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近红外光响应的肿瘤光热治疗因具有组织穿透性强、生物安全性好等优点，已引起广泛关注。作为新兴的光敏剂，八丁氧基酞菁钯具有成本低、易合成、毒性低等优点，在肿瘤光动力治疗(PDT)领域表现出巨大潜力。由于高渗透强滞留效应(EPR)，脂质体作为药物载体可靶向集中于肿瘤组织，同时ROS可氧化破坏脂质双层膜，促进包载药物在肿瘤组织的精准释放。本实验以雷帕霉素为模型药物，采用课题组合成的八丁氧基酞菁钯为光敏剂，制备近红外光触发的ROS响应型雷帕霉素脂质体，并对其理化性质及体外释放特性进行考察。
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R206D旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；730 nm/1500 mW激光器(长春市亮丽光电有限公司)；U3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司)；JY92.IIDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；马尔文激光粒度仪(英国Malvern公司)。
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二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC，Avanti公司)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DLPC，Avanti公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000，Lipoid 公司)；胆固醇、雷帕霉素（MCE公司）、八丁氧基酞菁钯[PdPC(OBu)8，实验室自制]；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone 公司）。
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采用薄膜分散法制备脂质体。精密称取DSPC、DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000、雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯置于250 ml圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解。65 ℃水浴，65 r/min减压旋转蒸发形成均匀薄膜，取PBS溶液4 ml水化。吸出脂质体，用PBS稀释至5 ml，200 W探头超声5 min，即得近红外光触发ROS响应型雷帕霉素脂质体。空白脂质体除不加雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯外，制备方法相同。
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以脂质体成膜及水化效果、药物包封率及载药量、包载药物光敏释放效率为指标，从DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000处方量及PdPC(OBu)8投药量对光敏ROS脂质体处方进行单因素考察。
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取少量脂质体溶液，用去离子水稀释，使用马尔文激光粒度仪测量脂质体粒径、PDI及Zeta电位。
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色谱柱：Agilent TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（84∶16）；流速1.0 ml/min；检测波长：278 nm；柱温：50 ℃；进样量：20 μl。
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精密称取雷帕霉素2.50 mg置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为250 μg/ml储备液。精密吸取储备液800、400、200、100、40、20、10、4 μl，分别于5 ml容量瓶中用甲醇定容。制成浓度为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/ml的对照品溶液。HPLC仪检测并记录峰面积A，绘制出峰面积A与对照品质量浓度C的标准曲线并进行线性回归分析。
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吸取雷帕霉素脂质体溶液500 μl加入5 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后，以10 000 r/min进行超速离心10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，制得供试品溶液。吸取空白脂质体按同法制备阴性对照品溶液。分别取对照品、阴性对照品、供试品按照“1.6.1”项下方法进样，记录HPLC图。
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选取低、中、高3个浓度的对照品溶液，1 d内重复进样考察日内精密度，连续3 d每天测定一次，考察日间精密度。
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吸取用于制备选定的低、中、高3个浓度对照品溶液的储备液于不同的5 ml容量瓶中，同一浓度共制备3个样品。向每个容量瓶中加入100 μl空白脂质体溶液，再用甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后，进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测。
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包封率与载药量是评价脂质体的重要指标。包封率是脂质体中包封药物量与脂质体中药物总量的百分比。载药量是脂质体中药物量与脂质体总量的百分比。
精密吸取脂质体500 μl置于5 ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测，计算得出脂质体中药物总量。
精密吸取适量脂质体溶液，先进行低速离心[3]，3 000 r/min，15 min。取上层液体500 μl置于5 ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测，计算出脂质体中包封药物量。
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采用反向透析法测定雷帕霉素脂质体光敏释放特性。以30 ml 20%乙醇为释放介质，加入50 ml离心管内；另吸取1 ml释放介质并加入透析袋内，将透析袋两端扎紧后放入离心管中；取300 μl雷帕霉素脂质体，用730 nm，1 W/cm2近红外光照射5 min后，转移至释放介质；将离心管移至摇床内，设置摇床条件为37 ℃，180 r/min。分别在1、2、4、8、12 h从透析袋内取样200 μl，用于样品测定和累积释放率的计算。取样后即补加新鲜释放介质200 μl，保持释放介质总量不变。以时间(t)为横坐标，以累积释放率(Q%)为纵坐标，绘制释放曲线。
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回归方程为A = 0.6240 C-0.1738 （r = 0.999 5）。雷帕霉素在0.2～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
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按照“1.6.1”项下色谱条件测定，雷帕霉素出峰良好，保留时间为7.8 min。表明此方法专属性良好（图1）。
图 1 雷帕霉素的专属性
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由表1可知，雷帕霉素在低、中、高3个浓度都具有较好的准确度，日间精密度和日内精密度值均小于5%，表明该方法可用于雷帕霉素的含量测定。
表 1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 日内精密度 日间精密度 检测值（μg/ml） RSD(%) 检测值（μg/ml） RSD(%) 0.50 0.58±0.01 1.62 0.58±0.01 1.13 2.00 1.95±0.02 0.56 1.96±0.01 0.49 10.00 9.36±0.04 0.40 10.02±0.09 0.87 -
由表2可知，雷帕霉素在低、中、高3个浓度的回收率为97.64%～98.62%，符合95%～105%的范围，且RSD值均小于1%，表明该提取方法稳定可靠。
表 2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 检测值（μg/ml） 回收率(%） RSD(%) 0.50 0.57±1.54 113.47 1.69 2.00 1.93±0.02 96.48 0.82 10.00 9.82±0.05 98.21 0.52 -
由表3可知，包含不同摩尔量DLPC的处方制得的脂质体，成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%；脂质体体外释放试验，光照12 h后，测得雷帕霉素药物累积释放率>60%（图2A）。当DLPC含量较低时（DSPC∶DLPC=69∶1），雷帕霉素释放速率明显低于其他处方。随着DLPC含量的增加，雷帕霉素释放速率及12 h内累积释放率并无明显增加。
表 3 不同摩尔量DLPC脂质体的表征
DSPC:DLPC
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 69∶1 均匀 无沉淀 139.7 0.051 −12.1 98.71 1.11 65∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 60∶10 均匀 无沉淀 143.4 0.035 −13.0 98.43 1.15 50∶20 均匀 无沉淀 126.7 0.165 −14.9 92.64 2.27 40∶30 均匀 无沉淀 120.5 0.173 −14.6 92.94 2.22 -
由表4可知，PC（DSPC+DLPC）与胆固醇之比过大（70∶10）或过小（70∶40），脂质体都不能成膜。当PC与胆固醇之比为70∶20、70∶25、70∶30时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量在1%左右。在进行脂质体体外释放实验中，测得12 h后雷帕霉素药物累积释放率>60%（图2B）。
表 4 不同摩尔量胆固醇脂质体的表征
PC∶胆固醇
(mol∶mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶10 不均匀 — — — — — — 70∶20 均匀 无沉淀 119.4 0.108 −11.0 96.69 0.96 70∶25 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶30 均匀 无沉淀 147.7 0.095 −12.7 94.56 0.88 70∶40 不成膜 — — — — — — 
图 2 雷帕霉素光敏释放特性考察
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由表5可知，当DSPE-PEG2000用量较小时，脂质体不能成膜。当PC与DSPE-PEG2000之比为70∶5、70∶10、70∶15时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中，摩尔比70∶5组测得雷帕霉素药物累积释放率>60%，其余两组药物累积释放率在33%左右（图2C）。
表 5 不同摩尔量DSPE-PEG2000脂质体的表征
PC: DSPE-PEG2000
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶0 不成膜 — — — — — — 70∶1 不成膜 — — — — — — 70∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶10 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.37 70∶15 均匀 无沉淀 108.9 0.197 −11.0 97.07 1.34 -
由表6可知，当PdPC(OBu)8用量较大（质量比1∶50），脂质体不能成膜。当PdPC(OBu)8与PC质量之比为1∶100、1∶200、1∶300、1∶400，测得粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中，质量比1∶100、1∶200组释放效率高于其余两组，在60%左右（图2D）。
表 6 不同用量PdPC(OBu)8脂质体的表征
PdPC(OBu)8 :PC
(m:m)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 1∶400 均匀 无沉淀 179.3 0.140 −12.3 93.92 1.15 1∶300 均匀 无沉淀 157.4 0.143 −11.5 94.23 1.16 1∶200 均匀 无沉淀 145.9 0.142 −14.3 93.26 1.19 1∶100 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.23 1∶50 不均匀 沉淀 — — — — — -
DLPC是一种人工合成的不饱和磷脂，在制成的脂质体中，DLPC将均匀分散在脂质双分子层膜上。当有ROS存在时，DLPC结构中的不饱和碳碳双键可被氧化，使脂质膜结构遭到破坏，促进包载药物的释放。光敏剂可在特定波长光照射下产生ROS，在肿瘤疾病的光动力治疗中得到广泛应用。但光敏剂自身潜在的光毒性和溶解性差是其突出缺陷。本文将光敏剂包载在脂质体中可以减少潜在的细胞毒性，同时可增加其溶解度。在研究脂质体中雷帕霉素释放的释放介质确定上，文献[2,4-5]中提供了多种选择。预实验显示，20%乙醇溶液作为释放介质时，不仅克服了脂溶性药物雷帕霉素在水中溶解性差的缺点，同时也使得在进行HPLC检测时干扰峰较少。综上所述，本研究成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体，表征结果较好。在短时间特定波长照射后，可实现脂溶性药物的快速释放。
Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes
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摘要:
目的 研究光敏活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）响应型雷帕霉素脂质体的制备工艺及其性质，旨在开发一种稳定高效的刺激响应型脂质体载体。 方法 采用薄膜分散法制备雷帕霉素脂质体；马尔文激光粒度仪测定其粒径及Zeta电位；利用HPLC法建立雷帕霉素含量测定方法；经近红外光照射后，采用反向透析法考察雷帕霉素脂质体的体外释放特性。 结果 雷帕霉素脂质体粒径<200 nm，PDI值<0.200；雷帕霉素在0.2～40 μg/ml范围与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9995；雷帕霉素脂质体包封率>94.20%；经730 nm近红外光照射5 min后，雷帕霉素脂质体12 h内体外释放率可达60%。 结论 成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体，具有较高的包封率和体外刺激响应效率。 Abstract:Objective To study the preparation process and properties of photosensitive ROS (Reactive oxygen species) responsive rapamycin liposome, and to develop a stable and efficient stimulus-responsive liposome carrier. Methods Rapamycin liposomes were prepared by thin film dispersion method. The particle size and Zeta potential were determined by Malvern laser particle size analyzer. An assay method for rapamycin was established by HPLC. In vitro release characteristics of rapamycin liposomes were investigated by reverse dialysis after irradiation with near-infrared light. Results The particle size of rapamycin liposome was less than 200 nm and the PDI value was less than 0.200. Rapamycin showed a good linear relationship with peak area in the range of 0.2-40 μg/ml, with the correlation coefficient of 0.9995. Encapsulation rate of rapamycin liposomes was > 94.20%. The release efficiency of rapamycin liposomes reached 60% within 12 h after irradiation with 730 nm near infrared light for 5 min. Conclusion Photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes were successfully prepared, which had high encapsulation rate and stimulation response efficiency in vitro. -
Key words:
- liposome /
- rapamycin /
- near infrared light /
- ROS /
- release in vitro
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1. 电离辐射的危害
随着全球经济的高速发展和科技的不断进步，核工业在军事、医疗等领域得到全面发展，但伴随而来的是对从业人员和附近居民造成严重的辐射危害。
辐射是指能量以电磁波或粒子的形式向外传播的现象，可分为电离辐射和非电离辐射。拥有足够高能量而使原子电离的辐射为电离辐射，它包括X射线、α射线、β射线、γ射线等，具有潜在的致癌性。非电离辐射能量较低，不会电离物质而会使物质内粒子运动，包括红外线、紫外线和微波等[1]。
辐射可引起全身性的放射病，几乎所有系统、器官均可发生病理性改变，其中以神经系统、消化系统和造血器官的改变最为明显，会诱发心血管疾病、糖尿病甚至癌突变。辐射对机体的损伤可分为急性和慢性放射性损伤。短时间内接受高剂量的照射，可引起机体的急性损伤，常见于核事故和放射治疗患者。剂量低于1 Gy时少数会出现轻微症状，剂量在1~10 Gy时，会出现造血型急性放射病；剂量超过10 Gy，会出现高致死率[2]。而长期接受超剂量的全身或局部照射，可引起慢性放射病，如皮肤损伤、造血障碍、白细胞减少、生育功能受损等。此外，辐射还能直接导致视力下降、视网膜脱落，诱发孕妇流产、不育、畸胎、儿童发育不足等[3]。
2 抗辐射天然产物的作用机制[4]
抗辐射药物是指在辐射前或后给予药物预防或治疗，可减轻或修复辐射损伤的药物。现有的抗辐射化学合成药物主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物[5]，因其毒副作用较大而应用受限，近年来天然产物因其毒副作用小、多成分多靶点的独特优势受到广泛的关注。目前认为抗辐射天然产物的作用机制主要有以下4个方面。
2.1 防护DNA损伤
辐射损伤可破坏DNA分子的结构与功能，导致DNA碱基破坏、DNA分子间交联、DNA双链或单链断裂、糖基破坏等。此外，辐射还可导致细胞周期改变以及DNA合成抑制，直接影响细胞增殖。抗辐射天然产物可通过减轻或抑制辐射致细胞周期的缩短，避免或修复DNA损伤而起辐射防护作用。
2.2 清除自由基
人体产生的80%自由基是由水分子组成的。辐射可引起水分子生成强活性的氧化自由基，主要包括·OH、
${\rm{O}}^-_2 $ 、H2O2、·NO等，其中，·OH氧化性最强，可导致组织细胞产生脂质过氧化物[6]。人体由于自由基的产生造成的破坏主要有3个方面：破坏细胞膜；使血清抗蛋白酶失去活性；损伤基因导致细胞变异，如自由基和生物大分子的结合，导致DNA主链断裂或碱基破坏，通过氧化性降解使得多糖链断裂，形成脱氢自由基，破坏细胞膜上的多糖结构[7]。现代研究表明，大多数抗辐射天然产物具有清除多种自由基作用，能降低氧化酶活性，抑制细胞过氧化物的产生。2.3 保护免疫系统
辐射主要损伤骨髓、胸腺和脾脏等免疫器官以及淋巴细胞等。崔玉芳等[8]发现辐射对免疫系统的损伤主要表现为两个特点——早期损伤严重和后期恢复缓慢。在辐射早期脾脏T、B淋巴细胞数量迅速减少，丝裂原反应明显降低，而在受照射1年后，小鼠的免疫组织和外周血淋巴细胞凋亡率与正常水平相比仍较高，小鼠T淋巴细胞免疫功能仍未恢复。促进淋巴细胞增殖，抑制胸腺和脾脏细胞凋亡等是抗辐射损伤的有效途径。
2.4 保护造血系统
造血组织是辐射的敏感组织，机体受到辐射后，造血细胞会出现功能低下甚至死亡现象，其中，造血干细胞、粒系祖细胞、红系祖细胞是辐射攻击的主要靶细胞，外周血细胞的数量随着照射剂量的增加而减少，其形态和功能也会随之发生改变[1]。因此，改善造血微环境，促进白细胞增殖，修复骨髓造血功能等有助于保护造血系统，修复辐射损伤。
3. 抗辐射天然产物
3.1 多糖类化合物
天然多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。它们是一类具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗炎、抗疲劳、抗衰老作用的生物大分子[9]。关于多糖的抗辐射作用的机制尚不清楚，一般认为与多糖的抗氧化，对造血系统的保护，引起免疫系统的效应增强以及诱导产生某些细胞因子等作用有关。
3.1.1 植物多糖
研究表明，大多数植物多糖有较为显著的抗辐射作用，能提高辐射诱导损伤的防护能力，改善辐射诱导的氧化损伤。其辅助保护辐射损伤的作用机制复杂，一般推测与其修复DNA损伤、消除自由基、增强免疫功能等有关[10]。张乃珣等[11]研究发现，酸性黑木耳多糖(AAP)和红松球果多酚的联合使用可以有效地清除体内自由基，降低自由基对体内DNA造成的损伤，显著提高对60Co γ射线诱导氧化损伤的防护能力。此外，白海娜等[12]发现原花青素与黑木耳多糖（AAP-4）同样有协同防护辐射诱导氧化损伤的作用。徐俊杰等[13]研究山药多糖对低强度连续微波辐射致小鼠免疫系统功能损伤的保护作用，发现正常动物组与辐射损伤组相比，不同剂量(200、400、800 mg/kg)的山药多糖可提高巨噬细胞的吞噬指数、T淋巴细胞的增殖刺激指数和血清IgG水平，并降低血清IL-4水平。表明山药多糖能明显改善低强度连续微波辐射对小鼠免疫系统的损害。胡淼等[14]报道，预先给药黑大蒜多糖（150~600 mg/kg）可减轻X射线辐射对小鼠免疫器官和全血白细胞、血小板的影响，提高脾脏的代偿性造血增殖能力，提高抗氧化酶水平，具有较好的辐射防护作用。Zhang等[15]发现大黄多糖(RTP)通过调控Nrf2及其下游蛋白HO-1，显著降低细胞凋亡和炎症因子，从而显著改善辐射诱导的肠道损伤。
3.1.2 动物多糖
国内外学者从动物体内提取出不同种类的多糖，尤其是海洋动物，如虾蟹动物的甲壳质、河蚌多糖、鲍鱼多糖等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等生物活性[16]。
3.1.3 微生物多糖
研究发现微生物中，尤其生活在高压、高辐射环境中的藻类，其多糖有着较为特殊的结构与生理特性，大多有较好的抗辐射效果。Kim等[17]在探讨低分子量岩藻多糖（LMF）对中波紫外线诱导的光老化的保护作用时发现，持续15周的中高剂量（2.0、1.0 mg/cm2）LMF治疗可对受到中波紫外线照射的小鼠光老化起到明显的保护作用，可抑制皱纹形成，皮肤水肿以及中性粒细胞在光老化病灶上的聚集。杨凯业等[18]报道称铁皮石斛多糖、褐藻多糖、灵芝多糖、竹荪多糖在50 mg/L的质量浓度下的复合作用可抑制紫外线辐射诱导的皮肤细胞光老化作用。
3.2 多酚类化合物
植物多酚是广泛存在于植物体内的一类次生代谢产物，包括黄酮类、花色苷类和酚酸类。研究表明，多酚类化合物含有多个酚羟基，具有显著的清除自由基能力，能减轻自由基对机体的伤害，从而起到辐射防护作用[19]。
Lekmine[20]等评价用阿尔及利亚南部特有植物Astragalus gombiformis Pomel地上部分制备的丁醇提取物的药理活性，采用防晒系数(SPF)等评价Astragalus gombiformis Pomel的光保护作用和抗氧化能力，结果表明提取物（SPF=37.78±0.85，SPF值>30的皮肤保护产品被认为是有效的紫外线辐射过滤器）具有良好的紫外线吸收能力，推测主要与其中的黄酮类和酚酸类化合物（主要为水飞蓟素、迷迭香酸、槲皮苷和山柰酚）的紫外吸收能力和抗氧化防御能力有关，具有潜在的辐射防护能力。
3.2.1 黄酮类化合物
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物是一类从中草药中提取的天然产物，被认为是一种有效的抗氧化剂，可以调控炎症介质的调节酶或转录因子，通过与DNA的相互作用影响氧化应激，增强基因组稳定，具有神经保护和辐射保护作用[21]。
金银花素(5,7-二羟基黄酮)是从蜂胶、蜂蜜和几种植物中提取的一种黄酮类化合物。Mansour等[22]发现给药金银花素(50 mg/kg）可提高受5 Gy红外线照射雄性Wister大鼠大脑中丙二醛(MDA)水平和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性，这提示金银花素具有辐射致脑损伤的神经保护作用。Kale等[23]通过组织病理评估，显示槲皮素可显著减少辐射诱导的神经元变性和炎症浸润，揭示了槲皮素对辐射致脑损伤的神经保护作用。
Li等[24]证实芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）能够一定程度上修复UVB诱导的人表皮角质形成细胞(HEKs)的毛细血管扩张性共济失调的异常突变，从而抑制HEKs细胞凋亡和坏死，表明芹菜素对中波紫外线损伤的HEKs具有新型的保护作用。Prasad等[25]报道水飞蓟宾（silibinin）可以防止中波紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体的形成，通过增加抑癌基因p53水平进而促进DNA修复和（或）启动受损细胞的凋亡。
曲克芦丁（TRX）是一种黄酮类化合物，广泛存在于茶叶、咖啡、谷类食品、各种水果和蔬菜中，具有抗辐射作用，Panat[26]对其清除自由基的能力和抗细胞凋亡活性进行了系统的研究。TRX能清除超氧物、NO和其他模型稳定的自由基，从而保护受辐照的细胞。
有些英国科学家研究发现，每天喝两杯绿茶、吃一个橘子，就可以帮助“电脑族”们抵御计算机辐射[27]。而儿茶素类化合物作为茶叶中的主要功能成分，具有显著的抗辐射作用。茶树中儿茶素类化合物主要包括，儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯及表没食子儿茶素没食子酸酯8种单体。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯生理活性较为突出，具有抗氧化性和抗细胞凋亡活性，可预防不同刺激对组织的损伤。Korystova等[28]研究发现在对辐射诱导的大鼠主动脉损伤的预防作用中，发现红茶比绿茶更加有效，即使浓度低于1 g/100 ml的红茶也能够有效预防红外线对主动脉造成的损伤。红茶中的儿茶素含量明显低于绿茶，但两种茶中的黄酮醇含量几乎相等。儿茶素、表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯可增加大鼠主动脉的氧化应激，而黄酮醇可降低辐射诱导的氧化应激。因此，红茶药效的提高是由于儿茶素含量的降低使黄酮醇的正向调节作用更大程度地得到发挥所致。
3.2.2 酚酸类化合物
酚酸类化合物系指具有多羟基的芳香羧酸类化合物，主要以糖、酯以及有机酸的形式存在于植物中，现代研究表明酚酸类化合物能够清除体内多种自由基，具有良好的抗氧化活性和潜在的辐射防护作用。
Milton等[29]报道，鱼腥草细胞培养物的甲醇提取物因细胞产生酚类次生代谢物而具有潜在的光保护作用，结果显示鱼腥草细胞的甲醇提取物(310～2500 g/ml)能够显著提高受紫外线照射的3T3-Swiss白化成纤维细胞活力。提取物的LC-MS化学分析表明，其总酚和总酚酸含量（主要为没食子酸和毛蕊花苷）较高，具有特征的紫外吸收峰(第一和第二波段的峰值分别为294和330 nm)，能够抵消紫外线对皮肤的有害影响。
Abozaid等[30]报道肉桂酸纳米颗粒可作为一种辐射诱导胰腺炎的氧化还原信号通路的调节剂，首先用I-精氨酸和γ射线诱导大鼠患急性胰腺炎，口服肉桂酸纳米颗粒(CA-NPs)后，急性胰腺炎的严重程度及血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低。同时，胰腺组织的MDA水平显著降低，谷胱甘肽的消耗显著恢复，caspase-3水平降低，可明显改善胰腺组织损伤或凋亡。因此，肉桂酸纳米颗粒对辐射诱导的急性胰腺炎具有较好的治疗潜力。Liu等[31]研究发现姜黄素（Cur）对长波紫外线辐射诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）光老化具有一定的保护作用。Zhang等[32]发现白藜芦醇通过激活Sirtuin1 (Sirt1，组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，可减轻炎症损伤)减轻辐射诱导的小鼠肠道损伤。周瑞芳等[33]研究表明，丹酚酸B可减轻γ射线辐射诱导的造血系统损伤和骨髓细胞的DNA及蛋白质的减少，恢复小鼠免疫系统的辐射损伤，具有显著的抗γ射线辐射作用。
3.2.3 花色苷
花色苷是花青素和糖以糖苷键结合而成的一种化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，起到保护植物抗氧化的作用。其抗氧化和消除自由基能力可防护不同射线辐射，能够发挥独特的生理效应。
Fernandes等[34]发现花色苷家族成员（矢车菊色苷、锦葵色苷及其衍生色素）具有促进皮肤维持健康的活性，研究表明大部分化合物能够抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌菌株的生长繁殖，减少HEKs和HDF活性氧的产生，抑制皮肤降解酶的活性且无细胞毒性作用，具有一定的紫外线过滤作用。
Targhi等[35]研究黑桑花色苷对大鼠肝组织和骨髓细胞的辐射防护作用，以 60Co γ射线远距放射（3 Gy和6 Gy）建立大鼠辐射损伤模型，随后腹腔注射200 mg/kg的黑桑花色苷，结果显示黑桑花色苷可降低大鼠肝脏MDA和SOD的水平，降低γ射线照射对大鼠骨髓细胞和肝脏的遗传毒性和细胞毒性，有潜在的辐射保护作用。
3.3 皂苷类化合物
皂苷（saponin）类化合物是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，存在于人参、桔梗、刺五加等许多中草药中，在增强免疫、抗肿瘤、抗炎等方面具有显著的生物活性。研究表明人参皂苷的抗辐射机制与清除自由基、抗氧化活性，与其对心血管系统、免疫系统的保护作用以及对细胞凋亡的抑制作用有关[36]。
Wen[37]等研究黄芪甲苷对中波紫外线诱导的大鼠真皮成纤维细胞早衰的抗光老化作用，结果显示黄芪甲苷不仅能通过激活细胞外调解蛋白激酶ERK和丝裂原活化蛋白激酶p38信号抑制中波紫外线诱导的胶原-I的降解，还通过激活细胞自噬增加胶原-I的积累，从而保护中波紫外线诱导的光老化细胞，表明黄芪甲苷在抗光老化治疗中的潜在优势。
Wang等[38]分析柴胡皂苷-d (SSd)对肝癌细胞自噬活性和放射敏感性的影响，SSd通过抑制mTOR磷酸化促进肝癌细胞自噬，增加辐射诱导的肝癌细胞凋亡并且抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的放射增敏治疗提供了一种可能的途径。
Kim等[39]研究知母皂苷A-III（TA-III）对中波紫外线诱导的HEKs和HDF侵袭效应的保护作用时发现，TA-III在非细胞毒性剂量下（50 nmol/L）以剂量依赖的方式抑制中波紫外线诱导的环氧合酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）转录和蛋白表达水平，降低中波紫外线诱导的原代皮肤细胞的侵袭，组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和COX-2在HEKs中的过度表达，表明其具有光保护剂的开发潜力。
3.4 其他
除了上述多糖类、多酚类以及皂苷类化合物，天然产物中的许多其他化合物同样具有良好的辐射防护作用，包括维生素类、蛋白类、无机成分、稀有元素等。
Rostami等[40]研究发现预先摄入硒和维生素E能够对X射线辐射引起的遗传损害起到一定的防护作用。段一凡等[41]报道茶叶籽不饱和脂肪酸对中波紫外线诱导的HEKs损伤具有保护作用。Jaisin等[42]研究发现胡椒碱（10～40 µmol/L）预处理可抑制中波紫外线诱导的炎症信号通路，减弱HEKs的细胞毒性并且抑制其凋亡。这提示胡椒碱的抗炎作用能保护HEKs免受中波紫外线辐射的损伤，可作为一种紫外线辐射诱导皮肤炎症的有效治疗手段。
4. 结语
近年来，国内外越来越重视辐射损伤的防护，抗辐射药物的寻找也变得十分紧迫。而与传统的化学合成药物相比，天然来源的药物具有活性高、选择性强、毒副作用小等优点，作为抗辐射药物有着广阔的开发前景。但是抗辐射天然产物的筛选方法耗时耗力，因此建立高通量、高专属性的抗辐射天然产物筛选方法意义重大。此外，对已有的天然产物进行结构改造，以期获得抗辐射活性更高或毒副作用更小的衍生物以及提高抗辐射天然产物的提取纯化效率等皆是未来抗辐射天然产物研究的重点和难点。
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表 1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 日内精密度 日间精密度 检测值（μg/ml） RSD(%) 检测值（μg/ml） RSD(%) 0.50 0.58±0.01 1.62 0.58±0.01 1.13 2.00 1.95±0.02 0.56 1.96±0.01 0.49 10.00 9.36±0.04 0.40 10.02±0.09 0.87 
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表 2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 检测值（μg/ml） 回收率(%） RSD(%) 0.50 0.57±1.54 113.47 1.69 2.00 1.93±0.02 96.48 0.82 10.00 9.82±0.05 98.21 0.52
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表 3 不同摩尔量DLPC脂质体的表征
DSPC:DLPC
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 69∶1 均匀 无沉淀 139.7 0.051 −12.1 98.71 1.11 65∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 60∶10 均匀 无沉淀 143.4 0.035 −13.0 98.43 1.15 50∶20 均匀 无沉淀 126.7 0.165 −14.9 92.64 2.27 40∶30 均匀 无沉淀 120.5 0.173 −14.6 92.94 2.22
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表 4 不同摩尔量胆固醇脂质体的表征
PC∶胆固醇
(mol∶mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶10 不均匀 — — — — — — 70∶20 均匀 无沉淀 119.4 0.108 −11.0 96.69 0.96 70∶25 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶30 均匀 无沉淀 147.7 0.095 −12.7 94.56 0.88 70∶40 不成膜 — — — — — —
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表 5 不同摩尔量DSPE-PEG2000脂质体的表征
PC: DSPE-PEG2000
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶0 不成膜 — — — — — — 70∶1 不成膜 — — — — — — 70∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶10 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.37 70∶15 均匀 无沉淀 108.9 0.197 −11.0 97.07 1.34
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表 6 不同用量PdPC(OBu)8脂质体的表征
PdPC(OBu)8 :PC
(m:m)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 1∶400 均匀 无沉淀 179.3 0.140 −12.3 93.92 1.15 1∶300 均匀 无沉淀 157.4 0.143 −11.5 94.23 1.16 1∶200 均匀 无沉淀 145.9 0.142 −14.3 93.26 1.19 1∶100 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.23 1∶50 不均匀 沉淀 — — — — —
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[1] 卢光照, 侯成, 张翮, 等. 光敏活性氧自由基响应脂质体的制备和评价[J]. 药学学报, 2017, 52(12):1942-1950. doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0864 [2] MIAO Z L, DENG Y J, DU H Y, et al. Preparation of a liposomal delivery system and its in vitro release of rapamycin[J]. Exp Ther Med,2015,9(3):941-946. doi: 10.3892/etm.2015.2201 [3] ABUD M B, LOUZADA R N, ISAAC D L C, et al. In vivo and in vitro toxicity evaluation of liposome-encapsulated sirolimus[J]. Int J Retina Vitreous,2019,5(1):1-10. doi: 10.1186/s40942-018-0153-8 [4] 王婷. 基于纳米脂质体的药物载体开发研究[J]. 科学技术创新, 2020(19):16-18. doi: 10.3969/j.issn.1673-1328.2020.19.008 [5] WANG J, GUO F, YU M, et al. Rapamycin/DiR loaded lipid-polyaniline nanoparticles for dual-modal imaging guided enhanced photothermal and antiangiogenic combination therapy[J]. J Control Release,2016,237:23-34. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.07.005 -
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