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银屑病，俗称牛皮藓，是一种由多种因素造成自身免疫应答紊乱的慢性炎症性皮肤病[1]。该病在欧美国家的发病率在1%～3%，在中国的发病率为0.5%[2]。目前，银屑病的发病机制尚不清楚，普遍认为与遗传、环境和免疫等因素有关[3]。银屑病发病病程长，难以治愈且易复发。根据发病特征可分为多种类型，其中，以斑块状银屑病最为常见[4]。临床常用生物制剂治疗银屑病，具有起效快和疗效更优的特点。近年来，用于治疗银屑病的生物制剂包括有TNF-α抑制剂、IL-12/23抑制剂、IL-17抑制剂和IL-23抑制剂。代表药物有阿达木单抗（adalimumab）、乌司奴单抗（ustekinumab）以及司库奇尤单抗（secukinumab）等[5-6]。这些药物疗效确切，但有对部分患者无效或者长期使用容易出现耐受的问题[7]。bimekizumab（bim）是优时比制药为克服上述问题开发的第一个针对IL-17A和IL-17F的双重抑制剂，2021年8月在获欧盟批准上市。多项临床研究显示，bim治疗银屑病有良好疗效，但国内外没有关于bim治疗斑块状银屑病的循证医学证据，同时探索bim与已经上市的一些药物的疗效对比差异，笔者期望通过系统评价bim治疗中重度斑块状银屑病的疗效与安全性，为临床使用bim提供更多证据与依据。
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随机对照试验(RCT)，中英文不限。
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临床被诊断为中、重度斑块状银屑病的18岁以上（含18岁）患者[4]，患病时间≥6个月，严重程度指数（PASI）评分≥12，银屑病累及体表面积（BSA）≥10%，研究者总体评估评分（IGA）评分≥3。
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试验组采用bim，对照组采用安慰剂或其他药物治疗。
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主要结局指标：第12周或者16周患者经治疗后PASI 90和PASI 100的患者例数；次要结局指标：第12周或者16周IGA达0或1的患者例数；安全性指标：第12周或者16周试验组和对照组患者发生的不良事件。
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非RCT试验；研究对象为非斑块状银屑病的患者；未提供相关的结局指标。
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在Cochrane Library、Pubmed、MEDLINE、EMBASE、Web of Science、知网、万方、维普、CBM等数据库检索符合标准的文献并手工检索纳入研究的参考文献，检索截止时间为2022年1月30日，语种仅限中英文。英文以bimekizumab、Psoriasis、randomized controlled trial。中文以bimekizumab、银屑病、随机对照试验为检索词。
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由两位研究者分别对纳入的研究进行题目、摘要阅读，根据纳入和排除标准筛选文献，若有分歧再由第3位评价者来判定。提取内容包括第一作者、发表年份、研究对象例数、干预措施、研究对象年龄、体重、结局指标等信息。
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两位研究者独自采用Cochrane系统评价员手册5.1.0提供的偏倚风险评估工具对纳入的研究进行质量评价，从随机分配的产生方法、分配隐藏、双盲、结果数据是否完整、是否存在选择性报道及其他可能的偏倚来源等方面进行评价[8]。
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采用RevMan 5. 3软件对纳入研究进行系统评价，二分类变量采用风险比(RR)或优势比（OR）表示效应量，连续性变量则采用加权均数差（WMD）表示，用95%可信区间（95%CI）进行区间估计。研究间的异质性用P值和I2检验评价，若P<0.05，I2>50% ，表明研究间具有异质性，分析异质性的可能来源，采用随机效应模型。若P>0.05，I2<50%，采用固定效应模型。
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根据检索策略共检索到257篇文献，阅读标题和摘要剔除重复文献后得到得到87篇文献，阅读全文后，根据纳入和排除标准最后得到5篇文献[9-13]，其中一篇文献报道了安慰剂和阳性药物两种对照组，按两项试验处理。因此，最终纳入5篇文献，6项研究，一共2308例患者，且6项研究均为RCT，发表语种均为英文，所有纳入研究的基线特征基本相似，文献筛选流程见图1，纳入的文献的基本特征见表1。
图 1 文献筛选流程
表 1 纳入研究的基本特点
研究 例数(n) 干预措施 年龄 体重（m/g） 病程/年 PASI/分 结局指标 Warren RB 2021[9] 319
159bim, 320mg, sc
ada, 40mg, sc45.3±13.2
45.5±14.389.6±21.4
90.5±22.120.4±13.2
16.2±11.920.5±6.9
19.0±5.9PASI90/100 IGA0或1
不良反应Reich K 2021a[10] 321
163bim, 320mg, sc
ust,45mg/90mg, sc45.2±14.0
46.0±13.688.7±23.1
87.2±21.116.0±11.6
17.8±11.622.0±8.6
21.3±8.3PASI90/100 IGA0或1
不良反应Reich K 2021b[10] 321
83bim, 320mg, sc
placebo45.2±14.0
49.7±13.688.7±23.1
89.1±26.416.0±11.6
19.7±13.822.0±8.6
20.1±6.8PASI90/100 IGA0或1
不良反应Papp KA 2018[11] 43
42bim, 320mg, sc
placebo42.5±13.6
46.7±12.386.9±21.7
88.8±21.215.9±9.5
15.0±11.819.4±6.4
18.9±5.8PASI90/100 IGA0或1
不良反应Lebwohl M 2021[12] 373
370bim, 320mg, sc
sec, 300mg, sc45.9±14.2
44.0±14.790.1±21.3
88.8±20.018.4±13.1
17.2±12.320.2±7.5
19.7±6.7PASI90/100 IGA0或1
不良反应Gordon K B 2021[13] 349
86bim, 320mg, sc
placebo44.5±12.9
43.5±13.188.7±20.6
91.7±22.219.6±13.3
19.1±12.820.4±7.6
20.1±7.6PASI90/100 IGA0或1
不良反应注：bim：bimekizumab，ada：阿达木单抗，ust：乌司奴单抗，sec：司库奇尤单抗，placebo：安慰剂，sc: 皮下注射，PASI: 银屑病皮损面积和严重程度指数 -
纳入的5[9-13]篇文献，6项研究均报道随机方法是由交互式语音应答系统产生，所有研究都为双盲，结果完整，3项研究未进行选择性报道和所有研究的其他偏倚风险均不清楚，纳入的研究的具体质量评价见表2，偏倚风险评价见图2、图3。
表 2 纳入研究质量评价表
图 2 偏倚风险条形图
图 3 偏倚风险图
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6项试验[9-13]均报道了PASI 90，其中3项研究[10-11,13]均是bim与安慰剂比较，另外3项研究[9-10,12]比较的是bim与阳性药物对PASI 90的作用。因此，将6项研究按照对照组的不同分为两组分别进行系统评价。结果显示，在bim与安慰剂对照中，各研究间不存在统计学异质性( P=0.28)，采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，bim组达到PASI 90的患者比例多于对照组，差异具有统计学意义（风险比=32.08，95%CI [14.12，72.88]，P<0.00001）。在bim与阳性药物对照中，各研究间异质性存在统计学异质性( P<0.05），采用随机效应模型进行分析。经过治疗后，bim组达到PASI 90的患者比例多于阳性药物对照组，差异具有统计学意义（风险比=1.52，95%CI [1.06，2.19]，P=0.02），见图4、5和表3。
图 4 Bim与安慰剂对照的PASI 90的森林图
图 5 Bim与阳性药物对照的PASI 90的森林图
表 3 有效性结局指标系统评价
结局指标 纳入研究 系统评价结果 异质性 风险比 95%CI P P I2（%） 效应模型 bim与安慰剂 PASI 90 3[10,11,13] 32.08 （14.12，72.88） <0.00001 0.28 22 固定 PASI 100 3[10,11,13] 67.62 （16.43，278.28） <0.00001 0.93 0 固定 IGA0/1 3[10,11,13] 24.19 （11.39，51.37） <0.00001 0.30 44 固定 bime与阳性药物 PASI 90 3[9-10,12] 1.52 （1.06，2.19） 0.02 <0.05 96 随机 PASI 100 3[9-10,12] 2.11 （1.22，3.66） 0.008 <0.05 97 随机 IGA0/1 3[9-10,12] 1.59 （1.00，2.53） 0.05 <0.05 94 随机 -
6项试验[9-13]均报道了PASI 100，将6项研究按照对照组的不同分为两组分别进行系统评价。结果显示，在bim与安慰剂对照中，各研究间不存在统计学异质性( P=0.93)，采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，bim组达到PASI 100的患者比例多于安慰剂组，差异具有统计学意义（风险比=67.62，95%CI [16.43，278.28]，P<0.00001）。在bim与阳性药物对照中，各研究间存在统计学异质性( P<0.05），采用随机效应模型进行分析。经过治疗后，bim组达到PASI 100的患者比例多于对照组，差异具有统计学意义（风险比=2.11，95%CI [1.22，3.66]，P=0.008），具体见表3。
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6项试验[9-13]均报道了IGA评分结果，将6项研究按照对照组的不同分为两组分别进行系统评价。结果显示，在bim与安慰剂对照中，各研究间不存在统计学异质性( P=0.30)，采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，bim组达到IGA评分0或者1的患者比例多于对照组，差异具有统计学意义（风险比=24.19，95%CI [11.39，51.37]，P<0.00001）。在bim与阳性药物对照中，各研究间存在统计学异质性(P<0.05)，与阳性药物对比，bim组达到IGA评分0或者1的患者比例相当，差异无统计学意义（P=0.05），见表3。
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6项试验[9-13]均报道了不良事件发生例数，将6项研究按照对照组的不同分为两组，分别进行系统评价。两组中各研究组间不存在统计学异质性(P=0.75，0.31)，均采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，与安慰剂对照，bim组不良事件发生率多于安慰剂组，差异具有统计学意义（风险比=1.38，95%CI [1.17，1.64]，P=0.0002）。而阳性药物组与bim比较差异无统计学意义（P=0.06），见表4。
表 4 安全性分析结局指标
结局指标 纳入研究 系统评价结果 异质性 风险比 95%CI P P I2（%） 效应模型 bim与阳性药物 3[9-10,12] 1.06 （1.00，1.13） 0.06 0.75 0 固定 总不良事件 严重不良反应 3[9-10,12] 0.90 （0.55，1.45） 0.32 0.61 0 固定 上呼吸道感染 3[9-10,12] 0.92 （0.79，1.07） 0.28 0.95 0 固定 口腔念珠菌感染 3[9-10,12] 8.73 （4.80，15.84） <0.00001 0.30 16 固定 bim与安慰剂 3[10,11,13] 1.38 （1.17，1.64） 0.0002 0.31 13 固定 总不良事件 严重不良反应 3[10,11,13] 0.62 （0.22，1.80） 0.38 0.90 0 固定 上呼吸道感染 3[10,11,13] 0.73 （0.36，1.47） 0.37 0.41 0 固定 口腔念珠菌感染 3[10,11,13] 11.34 （2.11，60.86） 0.005 0.93 0 固定 鼻咽炎 3[10,11,13] 1.40 （0.79，2.48） 0.25 0.54 0 固定 -
6项试验[9-13]均报道了严重不良事件发生例数，将6项研究按照对照组的不同分为两组分别进行系统评价。两组中各研究组间不存在统计学异质性( P =0.90，0.61)，均采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，与安慰剂和阳性药物对比，bim组严重不良事件发生率差异均无统计学意义（P=0.38，0.32），见表4。
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6项试验[9-13]报道了上呼吸道感染、口腔念珠菌感染和鼻咽炎，将6项研究按照对照组的不同分为两组分别进行系统评价。两组中各研究组间不存在统计学异质性( P>0.05)，均采用固定效应模型进行分析。经过治疗后，与安慰剂和阳性药物对照，上呼吸道感染和鼻咽炎差异均无统计学意义（P>0.05）。但是bim组的口腔念珠菌感染的发生率多于安慰剂组，也多于阳性药物组（与安慰剂对比：风险比=11.34，95%CI [2.11，60.86]，P=0.005）, 与阳性药物对比：风险比=8.73，95%CI [4.80，15.84]，P<0.00001），见表4。
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对bim与阳性药物对照的有效性指标（异质性较大）进行敏感性分析，去除Lebwohl[12]研究，结果变化见表5，IGA评分0或1的患者比例有所改变，由与对照组相比无统计学差异变为优于对照组，其他结果无变化（试验组优于对照组），去除权重大的研究并未改变系统评价得到的结论。
表 5 敏感性分析
指标 剔除前 剔除后 风险比 95%CI P 风险比 95%CI P PASI 90 1.52 （1.06，2.19） 0.02 1.77 （1.57，1.98） <0.00001 PASI 100 2.11 （1.22，3.66） 0.008 2.66 （2.15，3.30） <0.00001 IGA 0或1 1.59 （1.00，2.53） 0.05 1.96 （1.06，3.62） 0.03 -
银屑病作为一种系统性免疫炎症皮肤疾病，机制不明，难以治愈。银屑病发生过程中T细胞过度活化，其中，Th17细胞可特异性表达IL-17A和IL-17F引起炎症反应，bim可同时作用与IL-17A和IL-17F，发挥抗炎作用抑制银屑病的发展[14]。bim作为首个双重靶点抑制剂，临床研究中展现了良好的疗效和安全性。为了进一步分析bim的疗效，本次研究对bim的临床研究进行系统评价。结果显示，经过治疗后，bim组达到PASI 90，PASI 100和IGA评分达到0或1的患者比例均多于安慰剂组，提示bim对中重度的斑块状银屑病的疗效远优于安慰剂，疗效确切。同时与阳性药物对比，bim组达到PASI 90，PASI 100的患者多于对照组，IGA评分达到0或1的患者比例则无统计学差异，提示bim治疗中重度斑块状银屑病的疗效优于阿达木单抗、乌司奴单抗和司库奇尤单抗。出现此结果的可能原因，阿达木单抗通过作用于TNF发挥作用[15]，乌司奴单抗通过抑制IL-12/23[16]，司库奇尤单抗通过抑制IL-17A发挥作用[17]，bim则是通过抑制双靶点IL-17A和IL-17F发挥作用，这种双靶点作用机制使得bim表现出更为强大的疗效，但系统评价结果中的IGA评分达到0或1的患者比例仅显示疗效相当，因此还需更多的与阳性药物对比的临床试验来证实结论。值得注意的是，在进行系统评价过程中，研究的异质性较高，可能与3项研究分别使用乌司奴单抗、阿达木单抗和司库奇尤单抗作为阳性对照有关，将异质性高的指标进行敏感性分析，试验组IGA评分达到0或1的患者比例优于阳性药物组，但并未改变本次系统评价得到的结论。
安全性方面结果显示，bim的总不良反应事件的发生率多于安慰剂，与阳性药物相当。在严重不良反应事件发生率上，bim与安慰剂和阳性药物对比无统计学差异。在导致上呼吸道感染和鼻咽炎方面，bim与安慰剂和阳性药物对比无统计学差异。但在导致口腔念珠菌感染方面，bim的发生率高于安慰剂组，也高于阳性药物对照组，提示bim的安全性良好，但口腔念珠菌感染率较高。有研究显示针对IL-17靶点的生物制剂会导致口腔念珠菌的感染率提高[18]，而bim正是通过双重抑制IL-17发挥作用，其口腔念珠菌感染率确实相较于其他药物也有所提高，侧面印证本次研究结果。有综述认为IL-17的拮抗剂在严格监测下使用还是较为安全，严重不良反应罕见[19]。针对bim引起的念珠菌感染，使用过程中定期监测念珠菌发生的口腔感染，一般不良反应轻微，也可进行抗念珠菌治疗来保障患者的用药安全。
本研究的局限性：①纳入文献的语种限定为中文和英文，可能存在发表偏倚。②本次纳入的与阳性药物对照的研究不多，还需更多大样本，多中心的临床研究来进一步证实本次研究得到的结论。
综上所述，bim在治疗中重度斑块状银屑病的疗效显著，不良反应轻微可耐受，但临床使用过程中要注意口腔念珠菌的感染。
Efficacy and safety of bimekizumab in treatment of moderate/severe plaque psoriasis: a systematic review
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摘要:
目的 探讨bimekizumab治疗中/重度斑块状银屑病的有效性和安全性。 方法 检索自建库以来到2022年1月Cochrane Library、Pubmed、MEDLINE、EMBASE、Web of Science、CBM、知网、万方、维普数据库关于bimekizumab治疗银屑病的随机对照试验（RCT），并使用RevMan5.3软件进行系统评价。 结果 共纳入5篇文献，6项研究，共有2308例中/重度银屑病患者。在有效性方面，与阳性药物相比，Bimekizumab组银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）改善大于90%（PASI 90），PASI 100的患者多于对照组，研究者总体评估评分（IGA）评分达到0或1的患者比例则无统计学差异（P=0.05）。与安慰剂组相比，Bimekizumab组达到PASI 90，PASI 100和IGA评分达到0或1的患者比例均多于安慰剂组。在安全性方面，Bimekizumab的总不良反应事件的发生率多于安慰剂（P=0.000 2），与阳性药物相当（P=0.06）。严重不良反应事件发生率，在呼吸道感染和鼻咽炎方面，Bimekizumab与安慰剂和阳性药物对比，无统计学差异（P>0.05）。但在导致口腔念珠菌感染方面，Bimekizumab的发生率高于安慰剂组(P=0.005），也高于阳性药物对照组（P<0.000 01）。 结论 Bimekizumab可安全、有效地治疗中/重度斑块状银屑病，但临床使用过程中需要注意监测口腔念珠菌的感染。 -
关键词:
- Bimekizumab /
- 银屑病 /
- 疗效 /
- 安全性 /
- 系统评价
Abstract:Objective To evaluate the efficacy and safety of bimekizumab in the treatment of moderate/severe plaque psoriasis. Methods Literatures from Cochrane Library, PubMed, Embase, CNKI, VIP databases from the establishment time to January of 2022 were retrieved. The Review manager 5.3 statistical software was used to systematical review. Results 5 publications, 6 RCTs met the inclusion criteria, which involved 2308 participants. In terms of efficacy, patients in the experimental group were more than positive medicine control group in PASI 90, PASI 100, no significantly statistical difference in IGA 0 or 1 cases (P=0.05). PASI 90, PASI 100 and IGA 0 or 1 cases of patients in the experimental group were higher than that of the placebo group . In the safety evaluation, the incidence of adverse reaction in experimental group was higher than the placebo group (P=0.000 2), which was the same as the positive medicine control group (P=0.06). The experimental group was no statistical difference compared with positive medicine control and the placebo group in the incidence of serious adverse events including upper respiratory tract infection and nasopharyngitis (P>0.05). But the rate of oral candidiasis in experimental group was higher than the positive medicine control group (P<0.000 01) and the placebo group (P=0.005). Conclusion bimekizumab could treat moderate/severe plaque psoriasis effectively and safely, and the oral candidiasis during the treatment should be noticed. -
Key words:
- Bimekizumab /
- psoriasis /
- efficacy /
- safety /
- systematic review
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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表 1 纳入研究的基本特点
研究 例数(n) 干预措施 年龄 体重（m/g） 病程/年 PASI/分 结局指标 Warren RB 2021[9] 319
159bim, 320mg, sc
ada, 40mg, sc45.3±13.2
45.5±14.389.6±21.4
90.5±22.120.4±13.2
16.2±11.920.5±6.9
19.0±5.9PASI90/100 IGA0或1
不良反应Reich K 2021a[10] 321
163bim, 320mg, sc
ust,45mg/90mg, sc45.2±14.0
46.0±13.688.7±23.1
87.2±21.116.0±11.6
17.8±11.622.0±8.6
21.3±8.3PASI90/100 IGA0或1
不良反应Reich K 2021b[10] 321
83bim, 320mg, sc
placebo45.2±14.0
49.7±13.688.7±23.1
89.1±26.416.0±11.6
19.7±13.822.0±8.6
20.1±6.8PASI90/100 IGA0或1
不良反应Papp KA 2018[11] 43
42bim, 320mg, sc
placebo42.5±13.6
46.7±12.386.9±21.7
88.8±21.215.9±9.5
15.0±11.819.4±6.4
18.9±5.8PASI90/100 IGA0或1
不良反应Lebwohl M 2021[12] 373
370bim, 320mg, sc
sec, 300mg, sc45.9±14.2
44.0±14.790.1±21.3
88.8±20.018.4±13.1
17.2±12.320.2±7.5
19.7±6.7PASI90/100 IGA0或1
不良反应Gordon K B 2021[13] 349
86bim, 320mg, sc
placebo44.5±12.9
43.5±13.188.7±20.6
91.7±22.219.6±13.3
19.1±12.820.4±7.6
20.1±7.6PASI90/100 IGA0或1
不良反应注：bim：bimekizumab，ada：阿达木单抗，ust：乌司奴单抗，sec：司库奇尤单抗，placebo：安慰剂，sc: 皮下注射，PASI: 银屑病皮损面积和严重程度指数 
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表 3 有效性结局指标系统评价
结局指标 纳入研究 系统评价结果 异质性 风险比 95%CI P P I2（%） 效应模型 bim与安慰剂 PASI 90 3[10,11,13] 32.08 （14.12，72.88） <0.00001 0.28 22 固定 PASI 100 3[10,11,13] 67.62 （16.43，278.28） <0.00001 0.93 0 固定 IGA0/1 3[10,11,13] 24.19 （11.39，51.37） <0.00001 0.30 44 固定 bime与阳性药物 PASI 90 3[9-10,12] 1.52 （1.06，2.19） 0.02 <0.05 96 随机 PASI 100 3[9-10,12] 2.11 （1.22，3.66） 0.008 <0.05 97 随机 IGA0/1 3[9-10,12] 1.59 （1.00，2.53） 0.05 <0.05 94 随机
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表 4 安全性分析结局指标
结局指标 纳入研究 系统评价结果 异质性 风险比 95%CI P P I2（%） 效应模型 bim与阳性药物 3[9-10,12] 1.06 （1.00，1.13） 0.06 0.75 0 固定 总不良事件 严重不良反应 3[9-10,12] 0.90 （0.55，1.45） 0.32 0.61 0 固定 上呼吸道感染 3[9-10,12] 0.92 （0.79，1.07） 0.28 0.95 0 固定 口腔念珠菌感染 3[9-10,12] 8.73 （4.80，15.84） <0.00001 0.30 16 固定 bim与安慰剂 3[10,11,13] 1.38 （1.17，1.64） 0.0002 0.31 13 固定 总不良事件 严重不良反应 3[10,11,13] 0.62 （0.22，1.80） 0.38 0.90 0 固定 上呼吸道感染 3[10,11,13] 0.73 （0.36，1.47） 0.37 0.41 0 固定 口腔念珠菌感染 3[10,11,13] 11.34 （2.11，60.86） 0.005 0.93 0 固定 鼻咽炎 3[10,11,13] 1.40 （0.79，2.48） 0.25 0.54 0 固定
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表 5 敏感性分析
指标 剔除前 剔除后 风险比 95%CI P 风险比 95%CI P PASI 90 1.52 （1.06，2.19） 0.02 1.77 （1.57，1.98） <0.00001 PASI 100 2.11 （1.22，3.66） 0.008 2.66 （2.15，3.30） <0.00001 IGA 0或1 1.59 （1.00，2.53） 0.05 1.96 （1.06，3.62） 0.03
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[1] YANG Y W, KELLER J J, LIN H C. Medical comorbidity associated with psoriasis in adults: a population-based study[J]. Br J Dermatol,2011,165(5):1037-1043. doi: 10.1111/j.1365-2133.2011.10494.x [2] RACHAKONDA T D, SCHUPP C W, ARMSTRONG A W. Psoriasis prevalence among adults in the United States[J]. J Am Acad Dermatol,2014,70(3):512-516. doi: 10.1016/j.jaad.2013.11.013 [3] 朱雨雨, 宋承霖, 孙洋. 银屑病发病机制及药物调控研究进展[J]. 药学学报, 2020, 55(7):1393-1400. doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-1071 [4] 中华医学会皮肤性病学分会银屑病专业委员会. 中国银屑病诊疗指南(2018完整版)[J]. 中华皮肤科杂志, 2019, 52(10):667-710. [5] RADKE B. Psoriasis: pathogenesis and treatment[J]. Med Monatsschr Pharm,1993,16(10):312-313. [6] 马晓蕾, 周城, 蔡林, 等. 生物制剂治疗银屑病的研究进展[J]. 临床皮肤科杂志, 2012, 41(9):577-579. doi: 10.3969/j.issn.1000-4963.2012.09.031 [7] REIS J, VENDER R, TORRES T. Bimekizumab: the first dual inhibitor of interleukin (IL)-17A and IL-17F for the treatment of psoriatic disease and ankylosing spondylitis[J]. BioDrugs,2019,33(4):391-399. doi: 10.1007/s40259-019-00361-6 [8] HIGGINS J P T, ALTMAN D G, GØTZSCHE P C, et al. The Cochrane Collaboration's tool for assessing risk of bias in randomised trials[J]. BMJ,2011,343:d5928. doi: 10.1136/bmj.d5928 [9] WARREN R B, BLAUVELT A, BAGEL J, et al. Bimekizumab versus adalimumab in plaque psoriasis[J]. N Engl J Med,2021,385(2):130-141. doi: 10.1056/NEJMoa2102388 [10] REICH K, PAPP K A, BLAUVELT A, et al. Bimekizumab versus ustekinumab for the treatment of moderate to severe plaque psoriasis (BE VIVID): efficacy and safety from a 52-week, multicentre, double-blind, active comparator and placebo controlled phase 3 trial[J]. Lancet,2021,397(10273):487-498. doi: 10.1016/S0140-6736(21)00125-2 [11] PAPP K A, MEROLA J F, GOTTLIEB A B, et al. Dual neutralization of both interleukin 17A and interleukin 17F with bimekizumab in patients with psoriasis: results from BE ABLE 1, a 12-week randomized, double-blinded, placebo-controlled phase 2b trial[J]. J Am Acad Dermatol,2018,79(2):277-286.e10. doi: 10.1016/j.jaad.2018.03.037 [12] REICH K, WARREN R B, LEBWOHL M, et al. Bimekizumab versus secukinumab in plaque psoriasis[J]. N Engl J Med,2021,385(2):142-152. doi: 10.1056/NEJMoa2102383 [13] GORDON K B, FOLEY P, KRUEGER J G, et al. Bimekizumab efficacy and safety in moderate to severe plaque psoriasis (BE READY): a multicentre, double-blind, placebo-controlled, randomised withdrawal phase 3 trial[J]. Lancet,2021,397(10273):475-486. doi: 10.1016/S0140-6736(21)00126-4 [14] 沈盛县. Bimekizumab单抗双重中和白细胞介素-17A和IL-17F治疗中重度斑块状银屑病[J]. 实用皮肤病学杂志, 2019, 12(3):170. [15] 安富荣, 崔岚, 王勤. 阿达木单抗治疗自身免疫疾病的临床研究进展[J]. 中国新药与临床杂志, 2010, 29(6):410-415. [16] 王理, 李兵, 杨森. 乌司奴单抗治疗银屑病的研究进展[J]. 国际皮肤性病学杂志, 2013, 39(6):384-387. [17] 朱冠男, 王刚. 白细胞介素17A在银屑病发病及治疗中的研究进展[J]. 中华皮肤科杂志, 2020, 53(5):390-394. [18] 陈小利, 王萍, 白根龙, 等. 古塞奇尤单抗治疗中重度斑块状银屑病疗效与安全性的meta分析[J]. 重庆医学, 2021, 50(6):1023-1028. doi: 10.3969/j.issn.1671-8348.2021.06.026 [19] 王若珺, 李若瑜. 白细胞介素17A及其受体拮抗剂治疗银屑病的不良反应[J]. 中华皮肤科杂志, 2021, 54(2):170-173. -
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