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近红外光响应的肿瘤光热治疗因具有组织穿透性强、生物安全性好等优点，已引起广泛关注。作为新兴的光敏剂，八丁氧基酞菁钯具有成本低、易合成、毒性低等优点，在肿瘤光动力治疗(PDT)领域表现出巨大潜力。由于高渗透强滞留效应(EPR)，脂质体作为药物载体可靶向集中于肿瘤组织，同时ROS可氧化破坏脂质双层膜，促进包载药物在肿瘤组织的精准释放。本实验以雷帕霉素为模型药物，采用课题组合成的八丁氧基酞菁钯为光敏剂，制备近红外光触发的ROS响应型雷帕霉素脂质体，并对其理化性质及体外释放特性进行考察。
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R206D旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；730 nm/1500 mW激光器(长春市亮丽光电有限公司)；U3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher公司)；JY92.IIDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；马尔文激光粒度仪(英国Malvern公司)。
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二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC，Avanti公司)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DLPC，Avanti公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG2000，Lipoid 公司)；胆固醇、雷帕霉素（MCE公司）、八丁氧基酞菁钯[PdPC(OBu)8，实验室自制]；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone 公司）。
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采用薄膜分散法制备脂质体。精密称取DSPC、DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000、雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯置于250 ml圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解。65 ℃水浴，65 r/min减压旋转蒸发形成均匀薄膜，取PBS溶液4 ml水化。吸出脂质体，用PBS稀释至5 ml，200 W探头超声5 min，即得近红外光触发ROS响应型雷帕霉素脂质体。空白脂质体除不加雷帕霉素、八丁氧基酞菁钯外，制备方法相同。
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以脂质体成膜及水化效果、药物包封率及载药量、包载药物光敏释放效率为指标，从DLPC、胆固醇、DSPE-mPEG2000处方量及PdPC(OBu)8投药量对光敏ROS脂质体处方进行单因素考察。
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取少量脂质体溶液，用去离子水稀释，使用马尔文激光粒度仪测量脂质体粒径、PDI及Zeta电位。
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色谱柱：Agilent TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（84∶16）；流速1.0 ml/min；检测波长：278 nm；柱温：50 ℃；进样量：20 μl。
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精密称取雷帕霉素2.50 mg置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为250 μg/ml储备液。精密吸取储备液800、400、200、100、40、20、10、4 μl，分别于5 ml容量瓶中用甲醇定容。制成浓度为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/ml的对照品溶液。HPLC仪检测并记录峰面积A，绘制出峰面积A与对照品质量浓度C的标准曲线并进行线性回归分析。
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吸取雷帕霉素脂质体溶液500 μl加入5 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后，以10 000 r/min进行超速离心10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，制得供试品溶液。吸取空白脂质体按同法制备阴性对照品溶液。分别取对照品、阴性对照品、供试品按照“1.6.1”项下方法进样，记录HPLC图。
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选取低、中、高3个浓度的对照品溶液，1 d内重复进样考察日内精密度，连续3 d每天测定一次，考察日间精密度。
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吸取用于制备选定的低、中、高3个浓度对照品溶液的储备液于不同的5 ml容量瓶中，同一浓度共制备3个样品。向每个容量瓶中加入100 μl空白脂质体溶液，再用甲醇定容至刻度。超声20 min破乳后，进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测。
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包封率与载药量是评价脂质体的重要指标。包封率是脂质体中包封药物量与脂质体中药物总量的百分比。载药量是脂质体中药物量与脂质体总量的百分比。
精密吸取脂质体500 μl置于5 ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测，计算得出脂质体中药物总量。
精密吸取适量脂质体溶液，先进行低速离心[3]，3 000 r/min，15 min。取上层液体500 μl置于5 ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度。超声20 min破乳后，再进行超速离心，10 000 r/min，10 min。取适量上清液过0.45 μm有机膜，进行HPLC检测，计算出脂质体中包封药物量。
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采用反向透析法测定雷帕霉素脂质体光敏释放特性。以30 ml 20%乙醇为释放介质，加入50 ml离心管内；另吸取1 ml释放介质并加入透析袋内，将透析袋两端扎紧后放入离心管中；取300 μl雷帕霉素脂质体，用730 nm，1 W/cm2近红外光照射5 min后，转移至释放介质；将离心管移至摇床内，设置摇床条件为37 ℃，180 r/min。分别在1、2、4、8、12 h从透析袋内取样200 μl，用于样品测定和累积释放率的计算。取样后即补加新鲜释放介质200 μl，保持释放介质总量不变。以时间(t)为横坐标，以累积释放率(Q%)为纵坐标，绘制释放曲线。
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回归方程为A = 0.6240 C-0.1738 （r = 0.999 5）。雷帕霉素在0.2～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
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按照“1.6.1”项下色谱条件测定，雷帕霉素出峰良好，保留时间为7.8 min。表明此方法专属性良好（图1）。
图 1 雷帕霉素的专属性
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由表1可知，雷帕霉素在低、中、高3个浓度都具有较好的准确度，日间精密度和日内精密度值均小于5%，表明该方法可用于雷帕霉素的含量测定。
表 1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 日内精密度 日间精密度 检测值（μg/ml） RSD(%) 检测值（μg/ml） RSD(%) 0.50 0.58±0.01 1.62 0.58±0.01 1.13 2.00 1.95±0.02 0.56 1.96±0.01 0.49 10.00 9.36±0.04 0.40 10.02±0.09 0.87 -
由表2可知，雷帕霉素在低、中、高3个浓度的回收率为97.64%～98.62%，符合95%～105%的范围，且RSD值均小于1%，表明该提取方法稳定可靠。
表 2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 检测值（μg/ml） 回收率(%） RSD(%) 0.50 0.57±1.54 113.47 1.69 2.00 1.93±0.02 96.48 0.82 10.00 9.82±0.05 98.21 0.52 -
由表3可知，包含不同摩尔量DLPC的处方制得的脂质体，成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%；脂质体体外释放试验，光照12 h后，测得雷帕霉素药物累积释放率>60%（图2A）。当DLPC含量较低时（DSPC∶DLPC=69∶1），雷帕霉素释放速率明显低于其他处方。随着DLPC含量的增加，雷帕霉素释放速率及12 h内累积释放率并无明显增加。
表 3 不同摩尔量DLPC脂质体的表征
DSPC:DLPC
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 69∶1 均匀 无沉淀 139.7 0.051 −12.1 98.71 1.11 65∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 60∶10 均匀 无沉淀 143.4 0.035 −13.0 98.43 1.15 50∶20 均匀 无沉淀 126.7 0.165 −14.9 92.64 2.27 40∶30 均匀 无沉淀 120.5 0.173 −14.6 92.94 2.22 -
由表4可知，PC（DSPC+DLPC）与胆固醇之比过大（70∶10）或过小（70∶40），脂质体都不能成膜。当PC与胆固醇之比为70∶20、70∶25、70∶30时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量在1%左右。在进行脂质体体外释放实验中，测得12 h后雷帕霉素药物累积释放率>60%（图2B）。
表 4 不同摩尔量胆固醇脂质体的表征
PC∶胆固醇
(mol∶mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶10 不均匀 — — — — — — 70∶20 均匀 无沉淀 119.4 0.108 −11.0 96.69 0.96 70∶25 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶30 均匀 无沉淀 147.7 0.095 −12.7 94.56 0.88 70∶40 不成膜 — — — — — — 
图 2 雷帕霉素光敏释放特性考察
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由表5可知，当DSPE-PEG2000用量较小时，脂质体不能成膜。当PC与DSPE-PEG2000之比为70∶5、70∶10、70∶15时，所得脂质体成膜及水化效果较好，粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中，摩尔比70∶5组测得雷帕霉素药物累积释放率>60%，其余两组药物累积释放率在33%左右（图2C）。
表 5 不同摩尔量DSPE-PEG2000脂质体的表征
PC: DSPE-PEG2000
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶0 不成膜 — — — — — — 70∶1 不成膜 — — — — — — 70∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶10 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.37 70∶15 均匀 无沉淀 108.9 0.197 −11.0 97.07 1.34 -
由表6可知，当PdPC(OBu)8用量较大（质量比1∶50），脂质体不能成膜。当PdPC(OBu)8与PC质量之比为1∶100、1∶200、1∶300、1∶400，测得粒径<200 nm，PDI<0.2，雷帕霉素包封率>90%，载药量>1%。在进行的12 h脂质体体外释放实验中，质量比1∶100、1∶200组释放效率高于其余两组，在60%左右（图2D）。
表 6 不同用量PdPC(OBu)8脂质体的表征
PdPC(OBu)8 :PC
(m:m)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 1∶400 均匀 无沉淀 179.3 0.140 −12.3 93.92 1.15 1∶300 均匀 无沉淀 157.4 0.143 −11.5 94.23 1.16 1∶200 均匀 无沉淀 145.9 0.142 −14.3 93.26 1.19 1∶100 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.23 1∶50 不均匀 沉淀 — — — — — -
DLPC是一种人工合成的不饱和磷脂，在制成的脂质体中，DLPC将均匀分散在脂质双分子层膜上。当有ROS存在时，DLPC结构中的不饱和碳碳双键可被氧化，使脂质膜结构遭到破坏，促进包载药物的释放。光敏剂可在特定波长光照射下产生ROS，在肿瘤疾病的光动力治疗中得到广泛应用。但光敏剂自身潜在的光毒性和溶解性差是其突出缺陷。本文将光敏剂包载在脂质体中可以减少潜在的细胞毒性，同时可增加其溶解度。在研究脂质体中雷帕霉素释放的释放介质确定上，文献[2,4-5]中提供了多种选择。预实验显示，20%乙醇溶液作为释放介质时，不仅克服了脂溶性药物雷帕霉素在水中溶解性差的缺点，同时也使得在进行HPLC检测时干扰峰较少。综上所述，本研究成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体，表征结果较好。在短时间特定波长照射后，可实现脂溶性药物的快速释放。
Preparation and characterization of photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes
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摘要:
目的 研究光敏活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）响应型雷帕霉素脂质体的制备工艺及其性质，旨在开发一种稳定高效的刺激响应型脂质体载体。 方法 采用薄膜分散法制备雷帕霉素脂质体；马尔文激光粒度仪测定其粒径及Zeta电位；利用HPLC法建立雷帕霉素含量测定方法；经近红外光照射后，采用反向透析法考察雷帕霉素脂质体的体外释放特性。 结果 雷帕霉素脂质体粒径<200 nm，PDI值<0.200；雷帕霉素在0.2～40 μg/ml范围与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9995；雷帕霉素脂质体包封率>94.20%；经730 nm近红外光照射5 min后，雷帕霉素脂质体12 h内体外释放率可达60%。 结论 成功制备了光敏ROS响应型雷帕霉素脂质体，具有较高的包封率和体外刺激响应效率。 Abstract:Objective To study the preparation process and properties of photosensitive ROS (Reactive oxygen species) responsive rapamycin liposome, and to develop a stable and efficient stimulus-responsive liposome carrier. Methods Rapamycin liposomes were prepared by thin film dispersion method. The particle size and Zeta potential were determined by Malvern laser particle size analyzer. An assay method for rapamycin was established by HPLC. In vitro release characteristics of rapamycin liposomes were investigated by reverse dialysis after irradiation with near-infrared light. Results The particle size of rapamycin liposome was less than 200 nm and the PDI value was less than 0.200. Rapamycin showed a good linear relationship with peak area in the range of 0.2-40 μg/ml, with the correlation coefficient of 0.9995. Encapsulation rate of rapamycin liposomes was > 94.20%. The release efficiency of rapamycin liposomes reached 60% within 12 h after irradiation with 730 nm near infrared light for 5 min. Conclusion Photosensitive ROS-responsive rapamycin liposomes were successfully prepared, which had high encapsulation rate and stimulation response efficiency in vitro. -
Key words:
- liposome /
- rapamycin /
- near infrared light /
- ROS /
- release in vitro
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骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）属于脊柱骨折，多发于中老年人，为临床最为常见的骨质疏松性骨折之一，严重影响患者脊柱功能、日常活动能力等，且发病率、致残、致死率均较高。现阶段，临床多以经皮椎体成形术（PVP）对OVCF患者进行治疗，临床疗效确切，可迅速缓解骨折引起的疼痛，促进椎体形态和功能恢复，但其对患者骨质疏松程度及骨质疏松引起的疼痛改善效果欠佳，故临床倡导PVP术后予以适当的干预以改善手术效果[1]。西医临床常用药物为碳酸钙D3，但有研究[2]指出其对部分患者的干预效果较差，临床多与中医药物干预、锻炼等相结合对PVP术后OVCF患者进行治疗。中医学认为，OVCF属“骨痿”范畴，主要病机为肾精不足、气滞血瘀所致骨质枯槁，肝肾阴虚证为其主要证型之一，应治以滋补肝肾，填精壮骨[3]。中药膏方含阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参等，根据临床中药机制可见其有补肾填精、益气健脾、通络止痛等功效，但其对PVP术后OVCF患者的疗效及机制尚未完全明确[4]。故设立本研究，以120例于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象进行前瞻性随机对照研究，旨在进一步观察中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF患者的疗效，为其临床应用提供参考。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取120例2016年1月至2017年9月于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象，患者均知情同意，按随机数字表法将其分为观察组（60例），对照组（60例）。本研究经我院医学研究伦理研究委员会审核通过。观察组：男35例，女25例；年龄50~80岁，平均（66.27±2.15）岁；体质量指数（BMI）19~25 kg/m2，平均（22.35±0.41）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.51±0.22）年；骨折病程1~3周，平均（1.55±0.12）周；骨压缩程度[5]：轻度16例，中度30例，重度14例。对照组：男33例，女27例；年龄51~78岁，平均（66.18±2.20）岁；BMI 19~25 kg/m2，平均（22.41±0.42）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.48±0.20）年；骨折病程1~3周，平均（1.52±0.13）周；骨压缩程度：轻度15例，中度29例，重度16例。两组性别、年龄、BMI、骨质疏松病程、骨折病程、压缩程度等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 纳入标准
①中医诊断符合《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识（2015）》[6]中肝肾阴虚证相关辩证标准，西医诊断符合《骨质疏松性骨折诊疗指南》[7]中OVCF相关诊断标准，并经临床检查确诊者；②均为胸腰椎骨折，且是首次因OVCF就诊者；③无PVP相关禁忌，手术成功，且术后生命体征平稳者；④近3个月内未行特殊的抗骨质疏松治疗，同期未接受其他治疗者；⑤无脊髓损伤或神经根症状者等。
1.3 排除标准
①椎体爆裂性骨折、陈旧性胸腰椎压缩性骨折或肿瘤、感染等所致病理骨折者；②脊柱结核、骨肿瘤者；③继发性骨质疏松者；④精神障碍、认知能力或沟通能力障碍者；⑤伴严重器官障碍、急性腰扭伤、骨瘤骨转移、强直型脊柱炎、四肢新鲜骨折、软组织损伤者等。
1.4 方法
对照组予以碳酸钙D3咀嚼片[重庆海默尼制药有限公司，国药准字H20205039，碳酸钙1.25 g（相当于钙0.50 g）、维生素D3 200 IU]口服，每次1片，每日2次。同时指导患者每天摄入适量豆类、瘦肉、牛奶、鱼类等优质蛋白（1.20~1.40 g/kg），进行适当的日光浴及行走锻炼（30 min以上）。
观察组在对照组基础上予以中药膏方（将阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参各200 g，鹿角胶、茯苓、桑寄生、熟地黄、牛膝、丹参、威灵仙各150 g，龟板胶、白术、骨碎补、神曲各100 g，炙甘草60 g制成膏剂后即得）口服，开水调服，每次10 g，每日2次。同时指导患者进行八段锦锻炼，所用方法为改良八段锦第八式：躯体直立，两足平行分开（与肩同宽），两手臂自然下垂，手指稍并拢，掌指向前，两膝关节屈曲135°~170°；两眼平视前方，微张口，平稳呼吸，全身放松2 min，紧接着保持原来体位尽可能屈膝下蹲，然后在双上臂伸直情况下慢慢上举到水平，慢慢随之站起（保持躯体直立下），至身体直立时顺势将两脚跟向上提起（期间慢慢匀速吸气到最满并憋气），停顿10~15 s；两脚跟下落着地，双手臂随之顺势下落，回到膝关节屈曲位（期间慢慢匀速呼气）；每次7个循环，每日3次。两组均治疗6个月，并随访3年。
1.5 观察指标
1.5.1 疗效
根据《中药新药临床研究指导原则》[8]可将两组治疗6个月后的疗效分为临床治愈（腰部功能完全恢复，临床症状、体征完全消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），显效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征基本消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），有效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征减轻，X射线可见大量骨痂形成，但未完全愈合），无效（腰部功能有改善，临床症状、体征有减轻，但X射线可见几乎无骨痂形成）。临床治愈率=临床治愈例数/总例数；显效率=显效例数/总例数；有效率=有效例数/总例数；无效率=无效例数/总例数。总有效率=（临床治愈+显效+有效）例数/总例数。
1.5.2 不同时点腰背疼痛情况
以疼痛视觉模拟评分法（VAS，0~10分）[9]评估两组治疗1、3、6个月的腰背疼痛情况，得分越高提示患者腰背疼痛程度越严重。
1.5.3 骨密度（BMD）、椎体后凸角度（Cobb角）及椎体前壁高度（AVBH）变化情况
以BMD测定仪（QDR 4500C，美国Hologic公司）检测两组治疗前、治疗6个月后的腰椎、股骨颈BMD；以X射线检查两组治疗前、治疗6个月后的Cobb角、AVBH。
1.5.4 骨代谢指标
抽取两组治疗前、治疗6个月后的晨起空腹静脉血3 ml，离心机3 000 r/min离心15 min，分离血清，以全自动电化学发光分析仪（罗氏Cobas e601，北京东方迈润医疗器械有限公司）检测血清I型原胶原降解产物（β-Cross I）、N端中段骨钙素（N-MID Ost）、甲状旁腺素（PTH）水平。
1.5.5 PVP术后推体再骨折发生率
记录两组随访时间及随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率，同1例患者发生多次再骨折仅算1例。
1.6 统计学方法
数据采用SPSS 21.0（IBM公司，美国）统计学软件进行分析，计量资料采用（
$\bar x $ ±s）表示，组内比较使用配对t检验，治疗前、治疗6个月后的比较使用独立样本t检验，多组间比较采用F检验；计数资料采用[n(%)]表示，使用χ2检验进行比较。2. 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
治疗6个月后，观察组临床治愈率为73.33%，高于对照组的53.33%（P<0.05）；而两组显效率、有效率、无效率、总有效率比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表 1 两组患者临床疗效比较[n(%)]组别 例数 临床治愈率 显效率 有效率 无效率 总有效率 观察组 60 44(73.33) 13(21.67) 3(5.00) 0(0.00) 60(100.00) 对照组 60 32(53.33) 20(33.33) 8(13.33) 0(0.00) 60(100.00) χ2 5.167 2.048 2.502 P <0.05 >0.05 >0.05 2.2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较
治疗前，两组患者VAS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗3、6个月后两组VAS评分均降低，且观察组低于对照组（P<0.05）；与治疗3个月后比较，治疗6个月后，两组VAS评分均降低（P<0.05，表2）。
表 2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较（$\bar x $ ±s，分）组别 例数 治疗前 治疗3个月后 治疗6个月后 观察组 60 7.55±0.37 2.47±0.33* 1.14±0.23** 对照组 60 7.52±0.35 3.51±0.51* 2.36±0.42** t 0.456 13.262 19.735 P >0.05 <0.05 <0.05 *P<0.05，与治疗前比较；**P<0.05，与治疗3个月后比较 2.3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较
治疗前，两组患者BMD、Cobb角及AVBH比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后两组腰椎、股骨颈BMD及AVBH均升高，且观察组高于对照组（P<0.05）；而两组Cobb角均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表3）。
表 3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 腰椎BMD(g/cm3) 股骨颈BMD(g/cm3) Cobb角(°) AVBH(%) 治疗前 观察组 60 0.70±0.07 0.68±0.06 23.09±2.51 53.93±7.26 对照组 60 0.69±0.08 0.67±0.07 23.11±2.49 54.04±7.44 t 0.729 0.840 0.044 0.082 治疗6个月后 观察组 60 0.93±0.08* 0.93±0.07* 6.47±1.98* 96.56±9.41* 对照组 60 0.84±0.11* 0.85±0.08* 8.91±2.26* 85.73±8.04* t 5.125 5.829 6.290 6.778 *P<0.05，与治疗前比较 2.4 两组患者骨代谢指标比较
治疗前，两组患者血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后，两组血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表4）。
表 4 两组患者骨代谢指标比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 β-Cross I(ng/ml) N-MID Ost(ng/ml) PTH(pg/ml) 治疗前 观察组 60 0.79±0.13 42.10±9.53 62.28±9.42 对照组 60 0.78±0.14 41.98±9.52 62.25±9.39 t 0.405 0.069 0.017 治疗6个月后 观察组 60 0.67±0.10* 36.15±5.46* 52.47±4.02* 对照组 60 0.73±0.12* 38.93±6.14* 57.45±5.72* t 2.975 2.621 5.518 *P<0.05，与治疗前比较 2.5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较
两组患者随访时间、随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率比较，均无统计学意义（P>0.05）；随访3年内，观察组PVP术后推体再骨折发生率为3.33%，低于对照组的20.00%（P<0.05，表5）。
表 5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较组别 例数 随访1年内发生率
[n(%)]随访1~3年内 合计
[n(%)]随访时间
($\bar x $±s, 年)发生率
[n(%)]观察组 60 2(3.33) 1.94±0.43 0(0.00) 2(3.33) 对照组 60 7(11.67) 1.86±0.72 5(8.33) 12(20.00) t/χ2 3.003 0.739 3.339 8.086 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 3. 讨论
骨质疏松为临床常见的慢性骨代谢异常疾病，可见骨钙含量减少、骨量下降，极易出现骨折，OVCF为其临床常见类型。OVCF发病后可致患者出现椎体高度下降、疼痛、功能障碍等，未得到及时有效的治疗，可致残、致死，且其再发骨折风险高[10]。现阶段，微创PVP治疗为大多保守治疗无效的OVCF患者的主要选择，可恢复椎体力学强度、稳定骨折，但骨转换率及骨量流失未能纠正，且手术造成的内外骨膜血管损伤及制动可能会加重骨质疏松而影响患者预后[11]。故PVP术后予以适当的干预治疗至关重要，临床常用药物为碳酸钙D3，其可促进骨质形成而缓解骨质疏松程度，但其多偏重于抑制骨吸收，减轻骨质流失。近年来，越来越多的研究[12-13]发现，中医药治疗PVP术后OVCF有一定成效，其既能抑制流失，又能促进成骨形成，在抗骨质疏松、促进骨折愈合、防治再骨折发生等方面优势明显，现已备受临床医生青睐，但关于何种药物更佳尚无统一定论。
中医认为OVCF属“骨枯”、“骨萎”、“痹证”等范畴，肾中精气是骨生长发育的根本，脾胃为后天之本，气血生化之源，故其发病机制主要为肾精亏虚、脾精不足所致骨骼失养；外伤导致筋脉损伤、气血运行不畅，加之患者湿热寒邪侵袭、肾脾虚亏，容易加重气滞血瘀症状，使得骨骼和筋骨失去濡养，导致骨关节萎缩、活动不利等而诱发OVCF，故治疗应补肾壮骨、活血行气、舒经通络、消肿止痛[14]。中药膏方中的阿胶、枸杞子、鹿角胶、龟板胶可补血益气、填精益髓，其中，龟鹿二仙胶中鹿角胶、龟板胶为主方，与党参、枸杞子配伍可增强益气养阴、补肾填精益髓之功；鸡血藤可活血补血、舒筋活络、疏风止痛；党参可补中益气、生血行血；茯苓可利水消肿、益气健脾；桑寄生、熟地黄、骨碎补、牛膝可补肾壮骨；丹参、威灵仙、神曲可健脾和胃、消食调中，进而减轻膏方的厚腻；炙甘草可补脾和胃，益气复脉，同时调和诸药；全方可发挥补肾填精、益气健脾、通络止痛之功效[15-16]。同时八段锦作为一种由八节不同动作组成的一套医疗、康复体操，其通过人体垂直方向的应力刺激成骨、下蹲平衡锻炼、膀胱经的经气疏通等可对OVCF患者产生舒筋活络的良好功效，进而有助于促进患者腰部功能恢复，提高患者临床疗效。本研究显示，治疗6个月后，观察组临床治愈率高于对照组，且治疗3、6个月后VAS评分低于对照组，进一步说明中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可有效缓解患者腰背疼痛，疗效显著。
OVCF的发生发展与骨代谢及转换密切相关，其中，β-Cross I为骨吸收的重要指标，N-MID Ost为骨形成、骨转换的重要指标，可直接反映成骨细胞的活性与数量变化，PTH则可加速骨代谢活跃，促进骨吸收，血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平升高提示患者骨转换成程度严重，可促进病情进展，不利于PVP术后腰部功能的恢复[17]。本研究显示，治疗6个月后，观察组腰椎、股骨颈BMD及AVBH高于对照组，Cobb角、血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH低于对照组，且随访3年内PVP术后推体再骨折发生率低于对照组，提示中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可调节患者机体骨代谢，提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，降低PVP术后推体再骨折发生率。PVP术后OVCF患者骨折愈合的本质为骨重建，该过程涉及局部微环境的构建、成骨细胞的活化、大量血管的生成等，而现代药理学研究[18-20]指出，中药膏方中的骨碎补含双氢黄酮苷、黄酮等成分，可提高BMD，刺激成骨细胞增殖分化，防止骨吸收、促进骨形成，发挥抗骨质疏松、促进骨折愈合等作用，进而促进腰部功能的恢复；牛膝含牛膝竹节参皂苷，可发挥较好的抗炎、止痛、改善微循环作用，有助于促进局部微环境的构建而促进患者骨折愈合，进而降低再骨折发生率。同时联合八段锦进行治疗，可有效疏通OVCF患者经络，促进机体气血运行通畅，进而可增强中药膏方促进患者腰部功能恢复的作用，降低患者PVP术后推体再骨折发生率。而对照组由于仅进行常规对症治疗，而未对患者采取中药膏方联合八段锦等治疗，故患者复发的风险明显增加。
综上，中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可降低其血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平，调节机体骨代谢，有助于提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，进而缓解患者腰背疼痛，降低PVP术后推体再骨折发生率，疗效显著。
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表 1 雷帕霉素 HPLC 分析的精密度（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 日内精密度 日间精密度 检测值（μg/ml） RSD(%) 检测值（μg/ml） RSD(%) 0.50 0.58±0.01 1.62 0.58±0.01 1.13 2.00 1.95±0.02 0.56 1.96±0.01 0.49 10.00 9.36±0.04 0.40 10.02±0.09 0.87 
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表 2 雷帕霉素 HPLC 分析的提取回收率（
$\overline x \; $ ±s，n=3）浓度（μg/ml） 检测值（μg/ml） 回收率(%） RSD(%) 0.50 0.57±1.54 113.47 1.69 2.00 1.93±0.02 96.48 0.82 10.00 9.82±0.05 98.21 0.52
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表 3 不同摩尔量DLPC脂质体的表征
DSPC:DLPC
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 69∶1 均匀 无沉淀 139.7 0.051 −12.1 98.71 1.11 65∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 60∶10 均匀 无沉淀 143.4 0.035 −13.0 98.43 1.15 50∶20 均匀 无沉淀 126.7 0.165 −14.9 92.64 2.27 40∶30 均匀 无沉淀 120.5 0.173 −14.6 92.94 2.22
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表 4 不同摩尔量胆固醇脂质体的表征
PC∶胆固醇
(mol∶mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶10 不均匀 — — — — — — 70∶20 均匀 无沉淀 119.4 0.108 −11.0 96.69 0.96 70∶25 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶30 均匀 无沉淀 147.7 0.095 −12.7 94.56 0.88 70∶40 不成膜 — — — — — —
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表 5 不同摩尔量DSPE-PEG2000脂质体的表征
PC: DSPE-PEG2000
(mol:mol)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 70∶0 不成膜 — — — — — — 70∶1 不成膜 — — — — — — 70∶5 均匀 无沉淀 173.2 0.194 −12.5 94.20 1.23 70∶10 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.37 70∶15 均匀 无沉淀 108.9 0.197 −11.0 97.07 1.34
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表 6 不同用量PdPC(OBu)8脂质体的表征
PdPC(OBu)8 :PC
(m:m)成膜 水化 粒径（l/nm） PDI Zeta电位（mV） 包封率（%） 载药量（%） 1∶400 均匀 无沉淀 179.3 0.140 −12.3 93.92 1.15 1∶300 均匀 无沉淀 157.4 0.143 −11.5 94.23 1.16 1∶200 均匀 无沉淀 145.9 0.142 −14.3 93.26 1.19 1∶100 均匀 无沉淀 136.2 0.144 −12.1 98.13 1.23 1∶50 不均匀 沉淀 — — — — —
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[1] 卢光照, 侯成, 张翮, 等. 光敏活性氧自由基响应脂质体的制备和评价[J]. 药学学报, 2017, 52(12):1942-1950. doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0864 [2] MIAO Z L, DENG Y J, DU H Y, et al. Preparation of a liposomal delivery system and its in vitro release of rapamycin[J]. Exp Ther Med,2015,9(3):941-946. doi: 10.3892/etm.2015.2201 [3] ABUD M B, LOUZADA R N, ISAAC D L C, et al. In vivo and in vitro toxicity evaluation of liposome-encapsulated sirolimus[J]. Int J Retina Vitreous,2019,5(1):1-10. doi: 10.1186/s40942-018-0153-8 [4] 王婷. 基于纳米脂质体的药物载体开发研究[J]. 科学技术创新, 2020(19):16-18. doi: 10.3969/j.issn.1673-1328.2020.19.008 [5] WANG J, GUO F, YU M, et al. Rapamycin/DiR loaded lipid-polyaniline nanoparticles for dual-modal imaging guided enhanced photothermal and antiangiogenic combination therapy[J]. J Control Release,2016,237:23-34. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.07.005 -
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