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相对于传统纳米载体而言，由红细胞、血小板、干细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞以及细菌等构成的新型内源性载体具有生物相容性好、靶向性高的显著优势[1]。但是，该类细胞载体由于自身理化性质导致其无法在特定组织内渗透和摄取。近年来，随着纳米技术与生物技术的交叉融合，研究者从仿生角度出发，通过物理挤出、共孵育和微流体等技术工艺将各类型天然细胞膜与纳米载体内核相结合，制备出体内循环时间长、生物相容性好、胞内细胞器靶向性能高的新型仿生纳米药物载体[2]。本文综述了细胞膜修饰技术的基本原理及几种最为常用的细胞膜修饰纳米载体的特点及应用。
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细胞膜是由磷脂、糖蛋白、糖脂和蛋白质构成的富有弹性的半透性膜，其中，磷脂双分子层是构成细胞膜的基本结构，其在广泛的生物功能中发挥着重要作用。细胞膜的提取包括膜溶解和膜纯化[3]，具体过程由所提取的细胞类型决定。对于无核细胞（如哺乳动物成熟红细胞和血小板），可通过低渗处理或者反复冻融破坏其细胞膜，差速离心去除可溶性蛋白质，然后通过挤压形成由细胞膜构成的囊泡[4]。对于白细胞、癌细胞和干细胞等真核细胞，膜提取过程则相对复杂。首先，需要从组织或血液中分离目标细胞，之后先进行细胞培养[5]，再将培养好的细胞通过低渗裂解、机械膜破坏和蔗糖梯度离心相结合的方法去除细胞核和细胞质，从而分离出细胞膜[6]。分离出的细胞膜用等离子缓冲剂彻底清洗后，通过多孔聚碳酸酯膜挤压形成纳米囊泡[7]。
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内核纳米材料在细胞膜仿生纳米载体技术中至关重要[8]。近年来，各种类型的纳米材料（如聚合物纳米粒、脂质体、二氧化硅、介孔二氧化硅、金粒子、氧化铁、金属-有机骨架、纳米凝胶和黑磷等）已成为细胞膜仿生技术的核心载体。由脂质和聚合物为材料制备的纳米载体因其良好的生物相容性和高载药量，广泛用于制备纳米粒子[9]。无机材料具有成本低、易于进行化学结构修饰及特定光电磁性质的显著优势，可以更好地控制无机颗粒的表面组成、形状和尺寸，并且可以用适当的膜囊进行伪装[8]。最新研究发现，纳米凝胶由于其大孔结构和高负载能力而成为理想的内核载体材料[10]；同时，Chen等[11]利用黑磷优良的光热性能、负电位及生物降解性将其与红细胞膜融合制备成为光热治疗剂，结果表明该方法能够有效抑制乳腺癌细胞的生长。
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目前，常用的生物细胞膜与纳米载体融合方法有薄膜挤压法、超声融合法和电穿孔法。薄膜挤压法借助挤压器通过纳米级聚碳酸酯多孔膜反复挤压，利用机械力使纳米材料与细胞膜相融合[12]，该方法工艺简便，但难以大规模制备。超声融合法是将纳米粒子与细胞膜共孵育后利用超声促进细胞膜的包覆，但是该方法生成的载体颗粒均一性较差[13]。微流控电穿孔法将载体各组分在Y形通道中完全混合，通过电穿孔制备出性质稳定、包覆率高的纳米载体[14]。
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细胞膜纳米粒子的评估包括物理、化学和生物特性3个方面，以确定细胞膜是否成功地包覆在纳米粒子表面。细胞膜包覆的效率取决于纳米粒子的大小、表面电荷和蛋白质组成。细胞膜改变了纳米粒子大小和Zeta电位，透射电子显微镜（TEM）可用于确认细胞膜纳米粒子的形态，与未包覆的纳米粒子相比，粒子直径明显增加。Zeta电位表明了细胞膜包覆前后颗粒表面的电位特征。Fan等[15]以红细胞膜包覆后，颗粒的Zeta电位增加了10mV。另外，可通过动态光散射（DLS）验证细胞膜纳米粒子的粒径分布[16]。细胞膜的仿生功能主要取决于其生物学特性。因此，验证膜的生物活性是至关重要的，从而确保最佳的纳米粒子包覆效能。蛋白免疫印迹法常被用于鉴别包覆于纳米粒上的细胞膜蛋白，从而验证纳米载体的生物特性，Wang等[17]通过该方法证实了红细胞膜特征蛋白CD47存在于被红细胞膜包覆的纳米粒子表面。
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经天然细胞膜包覆后的纳米粒子生物相容性增强，具有特异性识别靶部位、靶组织和靶细胞的特性。近年来，各种类型的天然细胞已被广泛应用于纳米载体制备，如红细胞、血小板、免疫细胞、癌细胞，甚至细菌膜，以大肠杆菌为膜源，组装构建出具有多种功能的生物复合传递系统，发挥其特殊的靶向和治疗作用。
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红细胞由于自身生物特性（例如红细胞表面跨膜蛋白CD47），能够在体内不受免疫系统的攻击[18]，利用红细胞膜包覆纳米粒子制备成的药物载体具有循环时间长和免疫逃避特性等显著优势[19]。Fang等[20]通过挤压法和超声法将红细胞囊泡与叶酸和核苷靶向适体AS1411相融合，结果显示该方法获得的红细胞膜纳米载体能够显著提高肿瘤靶向性和治疗效果。红细胞膜表面有各种成孔毒素相关特异性受体成分，且具有磷脂双分子层结构，因此有广谱的成孔毒素中和作用且生物相容性好。经红细胞膜包覆的纳米粒子可以吸附多种成孔毒素(如α-溶血素、链状溶血素-O等)，并保护红细胞免受溶血[21]。研究显示这些纳米粒子并没有将毒素转移到宿主细胞，确保了生物安全性。同时，将灭活毒素整合到纳米粒子的细胞膜中作为类毒素疫苗，对受到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌攻击的小鼠具有明显保护作用，能显著减少相关肺损伤，并抑制脾脏炎症转录因子的激活。通过利用红细胞血液循环时间长和“自我标记”蛋白的特性，这些仿生纳米粒子可以避免免疫细胞对其捕获。
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血小板具有广泛的抗原和功能蛋白，并在肿瘤转移中发挥重要作用，其被开发成为细胞膜材料[22]，可用于多发性骨髓瘤和血栓治疗、动脉粥样硬化检测、癌症治疗以及控制细菌感染。Wei等[23]用血小板膜包覆纳米粒子以清除体循环中的病理性抗体，这一策略被用来治疗免疫性血小板减少性紫癜，能有效地减少血小板的破坏，并保持正常的止血功能。Ávila等[24]研究发现，用红细胞膜和血小板膜的混合物包覆纳米粒子使其成为优良的解毒剂，赋予纳米粒子许多新的生物学特性，包括结合黏附于血小板的病原体（如金黄色葡萄球菌细菌）以及中和成孔毒素（如志贺毒素和金黄色葡萄球菌）。
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各类免疫细胞（例如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、干细胞及T细胞）能够在机体产生免疫反应的第一时间被招募至特定位置发挥免疫功效[25-26]，使其成为包覆纳米载体的理想载体膜。Xuan等[27]研究发现，经巨噬细胞膜包覆的二氧化硅纳米粒子在体内的循环时间明显延长，并能够提高阿霉素的传递效率和抗癌效果。同时，Xuan等[28]用巨噬细胞膜包覆近红外成像探针（Cy7）载金纳米粒子，能够增加药物在肿瘤组织的积聚，在近红外激光照射下，由巨噬细胞膜包覆的金纳米粒子产生的局部热量可高效抑制肿瘤生长，并选择性地消融热辐射区域内的癌细胞。Zhang等[29]用巨噬细胞膜包覆对酸碱度敏感的聚合物纳米粒子，用于肿瘤靶向化疗，具有响应肿瘤微环境刺激的控释特性。其将紫杉醇传递至靶向位置，发现该载体能够使药物在肿瘤低pH值环境中充分释放。中性粒细胞在免疫反应中扮演重要角色[30]。Gao等[31]研究发现，基于中性粒细胞膜纳米囊泡药物递送系统可选择性地靶向于炎症血管部位释药，以逆转急性肺部炎症。Zhang等[32]将人的外周血中性粒细胞膜包覆在聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）聚合物芯上，构建炎症治疗平台，从而抑制滑膜炎症并减轻炎症性关节炎受试者的关节损伤。此外，Wei等[33]将人T淋巴瘤细胞（SUP-T1）的细胞膜包覆在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）上，T细胞膜包覆纳米粒子后可选择性地与HIV的糖蛋白gp120结合，并抑制gp120诱导的对CD4+T细胞的杀伤。当加入到HIV病毒中时，T细胞膜包覆纳米粒子以剂量依赖性的方式有效地中和外周血单个核细胞和人类单核细胞源性巨噬细胞的病毒感染。通过利用天然T细胞功能，T细胞膜包覆纳米粒子作为一种新的抗HIV感染治疗剂显示出巨大的潜力。干细胞作为一种“万能细胞”，在不同发育阶段都具有靶向肿瘤细胞的特性[34]。Cao等[35]研究了一种新型抗癌药物载体，即包封载药空心二氧化硅纳米颗粒的间充质干细胞（MSCs），由于MSCs天然的高肿瘤亲和力，用于携带光敏剂药物并将其输送至乳腺肿瘤，并通过光动力学疗法抑制肿瘤生长。这种新策略解决了光动力疗法中光敏剂药物在肿瘤中积聚的问题，并成功用于肿瘤靶向治疗。
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癌细胞具有无限复制潜能、免疫逃逸、循环时间长和同源结合能力等独特功能[36]，从而使癌细胞膜成为设计抗癌纳米递药系统的包覆材料[37]。Chen等[38]构建了一个核心−外壳的纳米结构ICNP，由吲哚青绿（ICG）和人乳腺癌细胞膜（MCF-7）外壳组成。ICNP表现出对癌细胞的特异性同源靶向性，具有良好的单分散性、较好的光热响应和优异的荧光/光声成像特性。得益于来自癌细胞膜的同源结合黏附分子的功能化，ICNP显著促进细胞内吞和体内同源靶向肿瘤积聚; 在近红外激光照射下，ICNP表现出高效的光热疗法来根除异种移植肿瘤，具有癌细胞膜同源性的ICNP可以作为肿瘤靶向成像和光疗的仿生纳米平台。Yang等[6]将甘露糖修饰的黑色素瘤细胞膜包覆在一种负载受体7激动剂(咪喹莫特)的PLGA纳米粒子上组成的抗癌疫苗，可使其被树突状细胞更好地摄取，从而触发机体对癌细胞的特异性免疫反应，延缓了肿瘤的发展恶化。Sun等[39]用4T1乳腺癌细胞膜包覆负载紫杉醇的聚合物纳米粒子，结果发现该载体可以选择性地积聚在原发性肿瘤和转移性结节中，血液清除速度较慢，并且显著抑制转移性肿瘤和原发性肿瘤的生长。其研究还可能通过使用癌症患者的肿瘤细胞膜作为药物载体，为转移癌的个性化治疗开辟一条新途径。以上研究可以发现，将不同的肿瘤细胞膜开发为膜包覆材料，利用其特异性的靶向能力，在肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。
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与基于细胞的仿生系统一样，细菌的蛋白质外壳与功能性纳米颗粒结合，广泛应用于药物输送、肿瘤成像和治疗[40]。鉴于其高水平的免疫原性蛋白和佐剂特点，细菌细胞膜在病原体相关分子靶点介导和适应性免疫系统激活的环境中可用于纳米粒子修饰[41]。Gao等[42]用大肠杆菌衍生膜包覆30nm的金纳米粒子并将其注射于小鼠皮下，结果发现这些粒子能被运送到近端引流淋巴结，并能激活树突状细胞。同时，接种了大肠杆菌膜纳米粒子的小鼠比仅接种了外膜囊泡的小鼠表现出更高的抗体亲和力和IFN-γ及IL-17水平，该结果证实被大肠杆菌包覆的纳米粒子载体能够特异性激活T细胞免疫反应。Zhang等[43]将光敏剂原卟啉IX和抗菌肽2结合起来，制备出对细菌光动力疗法失活的PPK颗粒，这些颗粒能够通过静电相互作用和膜渗透结合在细菌细胞上，进而破坏细菌细胞膜组织起到杀菌作用。
细菌细胞膜包覆纳米粒子不仅能简化细菌载药系统，而且能构建纳米级别的靶向载药系统。但是，该方法也对生物安全性提出一些需研究问题，如细菌细胞膜的抗原特性，是否会引起感染相关问题仍需进一步的研究。
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细胞膜仿生纳米粒子将包覆材料和内源性生物材料进行融合，进一步激发从生物学角度设计新型给药系统的创新发展。细胞膜包覆的纳米粒子将在体内药物递送、生物成像和疾病治疗，特别是癌症的诊断和治疗方面显示出许多优势。然而，使用单一类型或常规类型的细胞膜作为包覆材料可能会限制其功能多样性，混合类型的细胞膜与纳米载体共同构建高选择性的靶向药物输送系统具有广泛的研究价值。结合全面的生物特性和功能，整合纳米材料将增强治疗性纳米粒子的体内性能。例如，可以考虑将由抗体、脱氧核糖核酸/核糖核酸、肽、蛋白质和酶组成的简易配体修饰于细胞膜，从而增强精准靶向性能，甚至是协同的治疗作用。尽管细胞膜仿生技术尚未完全实现临床应用，但其明显的优势和丰富的细胞膜来源为其工业化生产和在个体化精准医学中的实施提供了坚实的基础。
Progress in preparation and application of biomimetic nano carriers for cell membrane
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摘要: 由有机或无机纳米材料制备的药物载体系统广泛用于药物靶向递送和疾病的诊断治疗研究。但其存在靶向性差、体内循环时间短、生物相容性欠佳亟需提高等问题。仿生纳米药物系统是以不同种类的细胞膜修饰纳米载体，利用内源性的细胞膜提高载体的体内生物相容性、实现更精准的靶向、甚至由细胞自身的免疫原性产生免疫治疗作用。对细胞膜仿生纳米载体技术的原理、方法及其靶向机制和治疗作用作一综述，为新型给药系统研究提供思路。Abstract: Nanocarriers prepared from organic or inorganic materials are widely used in drug targeting system and diagnosis and treatment of disease. However, there are some problems, such as poor targeting, short circulation time in vivo and improvement in the biocompatibility. Biomimetic nanocarriers has carried out research on the issues, which based on different kinds of cell membrane for the nanocarriers modification, endogenous biofilm improving the biocompatibility of carriers in vivo, more accurate targeting, and even producing immunotherapeutic effect. The principle, method, targeting mechanism and therapeutic effect of biomimetic nano carrier technology of cell membrane have been reviewed in this paper, which provide a new direction for the research of new drug delivery system.
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Key words:
- cell membrane /
- biomimetic nanocarriers /
- drug delivery system /
- biomaterials
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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