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衰老是导致老年性骨质疏松症（SOP）的主要致病因素，其通过促进机体活性氧（ROS）的释放诱导氧化应激，从而降低成骨细胞活性，减少其骨形成[1-2]。D-半乳糖(D-gal)是一种还原糖，当其浓度达到一定水平时，就会诱导机体发生代谢紊乱，释放大量ROS，最终促进衰老相关疾病的发生[3]。同时，过量的D-gal还可诱导骨质变化，类似于SOP和衰老过程中的骨质丢失[4]，严重危害了我国中老年人的身体健康。
巴戟天丸（Bajitianwan，BJTW）首载于《古今医统大全》，原方用于治疗老年性记忆减退。本课题组前期研究同样表明，巴戟天丸可显著改善D-gal致衰老大鼠的骨微结构，防治骨丢失，证明其具有明确的抗骨质疏松作用；同时还发现巴戟天丸可改善D-gal大鼠的记忆损伤，提示其具有抗老年性骨质疏松潜力[5]，然而其在成骨细胞水平上防治D-gal引发骨丢失的作用及机制尚不明确。因此本研究拟采用D-gal损伤成骨细胞，通过成骨细胞活性、氧化应激水平及关键调控通路检测等方法，探究巴戟天丸体外抗老年性骨质疏松症的作用及机制。
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成骨细胞：新生24 hWistar大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（美国Gibco）；MTT（上海博光）；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、ALP试剂盒（南京建成）；ROS检测试剂盒（上海碧云天）；α-MEM培养基（天津灏洋）；AKT、p-AKT抗体（美国CST）、Nrf2、HO-1、NQO1抗体（英国Abcam）。
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采用二次消化法从新生24 hWistar大鼠颅盖骨中分离提取成骨细胞，将原代成骨细胞培养于α-MEM培养基中（10%胎牛血清），置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，取第3~5代成骨细胞进行后续指标检测。
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将细胞以5×103个/孔接种于无菌96孔板中，孵育24 h。空白组和模型组更换新的完全培养基，给药组分别加入含不同浓度的BJTW水提物的完全培养液（0.001、0.01、0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使完全培养基中D-gal浓度达到100 mol/L。培养48 h后，采用MTT法测定细胞增殖水平。
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将细胞以2×104个/孔接种于无菌24孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，给药组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。培养48 h进行染色，于室温进行避光孵育3 d，洗去工作液后拍照。
ALP活性检测：按照“1.3”项的方法进行给药，细胞培养48 h后，取上清液，根据说明书测定ALP活性。
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将细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，根据分组加入含不同浓度的BJTW完全培养液（0.1、1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组加入D-gal母液，使其浓度达到100 mmol/L。培养48 h后，吸弃上清液，参照ROS检测试剂盒说明书，装载稀释后的DCFH-DA探针，37 ℃孵育20 min，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并转移至离心管，空白培养基洗涤3次，用300 ml PBS重新混悬细胞后送往流式细胞仪进行检测。
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将细胞以2×105个/孔接种于6孔板中，孵育24 h细胞完全贴壁后，根据分组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组加入D-gal母液，使完全培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。孵育48 h后，吸去上清液，PBS洗涤2次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白定量。蛋白变性后，经SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜进行转膜，室温封闭后，加入相应的一抗（4 ℃环境过夜），1×TBST洗涤3次，加二抗于室温孵育1 h。1×TBST洗涤3次，采用ECL化学发光试剂盒检测。
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将细胞以1×105个/孔的密度接种于激光共聚焦皿中，根据分组分别加入含不同浓度的BJTW完全培养液（1、10 μg/ml），4 h后模型组和给药组给予D-gal母液进行干预，使培养基中D-gal浓度达到100 mmol/L。于皿中培养48 h后，弃上清液，PBS洗涤2次后，组织固定液固定细胞，30 min后用PBS清洗2次，加入0.5%Triton X-100通透20 min。PBS清洗2次，皿中加入5%BSA工作液，室温封闭1 h。PBS清洗后加入一抗（4 ℃冰箱过夜），PBS洗涤皿底，加入荧光二抗，于室温环境孵育45 min，PBS清洗皿底，加入DAPI染液，避光环境放置20 min，清洗去除多余的染液，激光共聚焦显微镜拍照。
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实验结果用（
$ \bar{\mathrm{x}} $ ±s）表示。采用SPSS 22.0软件、单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法对实验数据进行分析。 -
D-gal损伤可显著抑制成骨细胞的增殖；药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的MTT水平，增强D-gal损伤成骨细胞的增殖（图1A）。
图 1 BJTW对D-gal损伤成骨细胞的增殖（A）、ALP活性（B）及ALP染色（C）的影响（n=4）
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ALP源自成骨细胞的分泌，能够反映骨形成的能力。对给予D-gal干预的成骨细胞所分泌的ALP的活性进行测定。D-gal损伤成骨细胞后，其ALP活性显著降低；药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均可提高D-gal损伤成骨细胞的ALP活性(图1B)。
与此同时，在ALP的催化下，甲苯胺蓝（BCIP）的水解产物会和氯化硝基四氮唑兰（NBT）反应产生不溶的深蓝色至蓝紫色甲瓒结晶。BJTW在0.1、1、10 μg/ml的浓度下均可显著增加培养皿底的甲瓒结晶的颜色深度（图1C），证明其可显著提高D-gal损伤细胞的ALP活性，促进成骨分化。
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如图2所示，D-gal损伤成骨细胞后，胞内ROS活性显著升高。药物干预后，BJTW在0.1、1、10 μg/ml浓度下均可显著降低D-gal损伤成骨细胞内ROS水平，缓解氧化应激，且该作用呈剂量依赖。
图 2 流式细胞仪测BJTW对D-gal损伤成骨细胞内ROS水平的影响（n=3）
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外源性氧化应激会激活细胞内的PI3K/AKT信号通路，使AKT磷酸化水平上升[6]。如图3所示，D-gal损伤成骨细胞后，p-AKT/AKT水平较空白组显著升高；药物干预后，BJTW在1、10 μg/ml浓度下对p-AKT/AKT的水平的促进作用相较模型组表现更为显著。此外，BJTW还可显著促进其下游蛋白Nrf2、HO-1和NQO1的表达，进而激活氧化应激相关PI3K/AKT通路，缓解氧化损伤。
图 3 BJTW对D-gal损伤成骨细胞中Nrf2、p-AKT/AKT、NQO1及HO-1表达的影响（n=3）
Nrf2通路同样是抗氧化的关键通路，在ROS清除方面发挥重要作用。如图4所示，BJTW可显著促进Nrf2的入核表达(图4)，提示BJTW抗氧化、促进骨形成作用与激活Nrf2/AKT通路、促进Nrf2入核有关。
图 4 激光共聚焦测BJTW对D-gal损伤成骨细胞Nrf2表达的影响（n=3）
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成骨细胞主要由骨髓间充质干细胞分化而来，在维持骨稳态和骨重建过程中起着至关重要的作用[7]。与此同时，成骨细胞还是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中经历增殖、分化、矿化和凋亡四个阶段[8-9]。成骨细胞的增殖水平体现骨形成的强弱，其分泌的ALP是成骨细胞分化阶段的关键酶，可介导骨组织矿化[9-10]。ROS是细胞信号传递和其他生理功能所必需的，然而过多的ROS会导致细胞内的氧化还原反应失衡，扰乱正常的生物功能，导致氧化应激[11-12]。本研究中，D-gal损伤成骨细胞后，细胞的增殖及骨形成指标ALP水平明显降低，细胞内活性氧水平显著上升，而巴戟天丸能够显著促进D-gal损伤成骨细胞的增殖能力和ALP活性，并能显著降低细胞内活性氧水平，表明巴戟天丸可通过抑制胞内ROS释放缓解成骨细胞氧化应激，从而增强成骨细胞的活性，以促进骨的形成。
作为主要的氧化应激调控因子，在骨代谢调控中，Nrf2同样起着重要的作用[13-14]。研究发现，敲除Nrf2基因的小鼠，其股骨的骨密度和骨量显著降低，骨小梁面积减少[15]；同时缺失Nrf2会抑制成骨细胞抗氧化酶的表达，提高胞内ROS水平，从而抑制成骨细胞的分化[16]。此外，PI3K/AKT通路作为Nrf2的上游信号通路，在氧化应激调控方面同样起到关键作用[17]。本研究中，药物干预后，巴戟天丸可促进成骨细胞内AKT磷酸化增加，促进Nrf2入核，同时激活下游的HO-1和NQO1的表达，表明巴戟天丸可能通过激活PI3K/AKT和Nrf2信号通路，进而促进通路中相关的蛋白表达，进而增加成骨细胞的抗氧化应激水平，促进骨形成。本研究可为老年性骨质疏松症的临床用药提供一定的实验依据。
Effect and mechanism of Bajitianwan on preventing D-galactose-induced osteoblast bone loss
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摘要:
目的 研究巴戟天丸防治D-半乳糖（D-gal）损伤成骨细胞骨丢失的作用及机制。 方法 采用新生24 h Wistar大鼠提取的原代成骨细胞，利用D-gal对细胞进行干预，并给予巴戟天丸提取物行药物治疗。分别采用MTT法和碱性磷酸酶试剂盒评价细胞的增殖和分化水平；采用DCFH-DA荧光探针对成骨细胞内活性氧（ROS）水平进行测定。采用Western blotting法对磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、蛋白激酶B（AKT）、血红素氧合酶1（HO-1）、醌NADPH脱氢酶1（NQO1）等氧化相关蛋白的表达进行检测，并采用免疫荧光法测定细胞核因子E2相关因子2（Nrf2）的核内表达水平。 结果 巴戟天丸能显著提高D-gal干预细胞的增殖水平和ALP活性，并显著降低细胞内ROS水平。巴戟天丸能够显著促进细胞AKT蛋白的磷酸化，提高HO-1、NQO1的表达水平，进而激活PI3K/AKT信号通路。此外，巴戟天丸提取物还可显著促进成骨细胞核内Nrf2的表达，激活Nrf2信号通路，促进骨形成。 结论 本研究首次明确了巴戟天丸可防治D-半乳糖损伤引起的成骨细胞骨丢失，其作用机制可能与调控PI3K/AKT和Nrf2信号通路关联的氧化应激有关。 Abstract:Objective To explore the effect and mechanism of Bajitianwan on preventing D-galactose (D-gal)-induced osteoblast bone loss. Methods Osteoblasts isolated from 24 h old Wistar rats were injured by D-gal and intervened with Bajitianwan extract. The osteoblastic proliferation and differentiation were determined by MTT and alkaline phosphatase (ALP), respectively. The cell reactive oxygen species (ROS) levels were detected by DCFH-DA fluorescent probes. The expression of cellular oxidation-related protein nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), phosphorylated protein kinase B (p-AKT), protein kinase B (AKT), heme oxygenase-1 (HO-1), and NADPH quinone oxidoreductase 1 (NQO1) were detected by Western blotting. The intranuclear expression of Nrf2 protein was measured by immunofluorescence. Results Bajitianwan extract had significantly increased the osteoblastic proliferation and differentiation, and significantly reduced the intracellular ROS level. Bajitianwan extract had activated the PI3K/AKT pathway via activating the phosphorylation of AKT in osteoblasts, and promoted NQO1 and HO-1 expression. In addition, Bajitianwan had significantly promoted the expression of Nrf2 in the nucleus of osteoblasts, activating Nrf2 signaling pathway, and further promoted bone formation. Conclusion This study confirmed that Bajitianwan could prevent D-gal injured osteoblastic bone loss for the first time. The mechanism might be related to the regulation of oxidative stress associated PI3K/AKT and Nrf2 signaling pathway. -
Key words:
- Bajitianwan /
- D-galactose /
- osteoblast /
- reactive oxygen species /
- Nrf2
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流感是一种严重的上呼吸道病毒感染，由于其高毒力和突变率，该病毒仍然是对公众健康的主要威胁。据美国疾病控制与预防中心和世界卫生组织估计，每年有多达65 万人死于季节性流感引起的呼吸道疾病[1]。传统中医药预防和治疗流感病毒导致的感染（如呼吸道肺炎和支气管炎）已成为中国临床上常规治疗策略，发挥了独特的医疗优势[2,3]。
感冒安颗粒是由金银花、连翘、板蓝根、拳参、桑叶、紫苏和荆芥等七味中药制成的复方制剂，临床应用30 多年，具有疏散风邪，解表退热功能，其预防和治疗呼吸道感染的作用已得到很好的临床验证，特别是在病毒感染初期的治疗效果尤其显著，但药效物质基础并不清楚。目前，建立了TLC法对方中的板蓝根和连翘两味药材进行特征鉴别；同时对方中各药味的共有成分绿原酸和齐墩果酸也建立了TLC鉴别方法。在含量限度方面，则建立了制剂中连翘酯苷A的HPLC法。尽管这些获批的标准已用于制剂常规质量控制，但尚需进一步进行质量评价，以期更客观、准确地反映感冒安颗粒的临床疗效。
由于中药复方复杂的化学成分，它的药理作用是通过多靶点、多途径而实现的。流感病毒感染的病理生理过程主要是病毒的直接作用和宿主免疫反应损伤（如细胞因子风暴所致的炎性损伤和ROS导致的氧化应激损伤）的结果[2,4]。为了研究感冒安颗粒临床效果的药效物质基础，我们对组方各药味的化学成分进行了文献追踪，发现方中药味含有多种黄酮类成分，如异槲皮苷、芦丁、木樨草素及木樨草苷等[5-9]。而黄酮类成分对流感病毒的作用越来越受到关注[10,11]。异槲皮苷抑制流感病毒A和B的复制，与抗病毒药amantadine或者oseltamivir合用可抑制它们导致的耐药病毒出现[12]。槲皮素与流感病毒A H1N1（A/PR/8/34）的神经酰胺酶的结合与zanamivir相当，体内研究也证实了其抗流感病毒能力，可作为抗甲型H1N1流感的有效先导化合物[13]。Zima研究认为木犀草素及其同源物是强效流感核酸内切酶抑制剂，揭示黄酮类化合物的抗流感作用[14]。鉴于此，本研究在总黄酮含量测定的基础上[15]，采用HPLC-MS/MS方法建立5 种黄酮类成分的定量方法，不仅为制剂质量评价提供方法学，也为进一步研究感冒安颗粒防治流感病毒引起的呼吸道感染机制奠定物质基础。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS仪，配以Triple Quad B.02.01（B2043.12）数据处理软件（美国安捷伦公司）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；DL-720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。1.2 试药
感冒安颗粒（本院院内制剂，批号110418、110704、111025、111121、111130、111221、120131、120201、120207、120214）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，供UV法测定，含量以92.5 %计，批号：100080-200707）；金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以93.9 %计，批号：111521-201004）；木犀草素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111520-200504）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100081-200406）；异槲皮苷对照品（成都曼斯特生物制品有限公司，纯度>99.0 %，批号：MUST-10021901）；甲醇为色谱纯；甲酸为分析纯；水为蒸馏水。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素对照品各适量，用甲醇溶解，摇匀，各配制成500 μg/ml的对照品贮备液。分别精密量取5种对照品贮备液适量，稀释成浓度如下：分别含芦丁0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml，金丝桃苷0.002、0.008、0.020、0.032、0.044、0.056、0.080 μg/ml，异槲皮苷0.03、0.10、0.25、0.45、0.65、0.95、2.00 μg/ml，槲皮素0.02、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.70 μg/ml，木犀草素0.012、0.026、0.040、0.054、0.082、0.096、0.200 μg/ml的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备
按已优化的黄酮提取方法进行[15]。取样品约0.5 g，精密称定，置量瓶中，加70 %甲醇35 ml，超声提取30 min，放冷，过滤，滤液加70 %甲醇溶液定容至50 ml，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
2.2 色谱-质谱条件
色谱条件：采用Kromasil C 18（4.6 mm×150 mm，5 μm，100 Å）色谱柱；甲醇（A）- 0.1 %甲酸（B）作为流动相，按0～20 min，35 % A；20～40 min，45 % A梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾负离子化（ESI−）源：毛细管电压 3.0 kV；气体温度 350 ℃，气体流速 10 L/min，雾化气压 35 psi。多反应模式（MRM）监测。5种黄酮检测的离子对：芦丁m/z 609.1→300.1、金丝桃苷和异槲皮苷m/z 463.0→300.1、槲皮素m/z 301.0→151.0、木犀草素m/z 285.0→132.9。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测限和定量限
采用上述色谱条件，每个待测化合物对照品用70%甲醇溶液进行系列稀释，分别以信噪比（S/N）等于3和10确定各自的检测限和定量限。结果见表1。
表 1 5种黄酮成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限黄酮化合物 线性方程 相关系数
r线性范围
（ng/ml）检测限
（ng/ml）定量限
（ng/ml）芦丁 Y=24 527X–162.17 0.999 7 250~8 000 0.025 0.50 金丝桃苷 Y=34 123X– 1.7381 0.999 1 2~80 0.005 0.01 异槲皮苷 Y=29 935X+1 597.80 0.999 1 30 ~2 000 0.02 0.50 槲皮素 Y=19 667X+370.71 0.999 2 20~700 0.02 0.10 木犀草素 Y=33 076X–177.98 0.999 7 12~200 0.005 0.01 2.3.2 线性范围考察
精密量取“2.1.1”项下配制的5 种黄酮成分的对照品混合溶液，照“2.2”项下进样测定，记录各待测组分的峰面积积分值。横坐标为黄酮成分质量浓度（X，ng/ml），纵坐标为峰面积（Y），进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果见表1，表明5 种黄酮成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 精密度试验
精密吸取供试品溶液（批号
120131 ），照“2.2”项下操作，进样，连续测定5 次和连续测定5 d，记录各待测组分的峰面积积分值，计算日内、日间RSD。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的日内精密度RSD分别为1.09 %、1.42 %、1.69 %、0.86 %、1.27 %（n=5），日间精密度RSD分别为1.85 %、1.76 %、1.43 %、2.01 %、1.90 %（n=5），表明仪器精密度良好。2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号
120131 ）5 份，各0.5 g，精密称定，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，并进行含量测定。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的含量分别为260.16、1.84、19.76、13.39、3.73 μg/g（n=5），RSD分别为1.51 %、1.73 %、0.90 %、1.44 %、1.68 %（n=5），表明方法的重复性良好。2.3.5 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号120131）9 份，每份约0.5 g，精密称定，各精密加入对照品贮备液适量，使已知样品中加入的相当对照品量分别含芦丁140.00 μg、金丝桃苷0.90 μg、异槲皮苷10.00 μg、槲皮素7.00 μg、木犀草素1.90 μg的各对照品贮备液，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算加样回收率。结果显示，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素的平均加样回收率分别为：102.06%、101.60%、100.63%、102.81%、101.80%（n=9），RSD分别为1.56%、1.93%、0.67%、2.07%、1.84%（n=9）。
2.3.6 样品含量测定
取10 个批号的感冒安颗粒，分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，照“2.2”项下操作，进样，测定峰面积积分值，计算含量，结果见表2。
表 2 不同批号感冒安颗粒含量测定结果（$\bar x $ ±s, n=3）批号 芦丁 金丝桃苷 异槲皮苷 槲皮素 木犀草素 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 含量（μg/g） RSD（%） 110418 479.83±1.99 0.41 0.855±0.004 0.49 20.54±0.25 1.23 14.83±0.05 0.31 3.46±0.06 1.70 110704 198.98±3.01 1.52 0.596±0.006 1.05 11.79±0.20 1.68 15.31±0.13 0.86 4.51±0.01 0.19 111025 32.23±0.26 0.83 0.993±0.012 1.26 13.31±0.00 0.02 6.53±0.04 0.55 5.15±0.08 1.58 111121 69.18±1.03 1.51 0.499±0.006 1.26 13.36±0.21 1.56 8.04±0.14 1.69 5.65±0.07 1.19 111130 67.53±0.27 0.40 0.533±0.008 1.57 13.36±0.21 1.54 7.48±0.12 1.62 5.42±0.06 1.15 111221 275.38±3.61 1.31 0.291±0.002 0.73 11.44±0.02 0.21 15.74±0.02 0.14 6.51±0.02 0.24 120131 264.55±0.51 0.19 1.825±0.012 0.68 20.29±0.04 0.17 13.66±0.02 1.52 3.78±0.01 0.26 120201 239.19±1.55 0.65 0.593±0.010 1.76 18.95±0.06 0.33 18.41±0.21 1.16 3.86±0.03 0.81 120207 109.20±2.14 1.97 0.503±0.004 0.83 18.00±0.21 1.16 6.72±0.08 1.22 4.21±0.02 0.37 120214 108.93±0.59 0.54 0.461±0.002 0.45 17.67±0.10 0.01 6.32±0.08 1.19 4.73±0.01 0.11 3. 讨论
3.1 MS/MS条件的优化
为了获得良好的MS结果，优化了检测的离子模式、碎裂电压、碰撞能量等参数，以获得高灵敏度的分子离子和碎片离子。结果显示，ESI采用负离子模式可使待测的黄酮成分有更高的灵敏度。对照品混合液经产物离子扫描显示，芦丁的主要碎片为m/z：300.1、271.0；金丝桃苷和异槲皮苷的主要碎片为m/z：300.1、270.8；槲皮素的主要碎片为m/z：178.6、151.0、120.9、106.9；木犀草素的主要碎片为m/z：150.9、132.9、106.8。依据定量碎片离子选择原则，从远离母离子、裂解方式稳定、碎片离子有足够的丰度等方面进行考察，最终选择的碎裂电压、碰撞能量和定量离子如表3所示。由于金丝桃苷和异槲皮苷是结构异构体，它们有相同分子离子峰[M-H]− m/z 463，MS/MS图谱中有相同的产物离子峰m/z 300，这两个化合物通过比较两者在HPLC中的保留时间进行定位。
表 3 5种黄酮化合物的质谱检测参数黄酮化合物 母离子 产物离子 碰撞电压
（U/ V）碰撞能量
（U/ eV）芦丁 609.1 300.1 190 38 金丝桃苷 463.0 300.1 170 25 异槲皮苷 463.0 300.1 170 25 槲皮素 301.0 151.0 130 19 木犀草素 285.0 132.9 150 37 3.2 定量方法学验证
采用已优化的测定条件，感冒安颗粒中5 种黄酮类成分通过与各自标准对照品的保留时间和MS谱图的比较得以鉴别和确认，结果见图1。由于金丝桃苷、异槲皮苷和芦丁均是以槲皮素为苷元，结合不同的糖而形成，金丝桃苷与异槲皮苷还具有相同的分子量，它们的保留时间非常相近。采用HPLC-UV或二极管阵列检测的方法专属性不强，待测成分间相互干扰，很难保证测定结果的准确性。而本研究采用MS/MS-MRM模式测定，实现了准确定量的目的。
图 1 感冒安颗粒提取液5 种黄酮成分的MRM色谱图A. 芦丁的MRM色谱图；B.金丝桃苷、异槲皮素的MRM色谱图；C.槲皮素的MRM色谱图；D.木犀草素的MRM色谱图；1.芦丁；2. 金丝桃苷；3.异槲皮苷；4.槲皮素；5.木犀草素3.3 结果分析
本研究采用经优化的超声提取法提取感冒安颗粒中黄酮成分，用所建立的LC-MS/MS方法测定了10 个批号样品，结果显示，每批样品中均为芦丁含量最高，金丝桃苷含量最低；批间样品同种黄酮成分含量存在差异。为了保证感冒安颗粒质量的稳定性，临床疗效的一致性，对其中的主要黄酮成分可以考虑设定最低限度要求。感冒安颗粒是经传统水提醇沉工艺制得的稠膏制粒而成，我们以往的研究表明，制剂中含有大量的酸性成分[16]，工艺提取过程中的高温、偏低的pH值可能导致金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等苷类黄酮化合物发生水解反应。本研究将3种黄酮苷对照品及生产工艺获得的稠膏经2 % HCl溶液在80 ℃水浴加热处理30 min，进行HPLC-MS/MS分析，处理后的稠膏样品中金丝桃苷和芦丁含量降低，异槲皮苷和槲皮素含量增加；在3种黄酮苷对照品水解液中，均有槲皮素产生；除此之外，芦丁对照品溶液水解还出现了异槲皮苷。由此可以推测，感冒安颗粒的制备工艺可能导致黄酮类成分的水解和转化。
本研究采用HPLC-MS/MS同时测定了感冒安颗粒中5 种黄酮类成分的含量，所建立方法的专属性、灵敏度、精密度和准确性均已得到确证，达到了同时测定多种结构相似的黄酮类成分的目的，为其质量标准的建立提供了方法学依据。我们的研究已经证明感冒安颗粒中含有多种酚酸类成分[17]，本研究又测定了其中的黄酮类成分。这些成分可能共同作用于流感病毒在宿主内复制的多环节，或者改善流感病毒对机体的炎性损伤，降低炎性细胞因子表达，改善氧化应激损伤，提高机体的免疫力等，充分发挥其多途径和多靶点作用优势，为其预防和治疗流感病毒所致呼吸道感染性疾病奠定物质基础。
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图 1 BJTW对D-gal损伤成骨细胞的增殖（A）、ALP活性（B）及ALP染色（C）的影响（n=4）
**P<0.01，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较
图 3 BJTW对D-gal损伤成骨细胞中Nrf2、p-AKT/AKT、NQO1及HO-1表达的影响（n=3）
*P<0.05，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较
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