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光动力治疗（PDT）基于光辐照聚集光敏剂的肿瘤组织，由光敏剂诱发光动力反应形成单线态氧（1O2）等活性氧（ROS），通过对肿瘤细胞和肿瘤血管的直接杀伤及激活机体系统免疫反应等多种机制发挥抗肿瘤作用[1-3]。二氢卟吩及菌绿素类光敏剂是PDT新药研究的热点[4-8]。其中，已获批上市的代表药物有他拉泊芬（talaporfin）和帕利泊芬（padeliporfin）等[9, 10]。
光敏剂作为结构非特异性药物，存在缺乏肿瘤靶向性摄入和明确的作用药靶等缺陷。此外，PDT受制于局部治疗，对浸润较深的肿瘤组织，及已发生转移的肿瘤疗效有限。目前，PDT和化疗联用是克服上述缺陷，提高PDT疗效最为普遍和有效的策略之一。研究表明，抗代谢化疗药物氟尿嘧啶（5-Fu）与PDT联用具有协同抗肿瘤作用[11-13]。据此，我们设想利用在肿瘤微环境下能响应性断裂的连接基团（linker）将光敏剂与化疗药物偶联，希望实现二者在肿瘤组织的靶向释放，从而发挥其PDT和化疗协同抗肿瘤作用。酰腙键是酸敏感化学键，常被用来连接载体，以药物制备智能药物载体。这种药物载体到达肿瘤细胞的内涵体或溶酶体中时，会发生酸性水解将药物有效释放出来。因此，本文针对肿瘤微环境呈弱酸性的特点，采用药物化学最经典的前药设计策略，以脱镁叶绿素a（Phephorbide a）粗提物经酸碱降解制得的二氢卟吩e6（3）[14]为先导光敏剂，通过其152-羧基与抗肿瘤药物5-Fu以酸敏感酰腙键连接，设计合成pH响应型光化疗协同抗肿瘤光敏剂二氢卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1），并考察其体外PDT抗肿瘤活性和pH响应性5-Fu释放，及其对黑色素瘤B16-F10和肝癌HepG2细胞的光动力抗癌活性及其作用机制，以期获得高效、低毒的PDT治癌药物候选药物，合成路线见图1。
图 1 二氢卟吩e6 -偕氟尿嘧啶光敏剂（1）的合成路线
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用Bruker MSL-600型核磁共振仪测定1H NMR，CD3OD为溶剂；用API-3000 LC-MS型电喷雾质谱仪测定质谱（ESI-MS）；用岛津UV-160型紫外分光光度计测定UV吸收谱；用日立F-7000荧光分光光度计测定荧光发射谱；用Shimazu LC-20AD HPLC仪测定化合物1的相对纯度及其5-Fu的体外释放。色谱柱型号为Waters Xterra C18柱，流动相：乙腈-0.3%乙酸水溶液（80 : 20）；流速：1.0 ml/min；检测波长：400 nm（化合物1的相对纯度）或254 nm（5-Fu释放）；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。柱色谱分离用TELEDYNE ISCO的快速制备色谱Combi Flash@Rf+仪，硅胶H作为固定相。PDT抗癌活性测试使用BWT半导体激光仪（北京凯普林，波长为660 nm）；用流式细胞仪（BD Accuri C6，美国）（激发波长：488 nm，发射波长：525 nm）检测受试肿瘤细胞样品的ROS水平、细胞凋亡率和细胞周期阻滞。
二氢卟吩e6（3）按照文献[14]的方法制备；其它实验用材料和化学试剂均为市售商品。
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取氟尿嘧啶（0.2 g，1.563 mmol）溶于无水吡啶（10 ml），加入五硫化二磷（0.298 g，1.563 mmol），加热回流12 h。反应完毕，减压回收溶剂，残物加乙酸乙酯溶解（100 ml），用0.1 mol/L HCl洗涤（50 ml×2），无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂得4-硫代-5-氟尿嘧啶粗品。上述4-硫代-5-氟尿嘧啶粗品加甲醇（10 ml）溶解，于0 ℃下滴加N2H4·H2O（0.316 g，6.252 mmol），室温继续搅拌2 h。反应完毕，减压抽滤，P2O5真空干燥得固体化合物5-氟尿嘧啶-4-腙（2）中间体，直接用于下步反应。取二氢卟吩e6（0.1 g，0.168 mmol）溶于无水DMF（10 ml），加1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）（0.035 g，0.183 mmol），室温搅拌反应6 h后再加入中间体2（0.031 g，0.218 mmol），继续搅拌36 h。反应完毕，反应液加入10倍体积量乙酸乙酯，饱和NaCl水溶液洗涤（50 ml×3），无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂所得固体经快速制备色谱梯度洗脱分离纯化（流动相为二氯甲烷/甲醇/甲酸=15∶1∶0.1~8∶1∶0.1）得黑色固体1纯品0.048 g，产率39.6%。UV-vis λmax (MeOH, nm) (ε, M−1cm−1)：660 (3.15×104), 510 (0.82×104), 402 (8.13×104)。1H-NMR (600 MHz, CD3OD, δ, ppm): 9.79 (s, 1H, 10-CH), 9.73 (s, 1H, 5-CH), 9.07 (s, 1H, 20-CH), 8.19 (dd, J = 18.0, 12.0 Hz, 1H, 31-CH), 7.29 (s, 1H, 5-Fu的6-CH), 6.38 (d, J = 18.0 Hz, 1H, 32-CHB), 6.15 (d, J = 12.0 Hz, 1H, 32-CHA), 5.35 (s, 2H, 151-CH2), 4.65 (m, 2H, 17-CH和18-CH), 3.84 (q, J = 7.5 Hz, 2H, 81-CH2), 3.63 (s, 3H, 12-CH3), 3.53 (s, 3H, 2-CH3), 3.30 (s, 3H, 7-CH3), 2.3~2.0 (m,4H , 171-CH2 和172-CH2), 1.76 (m, 6H¸ 18-CH3和82-CH3)。MS (ESI+) m/z: 723.63 (M+H)+ (100%)。元素分析（C38H39N8O6F，%）计算值：C 63.16, H 5.40, N 15.48；实测值：C 63.34, H 5.38, N 15.43。HPLC测定纯度：95.2%。
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分别测定目标化合物1及其先导化合物二氢卟吩e6（3）的甲醇溶液（10 μmol/L）在300~800 nm处的紫外吸收谱和激发波长为400 nm的荧光发射光谱，结果见图2。
图 2 化合物1甲醇液（10 μmol/L）的紫外吸收谱和荧光发射谱（λEx=400 nm）
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分别配制浓度为50 μmol/L的化合物1的HOAc-NaOAc缓冲液（pH 5.0）和PBS溶液（10 ml），并于0.5、1.0、3.0、6.0、12、24 h时分别取样（500 μl）。其中，HOAc-NaOAc缓冲液（pH 5.0）组取样液用0.1 mol/L氢氧化钠水溶液迅速调节pH值至7.4。每份取样液加PBS稀释至原溶液1/3浓度，微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤，HPLC进样检测；实验重复3次。根据5-Fu的HPLC峰面积-浓度标准曲线分析计算，绘制目标化合物1于弱酸（pH 5.0）中的5-Fu体外释放量-时间曲线，结果见图3。
图 3 化合物1的体外pH响应性5-Fu累积释放量-时间曲线（n=3）
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参照文献[6-8]的方法，每孔5×103个B16-F10细胞或HepG2细胞悬液（100 μl）接种于96孔板上，加入等体积上述细胞培养液孵育24 h；更换含不同浓度待测物的培养液（DMSO浓度小于1%，100 μl），继续避光孵育48 h；再更换含10%（V/V）CCK-8（Beyotime，中国）的RPMI 1640基础培养基（100 μl），继续培养1.5 h，然后用Varioskan Flash全波长酶标仪（Thermo）于波长450 nm处测定每孔的吸光度值，计算各浓度对应的细胞存活率，并拟合得到待测物的肿瘤细胞半数抑制浓度即IC50值。
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每孔5×103个B16-F10细胞或HepG2细胞悬液（100 μl）接种于96孔板上，加入等体积细胞培养液孵育24 h；更换含不同浓度待测物的细胞培养液（DMSO浓度小于1%，100 μl），继续避光孵育24 h；再更换新鲜培养液（100 μl），以波长为660 nm的激光辐照受试细胞样品（光照剂量为10 J/cm2），继续孵育24 h。最后按“2.3.2”项下CCK-8法测定各待测物的肿瘤细胞IC50值。
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以临床光敏药物他拉泊芬为阳性对照，化合物1及其先导化合物3对肿瘤细胞株的体外PDT抗癌活性结果见表1。
表 1 目标化合物1的体外光动力抗癌活性（IC50，μmol/L）
化合物 B16-F10细胞 暗毒/光毒比 HepG2细胞 暗毒/光毒比 暗毒性 光毒性 暗毒性 光毒性 化合物 1 46.84±8.46*, ΔΔΔ 0.73±0.16**, ΔΔΔ 64.2 50.80±6.45**, #, ΔΔΔ 0.90±0.22**, ΔΔΔ 56.4 二氢卟吩e6 69.72±4.69 3.36±0.59 20.8 70.38±10.9 2.75±0.41 25.6 他拉泊芬 254.8±18.8 11.31±3.88 22.5 176.4±28.4 15.47±5.07 11.4 5-Fu 35.80±6.68 NTa − 39.16±2.7 NTa − NTa：未测定；*P < 0.05，**P < 0.01，与二氢卟吩 e6组比较；#P < 0.05，与5-Fu组比较；ΔΔΔP < 0.001，与他拉泊芬组比较。 -
操作步骤如下：a. 每孔3 × 105个B16-F10细胞悬液（2 ml）接种6孔板上，按“2.3.1”项条件避光孵育24 h；b. 分别更换含一定浓度化合物1或他拉泊芬的新鲜培养液（DMSO浓度小于1%，2 ml），继续避光孵育24 h；c. 加入10 mmol/L DCFH-DAROS荧光检测探针（Beyotime，1.5 μl），吹打混匀，继续避光孵育20 min；d. PBS洗涤3次，再加新鲜培养液（2 ml），以660 nm波长的激光辐照（光剂量10 J/cm2）细胞样品，继续避光孵育20 min；e. 收集每孔细胞样品，用流式细胞仪检测各孔细胞ROS水平，结果见图4。
图 4 目标化合物1诱导B16-F10细胞产生活性氧的水平
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按“2.4”项下操作方法，仅从步骤c开始，更换新鲜培养液（2 ml），用660 nm波长的激光辐照（光剂量10 J/cm2）细胞样品，继续避光孵育20 min；d. 以1 500 r/min离心（5 min）细胞样品，PBS洗涤，再以1 000 r/min离心（5 min）后获取细胞样品；e. 按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime）操作流程操作，结果见图5。
图 5 目标化合物1诱导B16-F10细胞凋亡
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按“2.5”项下操作方法，仅在e步骤中，换以细胞周期阻滞检测试剂盒（Beyotime）的操作流程，每份细胞样品中分别加入染色缓冲液（300 µl）、RNase A（6 µl）和碘化丙啶染色液（15 µl），轻轻混匀，避光孵育20 min后，用流式细胞仪进行细胞周期阻滞检测，结果见图6。
图 6 目标化合物1对B16-F10细胞周期的阻滞作用
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按文献[14]方法制得的二氢卟吩e6（3）为先导化合物，经1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）于无水DMF中催化分子内脱水缩合制得二氢卟吩e6-131,152-酸酐活泼中间体[15]，然后直接与中间体2发生酰化反应成功合成得到了光化疗双模抗肿瘤光敏剂二氢卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1），反应收率达39.6%，其结构经UV、ESI-MS、1H NMR及元素分析确证。
化合物1在甲醇中最大紫外吸收波长和荧光发射波长（激发波长：400 nm）分别为660 nm和670 nm，与先导物3相一致，表明先导物3以酰腙键偶联5-Fu后，并没有改变其作为光敏剂特有的紫外吸收和荧光发射光谱等光物理特性。此外，化合物1在弱酸（pH 5.0）条件下，能有效释放5-Fu，24 h内累积释放率可达60.3%；但在pH 7.4的条件下较为稳定，24 h内5-Fu累积释放率仅为5%。
体外PDT抗癌活性测试结果显示，化合物1对B16-F10和HepG2细胞株的光毒活性和暗毒/光毒比（治疗指数）均显著优于先导物二氢卟吩e6（3）（P<0.005）和他拉卟吩（P<0.001），其IC50值分别达0.73 μmol/L和0.90 μmol/L。
体外PDT抗癌机制研究提示，化合物1介导的PDT能显著提升B16-F10细胞内ROS水平和诱导B16-F10细胞凋亡，并阻滞肿瘤细胞周期于S期。
总之，二氢卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1）具有PDT抗癌活性强、治疗指数（暗毒/光毒比）高且可在肿瘤弱酸环境中有效释放5-Fu等优点，从而实现“单分子”光化疗协同抗肿瘤作用，值得进一步开发研究。
Synthesis and biological activities of chlorin e6-based conjugate of fluorouracil as dual-mode antitumor photosensitizer
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摘要:
目的 文献报道氟尿嘧啶（5-Fu）与光敏剂联用具有协同抗肿瘤作用，笔者设计合成二氢卟吩e6（化合物 3 ）与5-Fu经酰腙键偶联的pH响应性、光化疗双模抗肿瘤光敏剂（化合物 1 ），研究其初步体外光动力抗癌活性及作用机制。 方法 首先，5-Fu与五硫化二磷于吡啶中回流反应形成4-硫代-5-氟尿嘧啶，再和水合肼于甲醇中反应制得5-氟尿嘧啶-4-腙（化合物 2 ）；然后，将脱镁叶绿素a（化合物 4 ）酸碱降解产物 3 经EDC·HCl催化缩合形成二氢卟吩e6-131,152-酸酐中间体后，直接与 2 发生选择性酰化反应，制得目标化合物 1 ，并考察其体外pH响应性5-Fu释放及对黑素瘤B16-F10和肝癌HepG2细胞的光动力抗癌活性和作用机制。 结果 化合物 1 在微酸（pH 5.0）环境中能有效释放5-Fu，24 h累积释放率可达60.3%；其在光照下对黑素瘤B16-F10和肝癌HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为0.73 μmol/L和0.90 μmol/L，均显著优于先导物 3 和上市药物他拉泊芬（talaporfin），且能显著提升肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平和诱导肿瘤细胞凋亡，并阻滞肿瘤细胞周期于S期。其结构经紫外、电喷雾质谱、氢谱和元素分析确证。 结论 新型双模抗肿瘤光敏剂化合物 1 具有光动力抗癌活性强、治疗指数（暗毒/光毒比）高，且可在微酸（pH 5.0）环境响应性释放5-Fu等优点，从而实现“单分子”光化疗双重抗肿瘤作用，值得进一步开发研究。 Abstract:Objective To design and synthesize the conjugate (compound 1 ) of chlorin e6 (compound 3 ) with fluorouracil (5-Fu) as novel pH-responsive dual-mode antitumor photosensitizer by acyl hydrazone bond coupling, based on literature reports that combination of 5-Fu and photosensitizer possess synergistic anti-tumor effect, and investigate its photodynamic antitumor activity and mechanism. Methods Lead compound 3 was obtained by alkali degradation with 25% KOH-CH3OH on pheophorbide a (compound 4 ) which was prepared through acid hydrolysis of chlorophyll a in crude chlorophyll extracts from silkworm excrement. Reflux reaction of 5-Fu with P2S5 in pyridine formed crude 4-thio-5-fluorouracil which was followed to react with hydrazine hydrate (N2H4·H2O) in CH3OH to give 5-fluorouracil-4-hydrazone (compound 2 ). Then, treatment of compound 3 i.e. acid alkali degradation product of chlorophyll a in silkworm excrement with EDC·HCl generated its 171- and 152 cyclic anhydride which was followed to directly react with intermediate compound 2 to successfully get title compound 1 . In addition, its pH-responsive 5-Fu release and photodynamic antitumor activity and their mechanisms in vitro were investigated. Results Compound 1 could responsively release 5-Fu at pH 5.0, with a cumulative release rate of 60.3% within 24 h. It exhibited much higher phototoxicity against melanoma B16-F10 and liver cancer HepG2 cells than talaporfin and its precursor compound 3 , with IC50 value being 0.73 μmol/L for B16-F10 cells and 0.90 μmol/L for HepG2 cells, respectively. Upon light irradiation, it also could significantly induce cell apoptosis and intracellular ROS level and block cell cycle in S phase. Its structure was confirmed by UV, 1H-NMR, ESI-MS and elemental analysis data. Conclusion The conjugate compound 1 of compound 3 and 5-Fu has the advantages of strong PDT anticancer activity, high therapeutic index (i.e. dark toxicity/phototoxicity ratio) and responsively release 5-Fu at pH 5.0 etc. which shows “unimolecular” dual antitumor effects of PDT and chemotherapy and is worthy of further research and development. -
Key words:
- synthesis /
- photodynamic therapy /
- photosensitizer /
- chlorin e6 /
- fluorouracil (5-Fu) /
- antitumor
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人口老龄化、慢性病发病率增加、高价新药持续推出等因素使得全球医疗卫生支出迅速增长。为了控制药品费用，降低医疗费用开支，各国政府纷纷出台鼓励仿制药品研发和使用的政策[1]。研究显示，2003年—2012年，仿制药的替代为美国节省了超过1.5万亿美元的费用[2]。2018年，我国三级医院的患者门诊年人均费用为322.1元，其中药品费用占42.2%[3]，通常发达国家药品费用占20%[4]。而我国，广大公众的医疗消费水平还不高，质优价廉的仿制药仍是满足我国公众基本用药的重要来源和手段。近年来，国务院从国家战略层面提出开展仿制药质量一致性评价，以提高仿制药质量和用药可及性。尤其是在2018年11月，为了降低医疗开支，控制药品费用，国家组织了在北京、天津、上海、重庆4个直辖市和沈阳、大连、厦门、广州、深圳、成都、西安7个城市(简称“4+7”城市)试点药品集中带量采购。各试点城市委派代表组成联合采购办公室，代表公立医疗机构实施集中采购，兼顾药品采购数量和中标价格，通过以“量”换“价”的方式，促进仿制药替代原研药使用，达到合理降低药品费用的目的[5]。2019年2月29日，上海市发布了《关于本市执行“4+7”城市药品集中采购中选结果的通知》，正式公布了“4+7”中选品种及执行时间，要求上海市所有医保定点医疗机构于3月20日正式统一执行。
本研究通过评估该政策实施对上海市某公立三级综合医院门诊治疗心血管疾病的仿制药与原研药的利用情况的影响，分析仿制药替代策略带来的经济效益，为完善相关药物政策提供实证依据。
1. 资料与方法
1.1 目标疾病与目标药物
本研究根据《中国高血压防治指南2018年修订版》[6]中常用降压药及《冠心病合理用药指南第2版》[7]中常用治疗冠心病药对照该院药品使用目录，选择使用比例高，既有仿制药又有对应原研药的口服固体制剂品种。由于缓、控释剂型与普通制剂成本不同，所以本研究均选取相同剂型药物。另外，为了进行对比，单独选取了中选带量采购品种的原研药福辛普利作为对照（该药品没有对应仿制药品种），分析其在带量采购政策实施前后的药物利用状况的变化，并与其他仿制药进行比较。
共选取高血压和冠心病的目标药物11种，分别是治疗高血压的降压药物：硝苯地平、氨氯地平、缬沙坦、厄贝沙坦氢氯噻嗪、坎地沙坦、替米沙坦、替米沙坦氢氯噻嗪、奥美沙坦；治疗冠心病的药物：氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀。其中氨氯地平、厄贝沙坦氢氯噻嗪、氯吡格雷、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀5个仿制药品种为带量采购目录品种（其对应原研药未中选带量采购），即中选品种，其余6个仿制药及其对应的原研药品种均为非带量采购目录品种，即未中选品种。
1.2 数据来源
数据来源于上海市某三级医院的药品信息管理系统，分别抽取2018年4月1日至9月30日及2019年4月1日至9月30日该院用药数据，包括药品使用量、销售金额等。本研究采用世界卫生组织（WHO）官方网站提供的药物限定日剂量（defined daily dose, DDD）确定各药物的DDD值。因为高血压的复方制剂厄贝沙坦氢氯噻嗪和替米沙坦氢氯噻嗪无法在WHO网站直接查询到DDD值，所以根据WHO发布的《ATC分类和DDD分配指南（2020）》[8]分配原则，可以采用日维持剂量，且DDD值为每日给药的片数。
1.3 方法
1.3.1 使用数量和使用金额占比
医院药品零加成后，医院销售价等于采购价，统一采用药品采购价作为研究对象。研究时间分两组：政策实施前（2018年4月至9月）和政策实施后（2019年4月至9月）。研究中某一种药物的使用数量可以标化为该药品的用量(DDDs)，DDDs =某药品的消耗总剂量(mg)/该药DDD值(mg), DDDs反映了某药物的使用人数和人均使用频率，该值越大，表明使用人数越多或人均使用率越高[9]；用一个DDD的购买费用作为该药物的日费用，以此反映该药物的可负担性。日费用(DDDc)=[某药品采购价/该药每盒的剂量(mg)]×该药DDD值(mg)。
中选和未中选原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为该组内对应类型原研药或仿制药的DDDs和使用金额，分别除以原研药和仿制药的使用数量总DDDs和使用总金额。原研药或者仿制药的使用数量和金额占比为两种类型的原研或仿制药使用数量和金额占比的总和。
1.3.2 日费用及使用数量
以每组中选和未中选原研药或仿制药DDDc的加权平均费用作为研究对象，观察政策实施前后两种类型原研药及仿制药的日费用和使用数量的变化情况。原研药和仿制药DDDc是所有原研或仿制药DDDc的加权平均价格。
1.3.3 潜在费用节省率
因为药品的品种一直处于动态变化之中，而且每年的就诊人数在不断增长，本研究分别将政策实施前后的仿制药及原研药的数据进行分析，得到每个目标药品的日费用比及潜在费用节省情况。
仿制药与原研药的日费用比=仿制药DDDc/原研药DDDc×100%。
潜在节省的药品费用是指如果药物使用量不变，以仿制药替代原研药可以节省的费用。潜在费用节省率是指某药品节省的费用除以该原研药在4月至9月的使用金额。
节省费用(P)=Σ(原研药DDDc-仿制药DDDc)×原研药DDDs
潜在费用节省率=（P/原研药4月至9月使用金额）×100%
2. 结果
2.1 使用数量和使用金额占比
政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比见表1。
表 1 带量采购政策实施前后原研药和仿制药使用数量及使用金额占比(%)时间 未中选药品数量占比 中选药品数量占比 未中选药品金额占比 中选药品金额占比 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 38.74 6.08 45.58 9.60 26.44 2.39 59.59 11.59 2019.04-09 33.89 7.95 24.22 33.94 38.93 4.76 39.23 17.07 由表1可知，政策实施后，未中选和中选的原研药使用数量占比都呈现下降趋势，分别下降了12.52%和46.86%。未中选原研药使用金额占比呈现上升趋势，上升了47.24% ，而中选原研药使用金额占比下降了34.17%。未中选和中选的仿制药使用数量占比和金额占比都呈上升趋势，使用数量占比分别上升了30.76%、253.54%，使用金额占比分别上升了99.16%、47.28%。所有目标药物原研药使用数量和使用金额占比呈现下降趋势，使用数量占比下降更快。使用数量占比由84.32%下降至58.12%，降幅为31.07%；使用金额占比由86.02%下降至78.16%，降幅为9.14%。仿制药的使用数量和使用金额占比都呈现上升趋势，其中使用数量占比上升更快，上升了167.09%，使用金额占比上升了56.22%。
2.2 日费用及使用数量
带量采购政策实施前后目标药品原研药和仿制药DDDc、DDDs及使用总金额见表2和表3。
表 2 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的日费用(单位：元)时间 未中选药品的DDDc 中选药品的DDDc 仿制药DDDc 原研药DDDc 仿制药/原研药价格比(%) 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 4.61 2.65 8.83 8.16 6.02 6.89 0.87 2019.04-09 4.46 2.33 6.29 1.95 2.02 5.22 0.39 表 3 带量采购政策实施前后原研药和仿制药的总用量及总金额时间 未中选药品DDDs 中选药品DDDs 仿制药DDDs 原研药DDDs 使用总金额（万元） 原研 仿制 原研 仿制 2018.04-09 633 248 99 460 745 059 156 859 256 319 1 378 307 1 104.35 2019.04-09 611 842 143 490 437 290 612 604 756 095 1 049 132 700.72 由表2和表3可知，政策实施后，总的药品使用数量增加了10.44%，使用总金额却下降了36.55%。11种目标药物原研和仿制品种的DDDc均呈下降趋势，但是仿制药下降幅度更大，降幅达到66.45%，而原研药价格降幅为24.24%；仿制药与原研药在两组中加权平均日费用的比值从0.87下降到0.39，费用差距明显变大。未中选的原研药DDDc下降了3.25%，中选的下降28.77%；而仿制药则分别下降了12.08%、76.10%。相比于政策实施前，原研药使用量呈现下降趋势，下降了23.88%；而仿制药使用量呈现上升趋势，上升了194.98%，仿制药使用率明显提高。其中未中选和中选的原研药使用数量分别下降3.38%、41.31%；仿制药分别增加44.27%、290.54%。对照药品中选原研品种福辛普利的DDDs由3099增加到5451，增加了75.90%，DDDc由4.20元下降至1.26元，下降了70.00%。福辛普利日费用下降幅度与中选仿制药品种相似，且远高于未中选原研药的下降幅度，但其使用量的增加幅度不如中选仿制药品种，可能与该药本身临床应用较少有关。
2.3 仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率
带量采购政策实施前后各目标药物仿制药与原研药日费用比和潜在费用节省率见表4和表5（表格中药企名称为简称）。
表 4 带量采购政策实施前11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药日费用比 原研药DDDs 潜在节省费用（万元） 硝苯地平控释片 2.64 4.02 拜耳 0.66 151 130 20.79 氨氯地平片① 1.95 4.43 辉瑞 0.44 165 592 41.18 缬沙坦胶囊 2.58 5.17 诺华 0.50 165 494 42.89 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.62 4.53 赛诺菲 0.58 70 791 13.52 坎地沙坦酯片 2.18 5.17 武田制药 0.42 51 107 15.26 替米沙坦片 2.00 2.66 勃林格殷格翰 0.75 132 790 8.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.49 勃林格殷格翰 0.84 21 644 1.93 奥美沙坦酯片 4.66 6.49 第一三共制药 0.72 111 083 20.30 氯吡格雷片① 10.08 17.13 赛诺菲 0.59 151 375 106.83 阿托伐他汀钙片① 6.12 8.53 辉瑞 0.72 240 765 57.99 瑞舒伐他汀钙片① 6.88 7.53 阿斯利康 0.91 116 536 7.52 潜在节省费用总计 337.03 费用节省率，% 35% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 表 5 带量采购政策实施后11种药物仿制药与原研药日费用比及潜在费用节省率药品名 仿制药DDDc（元） 原研药DDDc（元） 原研药企 仿制药/原研药
日费用比原研药DDDs 2019年实际
总节省
费用（万元）潜在节省费用
（万元）硝苯地平控释片 1.62 4.02 拜耳 0.40 172 242 –8.19 41.26 氨氯地平片① 0.59 3.26 辉瑞 0.18 102 340 40.45 27.28 缬沙坦胶囊 2.53 5.01 诺华 0.51 153 188 6.96 37.92 厄贝沙坦氢氯噻嗪片① 2.18 3.67 赛诺菲 0.59 42 280 15.96 6.31 坎地沙坦酯片 2.18 4.45 武田制药 0.49 49 105 4.48 12.56 替米沙坦片 1.54 2.54 勃林格殷格翰 0.61 119 014 3.64 11.82 替米沙坦氢氯噻嗪片 4.60 5.39 勃林格殷格翰 0.85 16 639 1.37 1.31 奥美沙坦酯片 4.59 6.49 第一三共制药 0.71 101 654 3.89 19.27 氯吡格雷片① 3.34 13.10 赛诺菲 0.25 74 032 191.82 72.26 阿托伐他汀钙片① 0.94 6.11 辉瑞 0.15 137 977 123.19 71.29 瑞舒伐他汀钙片① 1.31 5.54 阿斯利康 0.24 80 661 20.07 34.13 节省费用总计 403.63 333.99 费用节省率，% 61% 注：①表示该药品为“4+7”带量采购目录中药品 政策实施前后，11种目标药物仿制药与原研药的日费用比分别在0.42～0.91、0.15～0.85之间。两组中日费用比差异最大的分别是坎地沙坦酯片和阿托伐他汀钙片，最小的是瑞舒伐他汀钙片和替米沙坦氢氯噻嗪片。该政策实施后，原研药和仿制药销售总金额减少了403.63万元。如果将政策实施前后目标药品原研药全部替换成仿制药，则该医院分别可节省潜在费用为337.03、333.99万元；潜在费用节省率为35%、61%。由于带量采购政策实施后，除硝苯地平、替米沙坦、阿托伐他汀和瑞舒伐他汀外，原研药品种使用数量下降，而原研药与仿制药DDDc差值下降并不明显，导致潜在节省费用减少了66.41万元，故政策实施后潜在节省费用下降不是十分明显。因为潜在节省费用变化不大，而原研药使用金额却大幅下降，所以潜在费用节省率相对于政策实施前变化十分明显。
3. 讨论
3.1 带量采购政策对仿制药替代和药品费用的影响
带量采购政策实施后，仿制药使用数量DDDs大幅增加，原研药使用数量下降，患者的药品费用明显减少。仿制药使用数量急剧上升是因为大部分中选品种为仿制药，该政策执行下，医院每月必须要完成约定额度的中选品种使用数量，否则将受到处罚，如政府部门减少对医院改革的奖励资金、取消医院的医保定点资格以及降低医院的等级等[10]。同时对医生处方用药产生一定的行政压力，如医院对未优先使用带量采购药品的医生进行经济惩罚和约谈等，利用行政措施促使医生使用中选品种。由于以量换价政策的实施，药品价格降低，在医生和药师的用药教育下，部分患者愿意接受效果相同而价格更低的仿制药进行治疗。并且中选药品价格下降对未中选的药品产生“波纹效应”[11]，导致药品的整体价格下降。
3.2 带量采购政策对仿制药使用的数量和金额占比产生影响
政策实施后，11种目标药品仿制药使用数量及金额占比上升明显，如仿制药使用金额占比分别由13.98%上升到21.84%，这一结果与北京市85家二、三级公立医院调查的结果相似，其心血管类仿制药金额占比为18.93%[12]。然而，长期以来，在医师和患者中业已形成了仿制药质量和疗效远不及原研药的认知。只有保证仿制药质量和效果与原研药相同，仿制药才能真正的替代原研药，因此我国仍需要加快仿制药一致性评价。研究中发现仿制药使用率低于原研药，可能与医生的处方习惯和患者对仿制药的态度有关。本文未中选品种有一半以上，医生受到的带量采购政策的约束较少，在临床诊疗过程中，可能会优先选择同样治疗心血管疾病且存在原研产品的药物。虽然药监部门宣称仿制药与原研药拥有相同的质量和疗效，但临床疗效评价的真实世界证据的缺乏，使医生和患者对于仿制药的效果仍然有很多顾虑[13]。因此，政府部门应鼓励相关企业和医疗机构开展仿制药与原研药一致性研究，确证仿制药在临床实际使用过程中是否能够真正有效替代原研药，并及时公布相关研究结果。同时，需要制定更详细的临床用药指南来规范医师的处方行为；完善奖励机制，鼓励医生和药师优先使用仿制药，如向医生和患者普及仿制药的相关知识，提高仿制药的替代使用率。对仿制药宣传教育活动进行适当的资金支持；扩大在权威媒体上的宣传；积极进行社区教育，帮助患者了解仿制药和一致性评价制度，减少医患之间的矛盾。
3.3 带量采购政策对原研药与仿制药价格差异的影响
政策实施后11种目标药物的原研药比仿制药价格高出548.03%～17.15%，大部分药品超过了原研与仿制药价格差应在30%以下的规定[14]。这一结果与我国某省198个样本药品调查结果吻合，该省原研药与仿制药价格差异倍数的均值为3.6倍[15]。原研药因其质量优势通常与仿制药实行区别定价，缺乏竞争导致价格水平较高，仿制药竞争激烈导致价格较低。并且带量采购政策实施后，仿制药价格下降明显，原研药价格降幅较小，导致原研药与仿制药价格差进一步增大。因此，政府应该发挥主导作用，加强对原研和仿制药品价格的监管力度；药品企业在降价时，应该以保证药品质量为前提，遵循经济规律，避免出现过去集中招标采购的断供和弃标现象。
综上，带量采购政策实施后，心血管类原研药使用数量和金额下降，仿制药使用数量上升，患者的药品费用支出减少；仿制药的替代率仍然较低，存在很大的费用节省空间；原研药与仿制药价格差距增大。本文中，带量采购政策实施对药物利用的经济性方面产生了积极影响。带量采购的目的，通过促进竞争，推动药品降价和仿制药替代，通过量价挂钩、及时回款降低医药企业销售费用和财务成本，进一步降低药品价格。通过设定质量门槛，让患者以更低廉的价格用上质量高效的药品。本文发现政策实施后药品价格下降，仿制药替代效应明显， DDDc下降的同时DDDs上涨，总体使用金额下降，改革基本达到预期目标。当然，带量采购还面临着如何保障质量、如何提升药品企业参与一致性评价的积极性、医院使用中选药品的积极性等挑战，需要配套政策加以完善。比如，应当进一步加大仿制药替代原研药的政策宣传，扩大政策实施的范围，加快仿制药一致性评价进程和采取措施避免原研药与仿制药价格差距的扩大。
本研究不足之处是在上海市的1家公立三级医院进行的研究，仅选择了治疗心血管疾病的11种药物，分析范围有一定局限性。未来的研究可以进一步扩大研究范围，将该城市不同级别医院都作为研究对象，按照治疗的不同疾病，分析各药品的原研药和仿制药使用情况，提供更全面的参考。
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图 1 二氢卟吩e6 -偕氟尿嘧啶光敏剂（1）的合成路线
试剂和反应条件：（i）五硫化二磷，吡啶，回流12 h；（ii）水合肼，甲醇，室温2 h；（iii）浓盐酸，乙醚，4 ℃ 30 min；（iv）25%氢氧化钾甲醇液，回流30 min；（v）a. EDC·HCl，N,N-二甲基甲酰胺，室温8 h；b.二异丙基乙胺，2, N,N-二甲基甲酰胺，室温12 h。
表 1 目标化合物1的体外光动力抗癌活性（IC50，μmol/L）
化合物 B16-F10细胞 暗毒/光毒比 HepG2细胞 暗毒/光毒比 暗毒性 光毒性 暗毒性 光毒性 化合物 1 46.84±8.46*, ΔΔΔ 0.73±0.16**, ΔΔΔ 64.2 50.80±6.45**, #, ΔΔΔ 0.90±0.22**, ΔΔΔ 56.4 二氢卟吩e6 69.72±4.69 3.36±0.59 20.8 70.38±10.9 2.75±0.41 25.6 他拉泊芬 254.8±18.8 11.31±3.88 22.5 176.4±28.4 15.47±5.07 11.4 5-Fu 35.80±6.68 NTa − 39.16±2.7 NTa − NTa：未测定；*P < 0.05，**P < 0.01，与二氢卟吩 e6组比较；#P < 0.05，与5-Fu组比较；ΔΔΔP < 0.001，与他拉泊芬组比较。 
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