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中药知母（Anemarrhenae rhizoma）为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有清热泻火，肺热燥咳，滋阴润燥以及肠燥便秘等作用[1]。知母根茎中含有甾体皂苷类、黄酮类、双苯吡酮类、木质素类、多糖类和生物碱类等多种成分，甾体皂苷类是其首要药理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黄酮苷类单体成分具有降低血糖的作用，知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾体皂苷类单体成分具有改善学习记忆、抗老年痴呆的作用[2]。
《中国药典》（2020年版）将芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质量评价指标[3]，目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量测定方法多采用高效液相-紫外检测法，而知母中另外一类重要的活性成分甾体皂苷类，由于不存在共轭结构、缺少紫外吸收，需通过衍生化技术将其转化成有紫外特征吸收的物质；但这种操作复杂、耗时，且准确度受衍生物稳定性的影响较大[4-5]，因此紫外检测器并不适用于甾体皂苷类物质的检测。相比于紫外检测器，蒸发光散射检测器（ELSD）不要求化合物带有发色团或荧光基团，能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品；而且可以在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线和较高的分辨率。目前，已有应用HPLC-ELSD法对知母药材中单种成分或多成分含量测定的报道[6-7]，但是所建立的方法往往分析时间较长，消耗试剂较多。
本文建立了一种快速、简便、准确的HPLC-ELSD方法，可同时测定知母中3个黄酮类成分（新芒果苷、芒果苷、宝藿苷Ⅰ）和2个甾体皂苷类成分（知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ）的含量，可为知母药材质量控制提供参考依据。
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高效液相色谱仪（1260 InfinityⅡ Prime LC, 美国安捷伦公司）；蒸发光散射检测器（G4260B，美国安捷伦公司）；分析天平（XS205，梅特勒-托利多国际公司）、涡旋混合器（SCILOGEX MX-S，美国Scilogex公司）、超声波清洗器（2300TH型，上海安谱实验科技股份有限公司）。
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新芒果苷对照品（批号：3671）、芒果苷对照品（批号：5586）、知母皂苷BⅡ对照品（批号：1369）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：1869）、知母皂苷AⅢ对照品（批号：3892）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；知母药材由上海市食品药品检验所中药室赠予；色谱纯乙腈（北京迪科马科技有限公司）；色谱纯异丙醇（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析纯乙醇和乙酸（国药集团化学试剂有限公司）。
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精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量，置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液适量，超声溶解后，加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液，精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，最终得含芒果苷464 μg/ml，新芒果苷482 μg/ml，知母皂苷BⅡ 1084 μg/ml，宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml，知母皂苷AⅢ 200 μg/ml的混合对照品储备液，摇匀备用。
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取知母药材适量，干燥后粉碎，过3号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，称重，超声（功率300 W，60 Hz）处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量，使用50%乙醇补足所减失的质量，摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
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色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱程序设定为0～3 min，4%～10%A；3～5 min，10%A；5～7 min，20%A；7～11 min，20%～25%A；11～14 min，25%～90%A；14～18 min，90%A；18～19 min，90%～4%A；19～20 min，90%～4%A。柱温为30 ℃；流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃；漂移管温度为90 ℃；氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min，各成分之间分离度均>1.5。
图 1 知母混合对照品(A)和样品(B)的HPLC-ELSD色谱图
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精密量取1.6 ml混合对照品储备液和0. 4 ml 50%乙醇溶液，涡旋30 s混匀，后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定，以峰面积（A）的对数值与进样浓度（C）的对数值进行线性回归，考察结果见表1，表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。
表 1 知母中5种成分线性回归方程和线性范围
成分 回归方程 线性范围(μg/ml) r 新芒果苷 lgA=1.8601×lgC−1.6874 24.1～386 0.9993 芒果苷 lgA=1.8445×lgC−1.3955 23.2～371 0.9986 知母皂苷BⅡ lgA=1.43×lgC−0.184 54.2～867.2 0.9956 宝藿苷Ⅰ lgA=1.4974×lgC+0.3364 5.3～84.8 0.9968 知母皂苷AⅢ lgA=1.4808×lgC+0.2387 10～160 0.9989 -
精密吸取混合对照品20 μl，按上述色谱条件连续进样6次，计算5种成分峰面积的RSD值，结果显示，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%，表明仪器精密度良好。
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称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，平行称取6份，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%，RSD分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%，显示方法重复性良好。
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称取知母药材粉末0.5 g，按上述操作制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样测定，结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD分别为：2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%，说明样品在12 h内稳定。
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称取知母药材粉末0.25 g，精密称定，平行称取6份，分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表2，知母中5种成分的平均回收率为101.8%～105.0%，表明该方法准确度良好。
表 2 知母中5种成分加样回收率试验结果（n=6）
成分 原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）新芒果苷 4.06 4.80 9.01 103.2 101.8 1.5 4.11 4.80 8.99 101.9 4.19 4.80 9.07 101.8 3.99 4.80 8.87 101.8 4.07 4.80 9.04 103.5 4.09 4.80 8.83 98.69 芒果苷 2.08 2.13 4.26 102.8 102.2 2.5 2.10 2.13 4.20 98.73 2.14 2.13 4.39 105.3 2.04 2.13 4.27 10.0 2.08 2.13 4.19 99.07 2.09 2.13 4.28 102.7 知母皂苷BⅡ 18.45 10.80 29.88 105.77 104.91 1.28 18.65 10.8 29.93 104.5 19.04 10.80 30.59 107.0 18.14 10.80 29.55 105.6 18.50 10.80 29.65 103.2 18.59 10.80 29.75 103.4 宝藿苷Ⅰ 0.17 0.21 0.39 103.4 102.0 1.8 0.17 0.21 0.39 102.2 0.18 0.21 0.39 102.6 0.17 0.21 0.39 100.9 0.17 0.21 0.39 98.57 0.17 0.21 0.39 104.1 知母皂苷AⅢ 0.87 1.17 2.07 103.4 103.2 1.0 0.88 1.17 2.07 102.7 0.90 1.17 2.08 101.7 0.86 1.17 2.05 102.5 0.87 1.17 2.08 104.3 0.88 1.17 2.09 104.7 -
称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，按上述操作进样测定，计算各成分含量，最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。
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本研究首先采用乙腈-水作为流动相，结果发现新芒果苷、芒果苷峰形不佳，色谱峰出现分叉现象。考虑到该两种物质呈弱酸性，故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相以抑制其解离，结果显示其分叉现象消失，各峰之间的分离度良好，且基线平稳，因此最终采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为最终流动相系统。结果如图2所示。
图 2 不同流动相系统对新芒果苷（1）和芒果苷（2）的影响
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流动相流出色谱柱后在载气压力的作用下与雾化气体（氮气）在雾化室内混合形成细小的液滴（气溶胶），气体流量越低，形成的液滴越大，散射光越多，分析灵敏度增加，反之越小。但是较低的气体流量会造成溶剂难以蒸发，因此本研究考察了氮气流速分别为1.5、2.0、2.5 L/min时各待测物质的响应值，结果显示，当氮气流速为2.0 L/min 时待测物质响应值最大，信号噪音比率最大，适合分析。
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漂移管温度的设置主要取决于流动相的构成、样品的挥发性以及流动相的流速。一般来讲，对于有机溶剂含量比例高、流速低的流动相，其要求的漂移管温度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、宝藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml的混合对照品溶液，考察了漂移管温度分别为80、90、100 ℃时各待测物质的响应值，结果表明当漂移管温度为90 ℃时各物质峰面积响应值均较大，信号噪音比率最大，适合分析，因此最终漂移管温度采用90 ℃。结果如图3所示。
图 3 漂移管温度对待测物质响应值的影响
本研究建立了一种同时测定知母药材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在内的5种活性成分含量的HPLC-ELSD方法。该法快速、简便、准确度高，可为知母的质量评价和质量标准的提升提供科学依据，为知母有效成分的体内动态变化研究提供测定方法。
Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD
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摘要:
目的 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测方法（HPLC-ELSD）建立同时测定知母药材中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ及知母皂苷AⅢ的含量测定方法。 方法 采用Agilent poroshell 120 EC-C18柱，流动相采用乙腈-0.2%醋酸水系统，梯度洗脱；柱温为30 ℃，流速为0.7 ml/min；蒸发光散射检测器以氮气为雾化气，雾化气温度为40 ℃，漂移管温度为90 ℃，氮气体积流量为2.0 L/min；进样量为20 μl。 结果 5种成分均能达到基线分离，新芒果苷24.1～386 μg/ml（r=0.999 3）、芒果苷23.2～371 μg/ml（r=0.998 6）、知母皂苷BⅡ 54.2～867.2 μg/ml（r=0.995 6）、宝藿苷Ⅰ 5.3～84.8 μg/ml（r=0.996 8）、知母皂苷AⅢ 10～160 μg/ml（r=0.998 9）的浓度范围内呈现良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率在101.8%～105.0%之间，重复性RSD小于2.4%，知母药材中上述5种成分含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。 结论 该方法操作简便、准确、灵敏度高，可用于知母药材的多指标成分定量测定。 -
关键词:
- 高效液相色谱-蒸发光散射检测法 /
- 知母 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish a method for the simultaneous determination of new mangiferin, mangiferin, artemisinin BⅡ, icariin and artemisinin A in Anemarrhenae Rhizoma by high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector (HPLC-ELSD). Methods The column was Agilent Poroshell 120 EC-C18. The mobile phase used acetonitrile-0.2% acetic acid water system with gradient elution. Column temperature was 30 ℃. Flow rate was 0.7 ml/min. Evaporative light scattering detector used nitrogen as atomizing gas. The atomizing gas temperature was 40 ℃ and the drift tube temperature was 90 ℃. The nitrogen volume flow rate was 2.00 L/min and the sample volume was 20 μl. Results The five components were able to achieve baseline separation. Neomangiferin, Mangiferin, Anemaponin BⅡ, Baohuoside I , Anemarrhena saponin AⅢwere determined as 24.1-386 μg/ml (r=0.999 3), 23.2-371 μg/ml (r=0.998 6), 54.2-867.2 μg/ml(r=0.995 6), 5.3-84.8 μg/ml (r=0.996 8), 10-160 μg/ml (r=0.998 9) respectively, which showed a good linear relationship within the concentration range. The average recovery rate of the five components was between 101.8% and 105.0%, and the repeatability RSD was less than 2.4%. The content of the above five components in Zhimu medicinal materials were 1.62%, 0.82%, 7.36%, 0.07%, 0.34%, respectively. Conclusion The method is simple, accurate, and highly sensitive, which could be used as the quantitative determination of multiple index components of Anemarrhenae Rhizoma. -
近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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表 1 知母中5种成分线性回归方程和线性范围
成分 回归方程 线性范围(μg/ml) r 新芒果苷 lgA=1.8601×lgC−1.6874 24.1～386 0.9993 芒果苷 lgA=1.8445×lgC−1.3955 23.2～371 0.9986 知母皂苷BⅡ lgA=1.43×lgC−0.184 54.2～867.2 0.9956 宝藿苷Ⅰ lgA=1.4974×lgC+0.3364 5.3～84.8 0.9968 知母皂苷AⅢ lgA=1.4808×lgC+0.2387 10～160 0.9989 
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表 2 知母中5种成分加样回收率试验结果（n=6）
成分 原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）新芒果苷 4.06 4.80 9.01 103.2 101.8 1.5 4.11 4.80 8.99 101.9 4.19 4.80 9.07 101.8 3.99 4.80 8.87 101.8 4.07 4.80 9.04 103.5 4.09 4.80 8.83 98.69 芒果苷 2.08 2.13 4.26 102.8 102.2 2.5 2.10 2.13 4.20 98.73 2.14 2.13 4.39 105.3 2.04 2.13 4.27 10.0 2.08 2.13 4.19 99.07 2.09 2.13 4.28 102.7 知母皂苷BⅡ 18.45 10.80 29.88 105.77 104.91 1.28 18.65 10.8 29.93 104.5 19.04 10.80 30.59 107.0 18.14 10.80 29.55 105.6 18.50 10.80 29.65 103.2 18.59 10.80 29.75 103.4 宝藿苷Ⅰ 0.17 0.21 0.39 103.4 102.0 1.8 0.17 0.21 0.39 102.2 0.18 0.21 0.39 102.6 0.17 0.21 0.39 100.9 0.17 0.21 0.39 98.57 0.17 0.21 0.39 104.1 知母皂苷AⅢ 0.87 1.17 2.07 103.4 103.2 1.0 0.88 1.17 2.07 102.7 0.90 1.17 2.08 101.7 0.86 1.17 2.05 102.5 0.87 1.17 2.08 104.3 0.88 1.17 2.09 104.7
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