念珠菌（Candida auris）0029，克柔念珠菌（Candida krusei）62588、4996、10153，热带念珠菌（Candida tropicalis）8915、409，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）7544，近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）22019、90018，须毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）T5a、T5b由海军军医大学第二附属医院提供。小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
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DMZ购自陶术生物有限公司；氟康唑（FLC）购自Macklin公司；二甲基亚砜（DMSO）购自国药集团化学试剂有限公司。
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YPD培养液：酵母浸膏10.0 g，蛋白胨20.0 g。D-葡萄糖20.0 g，加超纯水800 ml溶解，再以超纯水定容至1 000 ml，经高压蒸汽灭菌（121°C，15 min），自然冷却至室温后于4°C保存备用。
PBS缓冲溶液：NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 3.57 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.24 g，用三蒸水溶解并定容至1 000 ml，高温高压灭菌（121°C，15 min）后室温保存。
RPMI 1640培养基：RPMI 1640（Gibco BRL） 10.0 g，NaHCO3 2.0 g，3-吗啉丙磺酸（MOPS）34.5 g，NaOH 2.7 g，以超纯水定容至1 000 ml，经0.22 μm微孔滤膜抽滤灭菌后于4°C保存备用。
含药SDA培养基：蛋白胨10 g，D-葡萄糖40 g，琼脂20 g，加超纯水800 ml溶解，调整PH为7.0，以超纯水定容至1 000 ml，高压蒸汽灭菌（121 ℃，15 min）。待冷却至50～55 ℃，将适当药物溶液加入液体状态的SDA培养液中，混合均匀，分倒入9 mm细菌培养皿中，自然冷却凝固后于4 ℃保存备用。
DMEM完全培养基：45 ml DMEM高糖培养基中加入5 ml小牛血清，充分混匀后置于4 ℃保存。
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生物安全柜（BSC-1004II A2，苏州安泰空气技术有限公司）；生物显微镜（LW100T，北京测维光电技术有限公司）；霉菌培养箱（MJ-150-I，上海一恒科学仪器有限公司）；酶标仪（Thermo Multiskan FC，赛默飞世尔上海仪器有限公司）。
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于−80°C低温保存箱中取出冻存的待测菌株，吸取10 μl菌液加入装有1 ml YPD培养液的15 ml玻璃摇菌管中，置于30°C气浴恒温振荡培养箱中，200 r/min振荡培养。24 h后从YPD菌悬液中吸取10 μl加入到新的1 ml YPD培养液中，继续30°C振荡培养16 h，活化完成，此时的真菌即处于指数生长末期。
取处于指数生长末期的待测菌株置于1.5 ml离心管中，离心（3 000 r/min，1 min），吸弃上清液，用1 ml PBS缓冲溶液洗涤菌株，离心（3 000 r/min，1 min），吸弃上清液，重复洗涤3次。取10 μl真菌原液稀释100倍后，使用血细胞计数板于生物显微镜下计数，计算出真菌原液的菌浓度，然后用RPMI1640培养液稀释配制成实验所需浓度的菌悬液。
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根据CLSI出版的微量液基稀释法实验手册M27-A3所推荐的标准实验方法来测定[6]。取处于指数生长末期的待测菌株，用RPMI 1640培养基稀释配置成1×103 CFU/ml的菌悬液。取96孔细胞培养板，于第1列加入100 μl RPMI 1640培养基作为空白对照；第2列加入200 μl菌液，3~12列加入100 μl菌液，于第2列每孔分别加入6.4 μl药液，依次2倍倍比稀释至11列，最高药物浓度为64 g/L，12号孔菌液作为生长对照。96孔板置于30°C恒温培养箱中静置培养（白念珠菌24 h，烟曲霉48 h），之后用酶标仪测定630 nm处A值。与生长对照孔比较，抑制80%以上真菌生长对应的最低药物浓度即为MIC80。实验至少重复3次，取较为稳定的结果作为最终的测定结果。
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取处于指数生长末期的待测菌株，用RPMI 1640培养基稀释配置成1×103 CFU/ml的菌悬液。将配制好的菌悬液涡旋均匀后，转移至6孔细胞培养板中，第1孔加入2.6 ml，第2~6孔每孔加入1.3 ml。取83.2 μl待测化合物溶液加入第1孔中使其终浓度为64 g/L，依次进行倍半稀释，使得第1~6孔中的化合物终浓度分别为64、32、16、8、4、2 g/L。将在6孔细胞培养板中配制好的含药菌悬液按化合物浓度从高到低（64→2 g/L）依次对应转移至96孔细胞培养板的A~F行中，第1列每孔加入200 μl，第2~10列每孔加入100 μl。第11列的A11~F11孔和第G行的G1~G10孔中加入未加药的空白菌悬液100 μl/孔。将配制好的FLC溶液分别加入第1列的A1~G1孔中，每孔加入6.4 μl使其终浓度为64 g/L。各列从左到右依次进行倍半稀释，使得第1~9列的FLC终浓度分别为64→0.25 g/L。96孔细胞培养板第11列的A11~F11孔中为未加任何药物作用的菌悬液，作为阴性对照组。第12列和H行各孔中分别加入100 μl的RPMI 1640培养液，作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于30°C恒温培养箱中静置培养，48 h后使用酶标仪测定每孔真菌在630 nm处的光密度值A630。以阴性对照组的A630值为100%，利用公式计算协同指数FICI。FICI的计算公式为：FICI=MIC80 化合物（联用）/MIC80 化合物（单用）+MIC80 FLC（联用）/MIC80 FLC（单用）
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取己洗涤的待测真菌，用PBS缓冲溶液稀释配制成实验所需浓度（1x106 CFU/ml）的菌悬液，吸取100 μl均匀涂布于含药的SDA培养基中（考察协同作用时培养基中应加入适宜浓度的DMZ）。在培养基中等距放置7枚灭菌纸片，向纸片中滴加药液，使纸片载药量分别为0、2、4、8、16、32 μg（载药量视实验情况而定），置于30°C恒温培养箱中静置培养48 h，观察真菌生长情况并拍照记录[7]。
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取小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3），胰酶消化后，离心收集细胞并用DMEM完全培养基重悬。血细胞计数板计数后调整细胞密度至5x104个/ml。取96孔板划分出实验区、对照区、无细胞区。实验区、对照区每孔加入100 μl细胞液，无细胞区加100 μl DMEM完全培养基，注意尽量使孔内细胞分布均匀。细胞于37°C培养箱中贴壁过夜。第2天，取无菌EP管，用DMEM完全培养基对待测药物进行倍比稀释，随后取出96孔板，吸弃培养基。每孔加100 μl含不同浓度药物的DMEM完全培养基，37°C继续孵育24 h。取出96孔板，吸弃培养基，每孔加110 μl含CCK-8的DMEM完全培养基（CCK-8∶DMEM完全培养基=1∶10），37°C孵育2 h。测量各孔的A450。处理结果时用实验区、对照区A值减去无细胞区的A值，以对照区细胞活力为1.0，计算各组细胞活力。重复3次实验，用GraphPad作图并统计分析。
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测定DMZ对临床中常见的病原真菌的抗菌活性，共计23株。实验结果显示，DMZ对所试真菌都有一定的抑制效果（表1）。对白念珠菌（含11株临床株）的MIC范围为4~16 g/L，值得注意的是，其中有3株临床菌对FLC显示出较强的耐药性（901、904、632），DMZ对它们的MIC稳定在8 g/L，表现出与敏感菌类似的抗菌活性。对FLC天然耐药的耳念珠菌与克柔念珠菌，DMZ也表现出较好的抗真菌活性，MIC分别为32 g/L、2~8 g/L。对其他的念珠菌如热带念珠菌、近平滑念珠菌也有较强的抗菌活性，MIC为4~16 g/L，对丝状菌如烟曲霉菌、须毛癣菌有较好的抗菌活性，MIC分别为32 g/L和2 g/L。以上结果表明，DMZ对常见的病原真菌均表现出较好的抗菌活性，抗菌谱较广。
表 1 DMZ与FLC单独应用于23株真菌的MIC值
菌种 菌株 MIC80（g/L） FLC DMZ 白念珠菌 FLC敏感菌株 SC5314 0.25 8 7654 0.25 4 103 2 16 9161 0.25 4 10066 2 8 10060 0.25 4 10061 0.25 4 7879 1 8 9296 0.25 8 FLC耐药菌株 901 64 8 904 64 8 632 64 8 耳念珠菌 0029 64 32 热带念珠菌 8915 16 8 409 1 16 烟曲霉 7544 64 32 近平滑念珠菌 22019 2 4 90018 1 8 克柔念珠菌 4996 16 8 62588 16 8 10153 32 2 须毛癣菌 T5b 32 2 T5a 32 2 -
选取3株对FLC耐药的白念珠菌901、904和632，采用棋盘微量液基稀释法考察DMZ与FLC联合使用是否存在协同作用。结果显示，在与2 g/L DMZ联合使用的情况下，FLC对上述3株耐药菌的有效浓度从64 g/L降低至0.25 g/L（表2），是原抗菌浓度的1/256，两药联合使用的FICI为0.129~0.254，表明DMZ与FLC具有较强的协同抗耐药菌作用。
表 2 DMZ与FLC的协同抗氟康唑耐药白念珠菌的作用
菌株 MIC80（g/L） 协同指数 单用FLC 单用DMZ 联用FLC 联用DMZ 901 64 8 0.25 2 0.129 904 64 16 0.25 2 0.254 632 64 8 0.25 2 0.254 应用琼脂平板扩散实验更直观地验证了DMZ与FLC的协同抗真菌作用。结果显示，在单用DMZ的情况下，不同浓度的DMZ均产生了明显的抑菌圈，但抑菌圈直径的大小并没有显示出剂量依赖性；单用FLC能产生较大的抑菌圈，但抑菌作用较弱，抑菌圈内部仍有少量真菌菌落生长（图2A）。进一步用抑菌圈实验验证两药联用对耐药菌的抗真菌效果。结果显示，在含有一定浓度DMZ的琼脂中，真菌长得稀薄，DMZ的浓度越高，真菌长得越稀薄，表现出剂量依赖性。在含有不同浓度FLC的纸片周围都出现了直径较大的抑菌圈（图2B），抑菌圈的大小与FLC的含量呈现出明显的剂量依赖关系。上述实验结果表明，DMZ与FLC联合使用具有协同抗耐药菌的作用。
图 2 单用DMZ对白念珠菌SC5314的抑菌作用以及DMZ与FLC联用对耐药菌904的抑菌作用
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利用CCK-8法考察DMZ对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性。CCK-8试剂中含有WST-8，在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此，可利用这一特性考察DMZ对哺乳动物细胞的毒性。结果显示，当DMZ浓度为32 g/L时，小鼠胚胎成纤维细胞的存活率下降到54%，显示出一定毒性，而低于32 g/L时DMZ的毒性较低，没有表现出显著的细胞毒作用（图3）。实验结果通过单因素方差分析（ANOVA），然后进行事后Dunnett-t检验，标准偏差基于3次独立实验。
图 3 DMZ对小鼠成纤维细胞的细胞毒性
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中药作为我国传统药物，在抗真菌病方面有极佳的待研发前景，从中草药中提取出疗效佳、毒副作用小、不易耐药、价格低廉的新型抗真菌药物已成为目前的研究热点[8]。DMZ是从雷公藤树皮中分离提取的酚性去甲基三萜化合物，是雷公藤中含量较高的单体，是一种结构明确、易分离的天然产物[9]。本研究考察了DMZ的抗真菌作用和协同FLC抗真菌的作用。
IFD每年的发病率为每6万人中约有100例[10]。侵袭性念珠菌感染（IC）在IFD中占主要地位，约有80%的IFD是IC引起的[11]。其中，白念珠菌是导致IC的最主要的念珠菌种类[12]，但近年来，其他念珠菌的占比在逐渐升高[13]。DMZ的抗菌谱很广，对常见的念珠菌如白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌等均有较好的抗菌活性，MIC在2~16 g/L，对其他IFD中常见的病原菌如烟曲霉菌也有很好的抗菌活性。耳念珠菌是近年来新兴的一种念珠菌，因其多重耐药性而受到关注，又被称为“超级真菌”，不到10年的时间里已在全球范围内传播，且发病率、病死率高[14]。有研究表明[15]，耳念珠菌中有高达90%的分离株对氟康唑产生耐药。DMZ对耳念珠菌也有一定的抗菌活性（MIC值为32 g/L），为研发抗耳念珠菌的药物提供了新的选择。
FLC是一种典型的唑类抗真菌药物，已在临床上使用近30年。鉴于FLC的抗真菌作用强且安全性高，长期以来都是一线抗真菌药物。然而，唑类药物的广泛使用导致了真菌对其有严重的耐药性，从而降低了治疗效果。其耐药机制主要包括：药物靶点的突变、甾醇生物合成途径的变化以及转录因子的功能突变导致麦角甾醇生物合成基因和多药外排泵的组成性上调等[16]。DMZ对氟康唑耐药的念珠菌有类似于敏感菌的抗菌活性，这表明DMZ的抗菌作用机制可能与FLC不同，有潜力用于抗耐药真菌。已有研究报道，DMZ通过激活外源性细胞凋亡在体外抑制癌细胞的细胞生长，并降低了癌细胞中的线粒体膜电位[17]，这将为DMZ的抗真菌机制提供研究方向。
药物联合使用是应对耐药菌的一种常用策略。DMZ与FLC具有较强的协同抗菌效果，能有效抑制耐药菌的生长。两药联用可以将FLC的有效浓度降低数百倍，DMZ的疗效也增加数倍。细胞毒性实验结果表明，DMZ在抗真菌作用浓度范围时（特别是与FLC联合使用时），毒性相对较低。两药联合使用时，DMZ起效浓度仅有细胞毒浓度的几十分之一。在增加药物疗效的同时，降低了药物用量，从而减少了毒副作用。另外，DMZ与FLC作为两种不同作用机制的抗真菌药物联合使用，还能起到预防真菌耐药的作用。总之，DMZ作为一种广谱、高效的抗真菌天然产物，具有较强的与FLC协同抗真菌能力，有潜力成为抗真菌候选先导化合物。同时，还有潜力成为一种增效剂，与FLC联合使用应对耐药真菌。
Study on antifungal effect of demethylzelamaldehyde in vitro
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摘要:
目的 研究去甲泽拉木醛的体外抗真菌作用。 方法 采用微量液基稀释法测定去甲泽拉木醛与氟康唑单独应用于23株真菌的最低抑菌浓度（MIC），以棋盘式微量液基稀释法测定两药联合抗耐药白念珠菌的协同指数（FICI），判断两药联合抗菌效果；并通过纸片扩散实验直观验证两药联合的协同作用。最后通过CCK-8法测定去甲泽拉木醛的细胞毒性。 结果 去甲泽拉木醛单用时呈现广谱的抗真菌作用，MIC范围为4~32 g/L。两药联用时，可将氟康唑的有效浓度从大于64 g/L降至0.25 g/L，FICI值介于0.129~0.254之间，两药表现出协同抗耐药白念珠菌作用。CCK-8结果显示，去甲泽拉木醛在高于MIC值4倍浓度下才展示出细胞毒性。 结论 去甲泽拉木醛表现出较好的抗真菌作用，与氟康唑联合时有很好的协同效果，且毒性较低。 Abstract:Objective To study the antifungal effect of demethylzelamaldehyde in vitro. Methods The minimum inhibitory concentrations （MIC） of demethylzeylasteral and fluconazole against 23 fungal strains were determined by micro liquid dilution method. The synergistic index （FICI） of the two drugs was determined using a checkerboard micro liquid dilution method. The synergistic effect of the combination of the two drugs was visually verified by paper diffusion experiments. Finally, the cytotoxicity of demethylzelamaldehyde was determined by CCK-8 method. Results Demethylzelamaldehyde showed a broad spectrum of antifungal activity when used alone, with MICs ranging from 4 g/L to 32 g/L. When combined with fluconazole, the effective concentration of fluconazole could be reduced from over 64 g/L to 0.25 g/L, with FICI values ranging from 0.129 to 0.254, indicating the synergistic effect of the two drugs. The CCK-8 results showed that demethylzeylasteral exhibited cytotoxicity only at concentrations four times higher than the MIC value. Conclusion Demethylzelamaldehyde exhibited good antifungal effect and synergistic effect with fluconazole, and its toxicity was low. -
Key words:
- Candida albicans /
- demethylzeylasteral /
- fluconazole /
- synergistic effects /
- drug resistance
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阿弗他溃疡(RAU)又称为复发性口腔溃疡，其发病率高，约占口腔黏膜病的20%[1]，发病人群主要是青壮年，女性居多，春、冬季发病率较高[2]。表现为口腔黏膜反复发作的溃疡，呈假膜覆盖的凹陷面，中间为白色炎症，边缘红肿。目前病因病机尚不明确[3]，被广泛接受的诱发因素有气候环境、食物营养、心理精神和免疫因素等[4]，研究发现口腔溃疡的发病可能与口腔微生物密切相关[5]，可通过纠正口腔菌群平衡达到加速愈合、控制炎症、抑制复发。经过前期研究，选用硫酸新霉素，针对口腔菌群中异常增多的G−菌；克霉唑对引起口腔黏膜疾病的白念珠菌针对性强；选用不发生双硫仑反应的奥硝唑作为抗厌氧菌药物；达克罗宁作为局麻药，黏膜穿透性强，局麻时间长；采用冰片作为创口收敛剂，兼具抗炎、消肿、改善气味的功能；甘草次酸作为抗炎剂，与糖皮质激素相比长期使用副作用较低。以上6种成分之间无配伍禁忌，其中硫酸新霉素和克霉唑口服均不吸收，安全性高[4]。采用物理凝聚法分散水不溶性成分，通过溶剂浇铸法制备膜剂[6-9]。本课题采用层次分析法结合单因素考察对不同成膜材料的黏附时间、溶蚀时间等9项考察指标综合评分，优选出最合适的成膜材料；采用层次分析与正交试验相结合，优选成膜材料的最佳配比，兼顾使用舒适性和生产适用性的同时，重点筛选出黏附性好且缓释时间较长的成膜材料配比。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
AE240精密电子天平（瑞士METTLER公司）；磁力搅拌器（宁波市鄞州群安实验仪器有限公司）；托盘天平（福州天平仪器厂）；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；OS2O-Pro型搅拌器（北京大龙试验仪器有限公司）；拉力测试仪（和晟仪器科技有限公司）；游标卡尺（上海台海工量具有限公司）。
1.2 材料
聚乙烯醇1788（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20170318）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180412）；海藻酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20190810）；羟丙基纤维素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20170415）；羟丙甲基纤维素钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20170318）；明胶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20180517）；水胶体敷料（康维德医疗用品有限公司，批号：9F04020）。硫酸新霉素（南京都莱生物技术有限公司，批号：20180312）；克霉唑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20170518）；奥硝唑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20180522）；盐酸达克罗宁（苏州裕元生物科技有限公司，批号：20170215）；甘草次酸（天津希恩思生化科技有限公司）；冰片（亳州寿言斋健康科技有限公司，批号：20191021）。
2. 方法与结果
2.1 成膜材料单因素考察
取聚乙烯醇1788（PVA-1788）、羟丙基纤维素（HPC）、羟丙甲基纤维素（HPMC）、甲基纤维素（MC）、海藻酸钠（SA）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、明胶（GEL）各3 g置于60 ml水中搅拌1 h，然后加热至60 ℃，搅拌至完全溶解得成膜材料凝胶，采用溶剂浇铸法铺展于培养皿中，置60 ℃烘箱烘干。从外观、拉伸性能、厚度、成膜时间、脱模效果、溶胀系数、溶蚀时间、黏附力和黏附时间9个方面进行评价。
2.1.1 外观评价
膜剂成品外观评价标准：①气泡：无气泡得5分；少量气泡，易除去，得4分；少量气泡，经1 h静置可除去，得3分；需大于1 h静置、抽真空、离心等方法才能将气泡除去，得2分；采用各种方法处理后膜剂中仍存在大量气泡得1分；气泡较多，干燥后无法成完整膜剂得0分。②颜色：无色透明得5分；半透明得4分；半透明且带有黄色或其他较浅颜色得3分；半透明且有絮状、颗粒状纹路得2分；呈不透明颜色，且有絮状、颗粒状纹路得1分；外观颜色较深、纹理较多、不透明得0分。③柔软度：柔软、不卷曲得5分；柔软稍有卷曲得4分；反向卷曲后缓慢恢复原来形状得3分；膜较硬，卷曲后快速恢复原来形状得2分；卷曲可能碎裂，得1分；硬度较大无法制得膜剂得0分。从表1和图1可知，PVA-1788和HPC颜色透明，气泡较少，柔软度较好，外观较其他材料好。
表 1 成膜材料的外观评价成膜材料 气泡 颜色 柔软度 总评分
（分）性状 评分
（分）性状 评分
（分）性状 评分
（分）PVA-1788 无 5 透明 5 很柔软 5 15 HPC 无 5 透明 5 很柔软 5 15 HPMC 无 5 透明 5 厚、硬 2 12 MC 大量 2 白色 4 较硬 3 9 SA 少量 4 黄色 2 厚、硬 2 8 CMC-Na 少量 4 白色 5 很柔软 5 14 GEL 无 5 淡黄色 4 厚、硬 2 11 注：PVA-1788：聚乙烯醇1788；HPC：羟丙基纤维素；HPMC：羟丙甲基纤维素；MC：甲基纤维素；SA：海藻酸钠；CMC-Na：羧甲基纤维素钠；GEL：明胶 2.1.2 膜剂拉伸性能的考察
取各实验组膜剂1片（2 cm×1 cm），利用拉力测试仪测量各实验组膜剂的拉伸长度与断点力，通过拉伸长度/断点力的比值判断拉伸性能，数值越大，可拉伸距离越大，膜剂拉断所需力相对越小，与口腔黏膜贴敷时顺应性越高。以拉伸长度/断点力比值的最大值作为100%，采用归一化法对其他各组进行评价，各实验组测定3次求平均值。结果见表2，PVA-1788的拉伸性能明显优于其他材料。
表 2 成膜材料的拉伸性能评价成膜材料 拉伸长度
（l/mm）断点力
（f/kg）拉伸长度/
断点力评分
（分）PVA-1788 24.24 2.137 11.34 100 HPC 4.935 1.644 3.002 26.47 HPMC 0.925 4.063 0.227 0.020 MC 2.180 7.443 0.293 0.026 SA 2.638 4.566 0.578 0.051 CMC-Na 2.611 7.772 0.336 0.030 GEL 0.436 2.056 0.212 0.019 2.1.3 膜剂厚度测定
分别从各实验组中选取10片膜剂，用游标卡尺测量总厚度，计算每片膜剂的平均厚度，取平均厚度的倒数，以最大值作为100%，用归一化法对其他各实验组膜剂进行评分。由表3可知，制备的膜剂中，HPC厚度最薄，MC最厚，其余各组差异较小，膜剂越薄口腔黏膜舒适性越好。
表 3 各试验组成膜材料的厚度、成膜时间和脱膜效果成膜材料 膜剂厚度 成膜时间 脱膜效果 测定值
（l/mm）评分
（分）时间
（t/min）评分
（分）面积
（s/cm2）评分
（分）PVA-1788 0.13 76.92 240 60.0 54.0 100 HPC 0.10 100.00 330 42.9 43.2 80 HPMC 0.11 90.91 143 100.0 54.0 100 MC 0.15 66.67 258 55.7 54.0 100 SA 0.11 90.91 195 72.9 54.0 100 CMC-Na 0.12 83.33 255 55.7 54.0 100 GEL 0.12 83.33 238 60.0 27.0 50 2.1.4 成膜时间考察
对各实验组的成膜时间进行测定，取成膜时间的倒数，以倒数的最大值为100%，用归一化法对其他成膜材料进行评分，成膜时间短，有利于提高生产效率，结果见表3。
2.1.5 脱膜效果考察
以剥离最大面积的膜的面积占培养皿（半径4.3 cm）的百分比作为评判标准，以完全脱模为100%。结果见表3，PVA-1788、HPMC、MC、SA、CMC-Na可以直接撕取完整膜剂，脱模较容易。
2.1.6 溶胀试验
称取0.4 g氯化钠、0.795 g氯化钙、0.4 g氯化钾、1.0 g尿素、0.78 g磷酸钠、0.005 g硫化钠，加热水400 ml溶解，放冷后转移至1000 ml容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，用氢氧化钠调节pH至6.8，即得人工唾液。取各试验组膜剂1片（1 cm×1 cm），称量记为m，将膜剂放入培养皿中称重记为W0。将膜剂润湿黏附于培养皿中，加入人工唾液[10-11]，分别在10、30、60、120、240 min时，倒去人工唾液，称量培养皿加膜剂的质量Wi。计算公式如下：溶胀系数=（Wi−W0）/m×100%；每组平行3次，求各时间点溶胀系数的平均值，以各组溶胀系数最大的值作为100%，用归一化法对其他各组进行评分。由表4中结果可知，CMC-Na溶胀系数最大。
表 4 成膜材料的溶胀系数成膜材料 溶胀系数（%） 评分
（分）10 min 30 min 60 min 120 min 240 min 480 min PVA-1788 396 429 549* 312 0 — 18.35 HPC 731 936* 806 447 0 — 31.28 HPMC 641 1028* 579 10 0 — 34.36 MC 811 884 1170 1456* 1660 1528 55.48 SA 1489 2468* 2232 283 0 — 82.49 CMC-Na 1023 1670 2262 2849 2992* 2357 100 GEL 622 548 553 759* 627 0 25.37 注：*表示各试验组最大溶胀系数，—表示溶蚀殆尽，实验终止。 2.1.7 溶蚀试验
取1片膜剂（1 cm×1 cm）称重记为m，称取2 ml EP管称重记为n。将膜剂润湿黏贴在EP管下缘。在EP管中加入2 ml人工唾液，在37 ℃恒温振荡器中以100 r/min振荡10 min，倒出液体，称重记为W0，然后重新加入2 ml纯化水并恒温振荡20 min，如此重复10次，于各时间点倒出管内液体后称重，依次记为Wi。以相邻时间点重量差异计算溶蚀速率，公式如下：溶蚀速率=[(Wi−Wi−1)/20(W0−m−n)]×100%。以各组溶蚀时间最大值作为100%，用归一化法对其他各组进行评分。结果见表5，MC溶蚀时间较长，在200 min内未出现明显溶蚀减重，溶蚀系数出现负数是由于溶胀增重略大于溶蚀损失，这将阻碍药效成分随着膜剂溶蚀的释放。CMC-Na溶蚀速率较小，其溶蚀时间可长达180 min，缓释性能显著优于其他成膜材料，较适合制备缓释膜剂。
表 5 成膜材料的溶蚀系数成膜材料 连续时间点的平均溶蚀百分率（%） 溶蚀时间
（t/min）每分钟溶
蚀速率（%）评分
（分）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PVA-1788 24.62 36.92 20.00 18.46 0.00 — — — — — 80 1.25 40 HPC 37.50 24.04 38.46 0.00 — — — — — — 60 1.67 30 HPMC 54.55 45.45 0.00 — — — — — — — 40 2.5 20 MC 0.00 −12.26 0.94 −6.60 −2.83 0.00 −3.77 6.60 −3.77 7.55 200 −0.07 100 SA 49.07 50.93 0.00 — — — — — — — 40 2.5 20 CMC-Na −17.71 −2.21 4.79 15.46 26.19 37.14 20.88 14.20 1.26 0.00 180 0.56 90 GEL 100.0 0.00 — — — — — — — — 20 5.0 10 注：“—”代表溶蚀殆尽，实验终止。 2.1.8 黏附力考察
黏附膜剂黏附力测定[10]：取两块同样大小的橡皮，分别固定于天平托盘上及玻璃板下方，调节高度和重量使上下橡皮相互接触时天平平衡。取膜剂（1 cm×1 cm）预先用人工唾液润湿，黏于下橡皮表面，将上橡皮与膜剂接触，天平空托盘加50 g砝码使上下橡皮自然按压膜剂90 s，移去50 g砝码，在下橡皮固定的托盘里依次加入重量逐渐增加的砝码，以5 s内上、下橡皮分离为标准，所加砝码的重量即为黏附力。将各组黏附力最大值作为100%，用归一化法对其他各组进行评分。由表6可知，MC的黏附力最好，其次是PVA-1788。
表 6 成膜材料的黏附时间成膜材料 黏附力 黏附时间 称重
（m/g）评分
（分）时间
（t/min）评分
（分）PVA-1788 121 88.97 100 100 HPC 100 73.53 60 60 HPMC 40 29.41 50 50 MC 136 100 85 85 SA 119 87.5 80 80 CMC-Na 90 66.18 38 38 GEL 6.7 0.05 5 5 2.1.9 黏附时间考察
取水胶体敷料（2 cm×2 cm）粘贴于500 ml烧杯内侧，用人工唾液润湿膜剂（1 cm×1 cm），将膜剂按压在水胶体敷料上约20 s，在膜剂表面覆盖一层1 cm×1 cm薄塑料膜用以降低溶蚀对黏附时间的干扰，在烧杯中加入人工唾液，液面没过膜剂。在恒温37 ℃，150 r/min搅拌，于300 min内监测黏附时间[12],各组试验组取3片计算平均值。将各组黏附时间的最大值作为100%，用归一化法对其他各组进行评分。由表6可知，PVA-1788的黏附时间最长，可达100 min。
2.2 采用单因素考察结合层次分析法对成膜材料进行综合评价
2.2.1 根据膜剂考察指标之间的关系建立两两比较优先矩阵
根据“2.1”项下9个考察指标对缓释膜剂的贡献度，设计两两比较矩阵，见表7。
表 7 各目标按照两两比较重要程度建立指标层矩阵指标 外观 厚度 拉伸
性能脱模
效果成膜
时间黏附
时间黏附
力溶胀
系数溶蚀
速度外观 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.33 0.25 厚度 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.33 0.25 拉伸性能 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.33 0.25 脱模效果 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.33 0.25 成膜时间 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.33 0.25 黏附时间 2 2 2 2 2 1 1 0.5 0.5 黏附力 2 2 2 2 2 1 1 0.5 0.5 溶胀系数 3 3 3 3 3 2 2 1 1 溶蚀速度 4 4 4 4 4 2 2 1 1 2.2.2 层次分析法（AHP）各考察指标权重系数的计算
根据各指标对比的优先矩阵（表3）及公式（1）计算初始权重系数Wi′：
$$ \mathrm{W}_{t}'=\sqrt{\mathrm{a}_{1} \times \mathrm{a}_{2} \times \mathrm{a}_{3} \cdots \mathrm{a}_{m}} \text{} $$ (1) 式中m为受检验层次目标数，a1~am为矩阵两两比较的评分，经计算各指标成分初始权重系数分别为：W1′=0.65042、W2′=0.65042、W3′=0.65042、W4′=0.65042、W5′=0.65042、W6′=1.25992、W7′=1.25992、W8′=2.14765、W9′=2.51984。
按照公式（2）计算归一化权重系数Wi，
$${\rm{W}}_i= \displaystyle\frac{{\rm{W}}_i'}{\sum\limits_{j=1}^{m}}{{\rm{W}}_i'}$$ (2) 得各指标成分权重系数W1=0.06230、W2=0.06230、W3=0.06230、W4=0.06230、W5=0.06230、W6=0.12069、W7=0.12069、W8=0.20572、W9=0.24138。
2.2.3 一致性检验
CR为随机一致性比率，定义CR=CI/RI作为衡量所得权重系数是否合理的指标，一致性指标CI=（λmax−m）/（m−1），式中m为次级目标数，矩阵的最大特征根
$\lambda_{m=x}=1 / m {\sum\limits_{j=1}^{m}}\left[{\sum\limits_{j=1}^{m}}\left(a_{j j} \times W_{j}\right)+W_{j}\right]$ ，当矩阵阶数=9时，平均随机一致性指标RI=1.45。经计算λmax=9.0153；则CI=（λmax−m）/（m−1）=0.00192；CR=CI/RI=0.00192/1.45=0.00132；CR<0.1则表明9项指标优先比较矩阵满足一致性要求，故所得权重系数有效，结果具有一致性。2.2.4 考察指标综合评价
根据单因素考察所得出的评分（表1~6），结合层次分析法权重系数，对成膜材料性能进行综合评分，其中，CMC-Na和PVA-1788综合评分最高，分别为87.45和64.49。详见表8。
表 8 成膜材料综合评分结果成膜材料 外观 厚度 拉伸性能 成膜时间 脱模效果 黏附时间 黏附力 溶胀系数 溶蚀速度 评分
（分）PVA-1788 6.23 4.79 6.23 3.70 6.23 12.10 10.74 3.77 10.73 64.49 HPC 6.23 6.23 1.65 2.69 4.98 7.24 8.87 6.44 8.05 52.38 HPMC 4.98 5.66 0.125 6.23 6.23 5.98 3.55 7.07 5.36 45.19 MC 3.74 4.15 0.161 3.45 6.23 9.20 10.56 11.42 0.00 48.90 SA 3.32 5.66 0.317 4.55 6.23 4.37 7.99 16.97 5.36 54.78 CMC-Na 5.82 5.19 0.185 3.48 6.23 9.77 12.07 20.57 24.14 87.45 GEL 4.57 5.19 0.117 3.74 3.12 0.57 0.595 5.222 2.68 25.80 通过单因素考察各种成膜材料，筛选出CMC-Na和PVA-1788，两种膜剂基质各有优点。CMC-Na溶胀系数大、溶蚀时间长，可改善其他基质较快溶解的缺点。PVA-1788黏附力大、黏附时间长，是良好的黏附性材料，可改善膜剂外观和柔软度，提高成膜效率和成品率。
2.3 缓释膜剂制备工艺的研究
采用物理凝聚法结合溶剂浇铸法设计膜剂制备工艺如下：取1.56 g的PVA-1788加入12.5 ml水，以300 r/min搅拌30 min，后加热至60 ℃搅拌至完全溶解，得PVA-1788凝胶。取4.68 g的CMC-Na加入117 ml水，以800 r/min在45 ℃下搅拌至完全溶解，得CMC-Na凝胶。将两种凝胶搅拌混合均匀，作为溶液①；分别取硫酸新霉素、盐酸达克罗宁、甘草次酸，分别加入40 ml水溶解，作为溶液②；取克霉唑、奥硝唑与冰片加入30 ml无水乙醇搅拌至溶解，作为溶液③；将溶液②、③缓慢加入45 ℃溶液①中，边加边以1 000 r/min搅拌，得质地均匀的含药混悬凝胶，静置消泡。
取凝胶16 g，浇铸铺展于半径为4.3 cm的培养皿中。取一份立即放置于烘箱中60 ℃干燥5 h；另取一份凝胶放置4 ℃冰箱12 h后转移至烘箱中60 ℃干燥5 h。待完全干燥后，将膜剂分割成2 cm×1 cm 小片，即得口腔膜剂，结果见图2。物理凝聚法制备的凝胶趁热烘干制得膜剂表面为乳白色不透明，颜色均匀。而物理凝聚法制备的凝胶经低温放置12 h制得膜剂烘干后可看到颗粒较小的沉淀，说明在低温下放置时间过长可能形成较大结晶，影响膜剂质量，趁热烘干可抑制水不溶性药物的析出。
2.4 成膜材料配比的正交试验
2.4.1 正交试验设计
在筛选出CMC-Na和PVA-1788作为成膜材料的基础上配伍一定比例甘油作为增塑剂，可提高膜剂的柔软度和脱膜效果，用量为成膜材料质量的0.5%~2%。按“2.3”方法制备膜剂进行正交试验，正交试验因素水平表见表9。
表 9 正交试验因素水平表水平 A因素PVA-1788
用量（m/g）B因素CMC-Na
用量（m/g）C因素甘油
用量（%）1 1 1 0.5 2 2 2 1 3 3 3 2 2.4.2 正交试验结果
以外观、厚度、拉伸性能、脱膜效果、成膜时间、溶胀系数、溶蚀速率、黏附时间、黏附力9个方面为评价指标，按照单因素考察的试验方法，结合“2.2.2”项下层次分析法各考察指标的权重系数计算综合评分（表10），通过方差分析（表11）和直观分析（表12）优选膜剂成膜材料的最佳比例。
表 10 正交试验综合评分结果组别 外观 厚度 拉伸性能 成膜时间 脱模效果 黏附时间 黏附力 溶胀系数 溶蚀速度 综合评分
（分）1 5.40 6.23 1.58 5.19 4.36 12.07 9.06 12.45 17.24 73.58 2 5.40 6.23 3.50 5.19 3.74 12.07 10.56 14.92 17.24 78.85 3 4.98 6.23 2.63 5.56 3.74 4.83 11.31 20.57 24.14 83.99 4 5.82 6.23 6.23 5.99 3.12 3.22 8.30 7.77 20.69 67.37 5 5.40 6.23 2.44 4.58 6.23 12.07 8.30 11.48 24.14 80.87 6 4.15 5.19 0.67 5.66 3.74 12.07 12.07 16.05 20.69 80.29 7 5.82 6.23 4.36 5.77 6.23 12.07 6.03 7.46 20.69 74.66 8 6.23 5.19 0.58 5.37 4.98 12.07 9.05 9.99 20.69 74.16 9 5.39 6.23 0.96 6.23 4.36 12.07 5.28 9.95 24.14 74.61 表 11 正交试验综合评分方差分析因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 P PVA-1788用量（m/g） 0.003 2 3.000 19.000 >0.05 CMC-Na用量（m/g） 0.009 2 9.000 19.000 >0.05 甘油用量（%） 0.006 2 6.000 19.000 >0.05 误差 0.00 2 表 12 正交试验综合评分直观分析序号 A因素PVA-
1788用量（m/g）B因素CMC-Na
用量（m/g）C因素甘油
用量（%）综合评分
（分）1 1 1 1 73.58 2 1 2 2 78.85 3 1 3 3 83.99 4 2 1 2 67.37 5 2 2 3 80.87 6 2 3 1 80.29 7 3 1 3 74.66 8 3 2 1 74.159 9 3 3 2 74.61 K1 0.850* 0.781 0.816 K2 0.821 0.838 0.798 K3 0.804 0.855* 0.861* R 0.046 0.074 0.063 注：*表示各因素最优水平条件 从正交试验方差结果显示，PVA-1788用量、CMC-Na用量、甘油用量对综合评分的贡献无显著性差异，三者用量配比需通过直观分析结果进行合理分配，正交试验直观分析显示，CMC-Na用量对综合评分影响较大，其次是甘油的用量，PVA-1788用量对综合评分影响较小。最优条件为A1B3C3，即最佳配比为：PVA-1788与CMC-Na的比例为1∶3，甘油用量为成膜材料用量的2%，与正交试验第3组试验条件一致，综合评分为83.99。
2.5 自制膜剂与市售膜剂的比较
按照“2.4.2”项下最优配比制备口腔溃疡缓释膜剂（D），依次进行外观评价、厚度、拉伸性能、溶胀速率、溶蚀速率、黏附力和黏附时间的测定，方法见“2.1”项下，并与市售复方庆大霉素膜（A）、复方氯己定地塞米松膜（B）及某医院院内制剂（C）进行对比，结果见表13，外观情况见图3。
表 13 自制膜剂与市售膜剂在不同考察项目的比较考察项目 复方庆大霉素膜（A） 复方氯己定地塞米松膜（B） 某医院院内制剂（C） 自制膜剂（D） 气泡 无 无 较多 无 颜色 浅蓝 黄色 浅黄色 白色 柔软度 很柔软 很柔软 较硬 软硬
适中平均拉伸长度（l/mm） 18.844 7.010 0.998 3.443 平均断点力（f/kg） 0.472 1.513 1.190 1.306 平均厚度（l/mm） 0.110 0.120 0.180 0.130 最大溶胀系数（%） 492.5 539.0 1898.1 1939.6 溶蚀时间（t/min） 60.0 60.0 140.0 120.0 黏附力（m/g） 40.0 45.0 5.0 55.0 黏附时间（t/min） 17.3 20.7 53.3 101.7 3. 讨论
以往对制剂进行研究一般仅以其中1~2种考察指标对制剂的性能进行评价，而考察指标的重要程度则常以主观设定权重，这样评价一种制剂性能的优劣不仅不全面，而且受到主观因素影响较大，往往评价重点考察指标的同时无法兼顾一般的考察指标。正如本课题筛选成膜材料需根据膜剂制备目标综合考察外观、厚度、拉伸性能、成膜时间、脱膜效果、黏附力、黏附时间、溶胀系数和溶蚀时间9个方面的考察指标，面对种类繁多、重要程度各不相同的考察指标，再采用以往的主观评价显得逻辑混乱且无说服力。因此，本课题采用单因素考察结合层次分析法，通过建立指标层不同指标两两比较矩阵，将不同重要性的指标进行统计学处理，得出科学合理的权重系数，以降低主观因素引起的误差，使评价更加全面、合理、客观。通过成膜材料单因素考察可知PVA-1788的弹性、拉伸性能、黏附力和黏附时间优于其他成膜材料，CNC-Na能使得膜剂吸水溶胀逐渐转变成凝胶状，提高膜剂的溶蚀时间。在单因素考察的基础上，设计正交试验，筛选出成膜材料的最佳配比为PVA-1788:CNC-Na为3∶1，并加入两者用量2%的甘油。
物理凝聚法是将分子或离子状态分散的药物溶液加入另一种分散介质中凝聚形成混悬液的方法，可制得10 μm以下的微粒。本试验将不溶于水的克霉唑、奥硝唑和冰片溶于无水乙醇中，在高速搅拌下缓慢加入水溶液中，使药物快速分散成极小的微粒，再利用成膜材料水凝胶的高黏度，抑制结晶增大和沉淀，并采用溶剂浇铸法迅速铺展和干燥，在药物微粒在尚未形成较大结晶前即完成膜剂的干燥，使不溶性药物均匀嵌入膜剂中。
自制膜剂为白色，外观均匀，无气泡，弹性适中，质地柔软，厚度较薄，气味清香，口味微甜，患者顺应性高，在口腔内使用舒适性好。市售复方氯己定地塞米松膜色素含量过高，溶蚀较快，使用后口感较差，对口腔有严重染色现象。市售复方庆大霉素膜具有较大的柔软度和拉伸长度，在实际使用中发现过于柔软，在口腔中易发生皱缩和折叠，在口腔粘贴过程中失败率较高。此外市售两种膜剂的黏附时间和溶蚀时间均较短，实际使用时无法起到长效缓释的作用。某医院院内制剂成膜材料为CMC-Na，因此具有较大的溶胀系数和较长的溶蚀时间，具有良好的缓释作用。单纯使用CMC-Na也存在一些缺陷，如气泡较多、拉伸性能较差、厚度较大、质地较硬等，其中最大的缺陷是CMC-Na初始黏附性较差，在试验过程中初始贴敷成功率较低，极易掉落，需要较长时间吸水溶胀形成凝胶后，才具有一定黏附性。本试验自制膜剂采用PVA-1788与CMC-Na配伍，使膜剂同时具备了较长的黏附时间和溶蚀时间，从黏附和缓释两方面确保膜剂对溃疡创面的滞留，改善了膜剂的外观、柔软度和拉伸性能，起到长效物理隔离和治疗作用。
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表 1 DMZ与FLC单独应用于23株真菌的MIC值
菌种 菌株 MIC80（g/L） FLC DMZ 白念珠菌 FLC敏感菌株 SC5314 0.25 8 7654 0.25 4 103 2 16 9161 0.25 4 10066 2 8 10060 0.25 4 10061 0.25 4 7879 1 8 9296 0.25 8 FLC耐药菌株 901 64 8 904 64 8 632 64 8 耳念珠菌 0029 64 32 热带念珠菌 8915 16 8 409 1 16 烟曲霉 7544 64 32 近平滑念珠菌 22019 2 4 90018 1 8 克柔念珠菌 4996 16 8 62588 16 8 10153 32 2 须毛癣菌 T5b 32 2 T5a 32 2 
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表 2 DMZ与FLC的协同抗氟康唑耐药白念珠菌的作用
菌株 MIC80（g/L） 协同指数 单用FLC 单用DMZ 联用FLC 联用DMZ 901 64 8 0.25 2 0.129 904 64 16 0.25 2 0.254 632 64 8 0.25 2 0.254
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