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肺结核是我国青藏高原多发病[1]。2000年以来，全国肺结核发病率普遍下降，由峰值96.3/10万降至 59.3/10万。与之相反，肺结核发病率在青海地区呈总体上升趋势，由48.7/10万（2002年）上升至140.3/10万（2018年），远高于全国平均水平[2-5]。肺结核是一种慢性肺部疾病，由结核分枝杆菌引起，其特点是肺部损伤伴有干酪样化、坏死和纤维化，导致空腔形成，该空腔富含氧气和坏死组织物质，因此它成为包括念珠菌在内的多种生物的生长场所[6]。自然界中念珠菌种类众多，但绝大多数的侵袭性念珠菌感染由白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌，这5种最常见的病原体引起[7]。在临床治疗中，高原肺结核患者的特点为：症状重、病程进展快、合并症多；且肺结核与肺部念珠菌感染的症状类似，但肺部念珠菌感染症状更隐匿，易漏诊和延迟治疗，影响患者治疗及预后[8]。该研究选取2020年3月1日至2020年12月31日青海省第四人民医院（本院）3 012例住院肺结核患者为调查对象，分析肺结核合并肺部念珠菌感染分布特点及耐药率，为临床诊疗提供理论依据。
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调查对象为2020年3月1日至2020年12月31日本院3 012例住院肺结核患者。男性1 895例，占62.92%；女性1 117例，占37.08%；年龄18～94岁，平均（39.30±5.5）岁；患者主要临床症状表现为胸痛、发热、咳痰、咯血、气短及呼吸困难等。
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①经实验室和影像学检查，检测值均符合中华医学会结核病学分会肺结核的诊断标准及《内科学（第6版）》中肺部感染[9]的诊断标准；②签署知情同意书。
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①免疫性疾病相关患者；②肺部肿瘤等其他肺部疾病患者。本研究经医院伦理委员会批准，符合伦理规范，同意本研究的开展。
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收集确诊肺结核患者痰液样本，经过念珠菌培养2次，结果均为念珠菌属阳性感染。采用梅里埃公司VITEK-32-YBC细菌分析系统进行念珠菌鉴定，对检出念珠菌进行药敏试验，结果证明白念珠菌为质控菌株。
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使用SPSS21.0软件对数据进行统计分析，分析数据结果，率的比较采用χ２检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
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3 012例肺结核患者中合并念珠菌感染的患者为283例，感染率为9.40%，详见表1。
表 1 不同类型肺结核患者念珠菌感染率
肺结核分型 调查例数 感染例数 感染率（%） χ２ P 浸润型 903 38 4.21 44.629 <0.001 纤维空洞型 2 044 242 11.84 血行播散型 65 3 4.62 -
在283例念珠菌感染患者中，白念珠菌占79.86%，见表2。
表 2 肺结核患者痰培养念珠菌构成比
念珠菌 株数 构成比（%） 白念珠菌 226 79.86 光滑念珠菌 35 12.37 热带念珠菌 10 3.53 克柔念珠菌 5 1.77 近平滑念珠菌 2 0.71 其他 5 1.77 合计 283 100.00 -
该研究选取10种抗真菌药物，对白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌进行药敏试验，详见表3。
表 3 肺结核患者感染念珠菌对抗真菌药物的耐药率（%）
抗真菌
药物白色念珠
菌耐药率光滑念珠
菌耐药率热带念珠
菌耐药率克柔念珠
菌耐药率近平滑念珠
菌耐药率两性霉素B 0.87 0.00 0.00 15.23 0.00 氟胞嘧啶 7.36 0.00 0.00 14.78 0.00 制霉菌素 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 咪康唑 0.50 0.00 0.12 0.26 0.00 伊曲康唑 78.35 63.89 0.00 45.63 0.00 伏立康唑 77.06 65.63 7.63 56.36 0.00 氟康唑 81.90 63.33 0.00 100 0.00 酮康唑 0.50 0.00 0.15 0.00 0.00 卡泊芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 米卡芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 -
在该研究调查的3 012例肺结核患者中，念珠菌感染283例，占总数的9.40%，其中纤维空洞型242例，浸润性38例，血性播散型3例。纤维空洞型肺结核对肺部产生慢性破坏，干酪化、纤维化及坏死组织导致肺部空洞形成和支气管扩张，空洞内大量干酪样坏死物质形成，支气管扭曲变形，导致肺组织结构完整性被破坏，局部抵抗力下降，为结核杆菌和包括念珠菌在内的多种真菌提供下行感染的滋生地，即使在结核杆菌被消灭的情况下，念珠菌也经常会定植于肺部空腔并持续破坏已经扩张的支气管，导致纤维空洞型感染为肺结核合并念珠菌菌感染的主要类型[10]。
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该次调查研究主要针对高海拔地区，秦毅等[1]通过青藏高原疾病流行分析，发现青海地区肺结核的发病率从2002−2018年持续上升，至2018年全省结核病发病率为全国平均水平的2.3倍。肺结核发病率高考虑与藏区自然条件艰苦，医疗条件、经济水平落后，群众防疫宣传教育普及率低，人民防病意识较差，人群总体疫苗接种率较低等因素相关。青藏高原地广人稀，近年来，随着交通状况改善，群众社会交往增多，但该地区海拔高，低气温时间长，春、秋、冬季社会活动多聚集于室内，温暖的室内环境导致结核菌更易通过飞沫传播。该疾病在临床上具有致死率高、传染力强、致病性高、病程长等特点，且易反复发作、难治愈[11]。高海拔地区肺结核治愈率仅有58.3%，仅达到平原地区治愈率的60%[1]，且极其容易发生二重感染，尤其以合并念珠菌感染为主。高海拔肺结核合并念珠菌感染的原因主要包括：①肺结核患者处于慢性炎症状态，结核杆菌导致呼吸道黏膜损伤，长期服用抗结核药抑制正常菌群，故会引起菌群紊乱，条件致病菌生长，且高海拔地区慢性支气管炎、肺心病高发，并发症较多，使用广谱抗菌药，更易导致肺部念珠菌感染。肺结核合并咯血等重症患者，临床惯用糖皮质激素治疗，该类药物可以抑制中性粒细胞及巨噬细胞吞噬念珠菌孢子的能力，对免疫过程中的诸多环节有抑制作用，进而引发肺部念珠菌感染[10]。②高海拔地区基础医疗薄弱，患者用药依从性差，而肺部念珠菌感染症状隐匿，患者出现症状反复后才转入本院，导致延迟治疗，错失最佳治疗时机，治疗难度增大，病情控制差，且病情危重，更易导致念珠菌感染，严重影响患者治疗及预后。③该研究资料分析结果显示，肺结核合并念珠菌感染发生率约为9.40%，而相关文献报道发生率为3.95 %[12]，考虑肺结核患者机体状况差，能量消耗增加，免疫力低，高海拔地区长期缺氧，气候干冷，天气变化剧烈，温差幅度大，容易快速削弱机体抵抗力，导致习服衰变[13]，器官功能进一步损伤，口咽部白念珠菌通过被破坏的呼吸道黏膜下行至肺部，产生较多的细胞外酶，损害机体细胞，导致念珠菌感染率高。
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在肺结核合并念珠菌感染的283例患者中，共检出6种念珠菌，其中白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌3种主要的念珠菌检出271例，占病原体分离株的95.76%，与孟笑等[14]报道一致，符合国内大多数医院病原菌感染特征，但感染率相对偏高，其中，白念珠菌226株，占79.86%，光滑念珠菌35株，占12.37%，热带念珠菌10株，占3.53%。肺结核合并念珠菌感染的主要致病菌为白念珠菌，与张海燕等[15]、黄国军等[16]和程玲[17]报道一致，其他两种致病菌为光滑念珠菌、热带念珠菌。上述念珠菌耐药性实验结果显示，白念珠菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐药率为70%以上；光滑念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐药率可达60%以上；克柔念珠菌对氟康唑固有耐药，对伏立康唑、伊曲康唑耐药率为40%以上；氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑为治疗肺部真菌感染的常用药物，抗菌谱广，临床使用广泛，患者反复长期使用，且药物半衰期长，可能是导致这几种药物耐药率高的原因，且存在交叉耐药的情况。两性霉素B、氟胞嘧啶等药物耐药率低，虽然抗真菌效果相对较好，但对肝肾功能影响较大，两性霉素B会导致高热、寒颤、恶心呕吐等不良反应，氟胞嘧啶治疗周期长，使用剂量较大，且需要与其他药物联合使用，不是临床治疗念珠菌感染的一线用药[18-19]，但可以作为在唑类或棘白菌素不能使用时的治疗方案。棘白菌素对大多数念珠菌具有高度活性，且棘白菌素在本院使用量较少，考虑为棘白菌素类无耐药菌株产生的可能因素。
综上所述，抗念珠菌药物的选择需根据本地药敏结果和结核患者实际情况进行综合分析，得出更适合患者的有效治疗方案，从根源上使青藏高原地区肺结核合并念珠菌感染的发病率得到遏制。
Distribution characteristics and drug resistance rate of pathogenic bacteria in patients with pulmonary tuberculosis combined with Candida infection on the Tibetan plateau
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摘要:
目的 研究青藏高原肺结核患者中机会性念珠菌病原学分布特点及耐药情况。 方法 分析2020年3月1日至2020年12月31日青海省第四人民医院3 012例住院肺结核患者，收集痰标本，采用VITEK-32-YBC全自动细菌分析系统进行念珠菌鉴定，并对检出的念珠菌进行药敏试验。 结果 在本次调查的3 012例肺结核患者中，合并念珠菌感染的肺结核患者有283例，占9.40%。其中，念珠菌类型又以白念珠菌为主，占总数的79.86%。 结论 青藏高原地区肺结核合并念珠菌感染的患病率较高。因此，选择抗菌药物要根据患者的情况综合分析，以此来选择最佳、最有效的药物治疗方法。 Abstract:Objective To investigate the pathogenic distribution characteristics and drug resistance of opportunistic Candida in patients with pulmonary tuberculosis on the Qinghai-Tibet Plateau. Methods 3 012 hospitalized cases of pulmonary tuberculosis at Qinghai Province Fourth People’s Hospital from March 1, 2020 to December 31, 2020 were analyzed, sputum samples were collected, Candida identification was carried by VITEK-32-YBC automatic bacterial analysis system, and the detected Candida was tested for drug sensitivity. Results Among the 3 012 cases of pulmonary tuberculosis in this investigation, 283 cases of pulmonary tuberculosis patients with Candida infection, accounting for 9.40%. Among them, Candida albicans was the main type of Candida, accounting for 79.86% of the total. Conclusion The prevalence rate of pulmonary tuberculosis complicated with Candida infection was high in Qinghai-Tibet Plateau. Therefore, the selection of antimicrobial drugs should be based on a comprehensive analysis of the patient's condition, in order to select the best and most effective drugs for treatment. -
Key words:
- pulmonary tuberculosis /
- Candida /
- etiology /
- drug resistance
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 不同类型肺结核患者念珠菌感染率
肺结核分型 调查例数 感染例数 感染率（%） χ２ P 浸润型 903 38 4.21 44.629 <0.001 纤维空洞型 2 044 242 11.84 血行播散型 65 3 4.62 
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表 2 肺结核患者痰培养念珠菌构成比
念珠菌 株数 构成比（%） 白念珠菌 226 79.86 光滑念珠菌 35 12.37 热带念珠菌 10 3.53 克柔念珠菌 5 1.77 近平滑念珠菌 2 0.71 其他 5 1.77 合计 283 100.00
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表 3 肺结核患者感染念珠菌对抗真菌药物的耐药率（%）
抗真菌
药物白色念珠
菌耐药率光滑念珠
菌耐药率热带念珠
菌耐药率克柔念珠
菌耐药率近平滑念珠
菌耐药率两性霉素B 0.87 0.00 0.00 15.23 0.00 氟胞嘧啶 7.36 0.00 0.00 14.78 0.00 制霉菌素 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 咪康唑 0.50 0.00 0.12 0.26 0.00 伊曲康唑 78.35 63.89 0.00 45.63 0.00 伏立康唑 77.06 65.63 7.63 56.36 0.00 氟康唑 81.90 63.33 0.00 100 0.00 酮康唑 0.50 0.00 0.15 0.00 0.00 卡泊芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 米卡芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
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