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随着经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病的患病率仍在逐年上升，血管并发症是导致患者残疾和死亡的主要原因，并给社会和经济的发展带来了沉重负担。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在各种因素刺激下，从骨髓动员到外周血，参与损伤内皮的修复，在血管新生中具有重要作用[1-3]。但是高血糖会导致EPCs数量减少及功能受损[4-5]。研究表明，雌激素降低是心血管疾病发病的危险因素。因此，本实验通过研究雌激素对糖尿病大鼠EPCs功能的改善作用并探讨可能的作用机制，为探讨糖尿病血管并发症提供理论依据。
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SPF 级 Wistar大鼠，雄性，体重（180±10）g（上海斯莱克实验动物有限公司）。实验期间，保持动物房室温在22 ℃左右，相对湿度70%左右，早8点至晚8点自动照明。动物自由进食，自由饮水，所有实验动物均符合实验动物伦理学要求。
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雌激素（Abcam公司）；链脲佐菌素（Sigma aldrich公司）；FITC标记的荆豆凝集素I(FITC-UAE-I)（美国Sigma公司）；Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)（Molecular Probe公司）；甲醛溶液（国药集团化学试剂有限公司）；基质胶（matrigel）（Thermo Fisher公司）；EGM-2 培养基（LON-ZA 公司）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司）；NO检测试剂盒（美国Abcam公司）。
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Wistar雄性大鼠，10~12周，适应性地喂养1周后，连续7 d空腹腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）55 mg/（kg·d），对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸钠缓冲液。7 d后测空腹血糖(禁食12 h)，将血糖值为13.5～25 mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠进行实验。注射STZ后，每周称体重，观察体重变化。大鼠给药、饲养过程中勤换垫料，勤补水。
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大鼠麻醉后处死，将大鼠整体置于75%乙醇浸泡10 min。取出大鼠，使用吸水纸吸干动物身上水分后转移至超净工作台，剥离胫骨，使用无菌剪刀减去骨头两端，使用1ml PBS通过注射器冲洗骨髓并将冲洗液转移至15 ml无菌离心管，冲洗过程重复操作3次。用密度梯度离心法获取单核细胞，将单核细胞重悬于培养基EGM-2并调整细胞浓度至1×106个/ml，接种于预先包被好纤维连接蛋白的细胞培养皿，置于细胞培养箱37 ℃和5%CO2条件下培养。培养3 d后洗去未贴壁细胞，以后每3 d换培养液培养至7 d。PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。
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培养7 d的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 ml离心管中，将细胞用PBS 1000r/min离心5 min，清洗3次。用PBS 100 μl重悬细胞，每管加入CD34和CD133抗体各2 μl，4 ℃避光孵育30 min后用PBS清洗离心，将细胞重悬于300 μl PBS中避光保存待上机检测；同时将消化的细胞采用DiI-Ac-LDL 和FITC-UAE-I双染，倒置荧光显微镜观察染色结果，双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。
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实验分3组：①对照组；②糖尿病组：M199培养基；③雌激素组：含雌激素10 nmol/L的M199培养基。在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育24 h 后进行实验。
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3组EPCs用0.25%胰酶消化，将细胞重悬于EBM-2 培养基中，调整细胞密度为5×105个/ml，并取100 μl接种于Transwell 上室，在下室中加入600 μl含50 ng/ml 血管内皮生长因子的EGM-2 培养基。37 ℃、5% CO2孵育24 h 后，取出上室，用棉球轻轻擦拭上室底部膜内上表面的细胞，下室上表面用甲醛室温固定20 min，于37 ℃用0.1%结晶紫染色30 min，用PBS多次冲洗晾干后在160倍光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计算迁移细胞数并计算平均值。
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在冰上将48 孔板预冷，然后加入150 μl的基质胶Matrigel，放置于37 ℃孵育30 min。3组EPCs用0.25%胰酶消化，将5×104个细胞接种于Matrigel上，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后，于160倍光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计算形成小管的数目并计算平均值。
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3组EPCs用0.25%胰酶消化，经PBS清洗2次，制成细胞悬液，采用NO检测试剂盒测定EPCs中NO的水平。按照说明书的操作方法，完成后置于酶标仪在540 nm波长处测定吸光度（A）。
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3组EPCs用0.25%胰酶消化，将100 μl细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl培养4 h，置于酶标仪于450 nm处测A值。
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收集3组EPCs并提取蛋白，应用BCA法进行蛋白质定量。蛋白样本经煮沸变性、SDS-PAGE电泳后加入兔抗人锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体(1∶1500稀释)，蛋白质湿法转移至硝基纤维素膜，羊抗兔二抗(1∶2000稀释)室温孵育2 h，用ECL化学发光法显色，Image J凝胶成像分析系统扫描成像，测定目标条带的A值，以β-actin为内参比较同一条带与β-actin的灰度值进行分析。
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收集3组EPCs上清液，按照说明书步骤进行操作。取各组细胞上清液各100 μl加入酶标板中37 ℃孵育90 min，然后加入100 μl生物素标记抗体工作液37 ℃孵育60 min。洗涤3次，加入100 μl酶结合物工作液在37 ℃孵育30 min后，洗涤5次。加入90 μl底物溶液37 ℃孵育15 min，最后加入终止液50 μl后，立即在450 nm波长处测量A值。
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实验数据以（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ）表示，采用GraghPad Prism软件进行统计处理，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验差异的显著性。以P<0.05为差异有统计学意义。 -
正常组大鼠，精神状态良好，动作自如，反应灵敏，毛发平伏有光泽。而糖尿病大鼠体重变轻，精神萎靡，反应迟钝，毛杂乱无光泽，动作迟缓，弓背捲体，尿量显著增加。在建模4周后，糖尿病模型组空腹血糖值（23.33±3.61）mmol/L明显高于对照组（16.91±2.30）mmol/L，组间差异有统计学意义(P<0.01) (图1A) 。对照组动物体重随时间增加而增加，模型组在前3周随时间缓慢增加，但最后1周出现体重下降趋势。在第3、4周，两组动物体重有显著差异(P<0.01) (图1B) 。
图 1 STZ诱导后Wistar大鼠血糖及体重变化
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以EGM-2培养基定向诱导培养5 d后，镜下观察可见贴壁细胞形态由圆形逐渐向梭形转化（图2A）。流式细胞仪检测结果显示，CD34与CD133双阳性细胞占比不小于总细胞数的85.63%（图2B）。采用Dil-Ac-LDL和TITC-UEA-1双染细胞，显示红绿荧光双阳性细胞占视野中细胞的绝大多数（图2C）。上述结果表明，我们成功地制备了大鼠骨髓来源EPCs细胞，且细胞具有较高纯度。
图 2 大鼠骨髓来源的EPCs分离培养和鉴定
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与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs的对数期增殖活性明显降低(P<0.01)，而雌激素孵育后其增殖活性明显改善（P<0.01）（图3A）。与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs的小管形成功能明显下降（P<0.01），而雌激素能够明显改善其小管形成功能（P<0.01）（图3B）。细胞迁移实验表明，与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs细胞迁移能力明显受损（P<0.01），而雌激素孵育能够明显改善受损的细胞迁移能力（P<0.01）（图3C）。
图 3 雌激素对糖尿病大鼠EPCs增殖、小管形成功能及迁移能力的改善
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糖尿病大鼠EPCs细胞中NO含量较对照组明显降低(P<0.05)，而雌激素孵育能够明显上调NO的含量(P<0.01)（图4A）。
图 4 雌激素孵育增加EPCs中NO水平并下调EPCs上清液中TSP-1表达及上调MnSOD的表达
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糖尿病组大鼠EPCs细胞上清液中TSP-1含量明显高于对照组(P<0.01)，而给与雌激素孵育后细胞上清液中TSP-1含量明显降低(P<0.05，图4C）。Western blotting检测显示，糖尿病组大鼠EPCs中MnSOD蛋白表达较对照组明显降低(P<0.01)，而雌激素孵育能够明显上调细胞中MnSOD蛋白表达(P<0.01)（图4D）。
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EPCs主要来源于骨髓，在血管新生中具有重要作用。1997年Asahara等[1]首次将其命名为内皮祖细胞，而后其在心血管方面的研究越来越多。EPCs与心血管疾病存在密不可分的联系。研究表明，EPCs的数量和功能与高血压、糖尿病、血脂等呈负相关[8-11]。此外，EPCs在脑缺血、阿尔茨海默症治疗中表现出较好的疗效[12-13]。故改善EPCs功能及增加其数量可作为改善糖尿病血管并发症的新靶点。并将能表达CD34、CD133 等干细胞特征或血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)等细胞标志物定义为EPCs[14]。用密度梯度离心法获取骨髓单核细胞，经培养并采用流式细胞术和荧光显微镜法对细胞进行鉴定，结果表明本实验成功制备大鼠骨髓来源EPCs细胞，且细胞具有较高纯度。
流行病学提示雌激素为心脑血管疾病的保护因素。绝经后女性卒中发生风险明显高于绝经前女性[15]。美国的调查数据显示，年龄在18～39岁的成年男性发生高血压的风险高于同龄女性，但是在年龄大于60岁成人中男性风险低于女性[16]。不同性别发生高血压及靶器官损伤的差异与雌激素相关[17]。此外，杨莹莹[18]等的研究表明雌激素对急性期高血压脑出血患者的EPCs功能有改善作用且与雌激素浓度呈正相关。但是雌激素对糖尿病EPCs功能改善作用及相关机制的研究较少。
本实验采用腹腔注射链脲佐菌素制作大鼠糖尿病模型，提取其骨髓来源的EPCs进行实验，结果发现糖尿病大鼠骨髓EPC的增殖能力较正常EPCs明显下降，而雌激素体外孵育能明显促进其增殖活力；除增殖活力受到抑制外，糖尿病大鼠EPCs的迁移能力和小管形成功能也明显受损，而在体外给予雌激素10 nmol/L孵育后细胞功能得到明显改善。说明雌激素能促进糖尿病大鼠EPCs的增殖并改善其功能。
研究表明氧化应激可导致血管内皮损伤。MnSOD是一种存在于线粒体并能清除机体新陈代谢中产生的过多的氧自由基（O2·−）等有害物质的一种酶[19,]。MnSOD在一定程度上能抵抗高糖所增加线粒体中的活性氧（ROS）细胞的伤害[20]。本实验采用Western blotting检测EPCs细胞中MnSOD蛋白表达，糖尿病组大鼠EPCs细胞中MnSOD蛋白表达明显低于对照组，而给与雌激素体外孵育后能明显上调细胞中MnSOD蛋白表达，说明雌激素通过上调EPCs中MnSOD水平而改善细胞功能。
一氧化氮(NO)与血管健康密切相关。NO通过促进EPCs向内皮细胞分化进而修复受伤的内皮，而抑制内源性NO的合成对EPCs的迁移能力有不良影响[21]。有文献报道，高血糖通过增加活性氧积聚、降低一氧化氮生物利用度及抑制内皮依赖性血管舒张功能，导致严重的血管内皮功能障碍[22-23]。凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）属细胞外基质糖蛋白，其过表达能抑制EPCs的功能[24]，而NO含量降低能诱导TSP-1的表达[25]。本实验发现，糖尿病组大鼠EPCs中NO含量明显降低而细胞上清中TSP-1含量明显升高，雌激素处理能够逆转上述改变，说明雌激素通过增加EPC内NO水平并降低TSP-1含量进而改善糖尿病EPCs功能。
综上所述，本研究证实雌激素能改善受损的糖尿病大鼠EPCs功能并促进其增殖，作用机制可能与其降低细胞内的氧化应激及下调TSP-1的表达相关。本研究为将来进一步进行雌激素在糖尿病血管并发症方面的研究提供了深入的实验与理论依据。
Effect and mechanism of estrogen on EPCs function in diabetic rats
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摘要:
目的 探索雌激素对糖尿病大鼠内皮祖细胞(EPCs)功能的影响及其可能的作用机制。 方法 取健康Wistar大鼠骨髓提取EPCs并采用流式细胞仪和荧光显微镜鉴定。大鼠给予链脲佐菌素诱导为糖尿病模型，提取正常大鼠和糖尿病大鼠骨髓EPCs并培养，糖尿病大鼠EPCs体外给予雌激素10 nmol/L孵育24 h。检测EPCs增殖和功能；测定EPCs中锰超氧化物歧化酶(MnSOD)水平和NO水平及上清液中凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)蛋白水平。 结果 与对照组比较，糖尿病EPCs的细胞增殖能力、迁移能力和小管形成功能受损(P<0.01)，而雌激素体外干预后细胞增殖能力、迁移能力和小管形成功能均得到改善(P<0.01)；糖尿病EPCs中MnSOD水平和NO水平明显下调，上清液中TSP-1蛋白水平升高(P<0.01)；雌激素孵育能逆转上述改变(P<0.01)。 结论 雌激素能改善糖尿病大鼠EPCs迁移能力和小管形成功能,作用机制可能与其降低糖尿病EPCs内的氧化应激及下调TSP-1的表达相关。 Abstract:Objective To explore the effect and mechanism of estrogen on endothelial progenitor cells（EPCs）function in diabetic rats. Methods EPCs were isolated from bone marrow of rats and characterized by fluorescence microscopy and flow cytometry. Rat diabetic model was established via streptozotocin induction. The bone marrow was taken to culture EPCs. EPCs of diabetes were incubated with Estrogen 10 nmol/L for 24h. The functions and proliferation of EPCs in vitro were detected. The levels of MnSOD and NO in EPCs and TSP-1 in supernatant were assayed. Results Compared with control group, EPCs proliferation, adhesion and angiogenesis functions were impaired in diabetic rats. The level of MnSOD and NO in diabetic EPCs were significantly decreased, while TSP-1 protein level in the supernatant increased. The above changes can be reversed with estrogen incubation. Conclusion Estrogen improved the EPCs migration and tubule formation in diabetic rats. The mechanism may be related to the reduction of oxidative stress and downregulation of TSP-1 expression in diabetic EPCs. -
随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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图 1 STZ诱导后Wistar大鼠血糖及体重变化
A.STZ造模4周后两组大鼠空腹血糖比较；B.STZ造模4周两组大鼠体重随时间变化曲线(n=12)**P<0.01，与对照组比较。
图 2 大鼠骨髓来源的EPCs分离培养和鉴定
A.细胞形态学; B.流式细胞仪鉴定：用CD34和CD133两种抗体标记，双标阳性的细胞为EPCs; C.荧光染色鉴定：Dil-Ac-LDL与TITC-UEA-1双染色阳性的细胞为EPCs。
图 3 雌激素对糖尿病大鼠EPCs增殖、小管形成功能及迁移能力的改善
A.细胞增殖能力；B.EPCs小管形成功能：左为成管数量组间比较，右为常规视野成像；C.EPCs迁移能力：左为穿膜细胞的荧光计数组间比较，右为Transwell底部穿膜细胞染色；EPCs: 对照组大鼠EPCs; EPCs(DM): 糖尿病大鼠EPCs; EPCs(DM)+ estrogen:雌激素体外孵育的糖尿病大鼠EPCs (n=12)；**P<0.01，与EPCs组比较；##P<0.01，与EPCs(DM)组比较。
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[1] ASAHARA T, MUROHARA T, SULLIVAN A, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science,1997,275(5302):964-967. doi: 10.1126/science.275.5302.964 [2] ACKERMANN M, PABST A M, HOUDEK J P, et al. Priming with proangiogenic growth factors and endothelial progenitor cells improves revascularization in linear diabetic wounds[J]. Int J Mol Med,2014,33(4):833-839. doi: 10.3892/ijmm.2014.1630 [3] 董雅芬, 舒菁菁, 马靖, 等. 天然药物及其活性成分保护内皮祖细胞机制的研究进展[J]. 药学实践杂志, 2013, 31 1): 11-13, 31. [4] TAN Q, LI Y, LI X, et al. Hyperinsulinemia impairs functions of circulating endothelial progenitor cells[J]. Acta Diabetol, 2019, 56(7): 785-795. [5] WEI H J, LIU L, CHEN F L, et al. Decreased numbers of circulating endothelial progenitor cells are associated with hyperglycemia in patients with traumatic brain injury[J]. Neural Regen Res,2019,14(6):984-990. doi: 10.4103/1673-5374.250577 [6] 赵小亚, 江如钞, 肖青. MMP2介导Sonic hedgehog信号通路对糖尿病内皮祖细胞功能的影响[J]. 广州医科大学学报, 2021, 49(1):1-6. doi: 10.3969/j.issn.2095-9664.2021.01.01 [7] 尚刘文心, 孙昕, 彭程, 等. 药物体外干预改善盐敏感性高血压小鼠内皮祖细胞功能研究[J]. 药学实践杂志, 2020, 38(3):221-226. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912074 [8] PIRES A, MARTINS P, PAIVA A, et al. Circulating endothelial progenitor cells in obese children and adolescents[J]. J Pediatr (Rio J),2015,91(6):560-566. doi: 10.1016/j.jped.2015.01.011 [9] ARAGONA C O, IMBALZANO E, MAMONE F, et al. Endothelial progenitor cells for diagnosis and prognosis in cardiovascular disease[J]. Stem Cells Int,2016,2016:8043792. [10] YUE D D, WEI Z Y, CHEN X, et al. Predictive value of circulating endothelial progenitor cells in prognosis of acute ischemic stroke[J]. J Shanghai Jiaotong Univ Med Sci,2017,37(7):964-968.[LinkOut [11] KANG H, MA X, LIU J, et al. High glucose-induced endothelial progenitor cell dysfunction[J]. Diab Vasc Dis Res,2017,14(5):381-394. doi: 10.1177/1479164117719058 [12] HECHT N, SCHNEIDER U C, CZABANKA M, et al. Endothelial progenitor cells augment collateralization and hemodynamic rescue in a model of chronic cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(8):1297-1305. doi: 10.1038/jcbfm.2014.78 [13] SAFAR M M, ARAB H H, RIZK S M, et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells protect against scopolamine-induced alzheimer-like pathological aberrations[J]. Mol Neurobiol,2016,53(3):1403-1418. doi: 10.1007/s12035-014-9051-8 [14] LANUTI P, ROTTA G, ALMICI C, et al. Endothelial progenitor cells, defined by the simultaneous surface expression of VEGFR2 and CD133, are not detectable in healthy peripheral and cord blood[J]. Cytometry A,2016,89(3):259-270. doi: 10.1002/cyto.a.22730 [15] 康鑫, 李光勤, 刘明苏, 等. 绝经后女性雌激素水平与缺血性脑卒中相关性的meta分析[J]. 当代医学, 2019, 25(1):14-18. doi: 10.3969/j.issn.1009-4393.2019.01.006 [16] FRYAR C D, OSTCHEGA Y, HALES C M, et al. Hypertension prevalence and control among adults: United States, 2015-2016[J]. NCHS Data Brief,2017(289):1-8. [17] SABBATINI A R, KARARIGAS G. Estrogen-related mechanisms in sex differences of hypertension and target organ damage[J]. Biol Sex Differ,2020,11(1):31. doi: 10.1186/s13293-020-00306-7 [18] 杨莹莹, 陈秋娟, 袁文, 等. 不同浓度雌激素对急性期高血压脑出血患者的内皮祖细胞功能及衰老的影响[J]. 山西医药杂志, 2017, 46(3):250-253. [19] BRESCIANI G, DA CRUZ I B M, GONZÁLEZ-GALLEGO J. Manganese superoxide dismutase and oxidative stress modulation[J]. Adv Clin Chem,2015,68:87-130. doi: 10.1016/bs.acc.2014.11.001 [20] 张鹏, 刘琰, 李萌, 等. 高糖环境下锰超氧化物歧化酶转染间充质干细胞促进抗氧化酶类表达[J]. 中国现代医学杂志, 2014, 24(20):27-30. doi: 10.3969/j.issn.1005-8982.2014.20.006 [21] LEMARIÉ C A, SHBAT L, MARCHESI C, et al. Mthfr deficiency induces endothelial progenitor cell senescence via uncoupling of ENOS and downregulation of SIRT1[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,300(3):H745-H753. doi: 10.1152/ajpheart.00321.2010 [22] 马春霞, 王利, 王萍, 等. 内毒素、NO及NOS在危重病应激性高血糖中的作用研究[J]. 宁夏医学杂志, 2016, 38(1):21-23. doi: 10.13621/j.1001-5949.2016.01.0021 [23] CERIELLO A, NOVIALS A, ORTEGA E, et al. Evidence that hyperglycemia after recovery from hypoglycemia worsens endothelial function and increases oxidative stress and inflammation in healthy control subjects and subjects with type 1 diabetes[J]. Diabetes,2012,61(11):2993-2997. doi: 10.2337/db12-0224 [24] HU H, WANG B S, JIANG C Y, et al. Endothelial progenitor cell-derived exosomes facilitate vascular endothelial cell repair through shuttling miR-21-5p to modulate Thrombospondin-1 expression[J]. Clin Sci,2019,133(14):1629-1644. doi: 10.1042/CS20190188 [25] XIE H H, ZHOU S, CHEN D D, et al. GTP cyclohydrolase I/BH4 pathway protects EPCs via suppressing oxidative stress and thrombospondin-1 in salt-sensitive hypertension[J]. Hypertension,2010,56(6):1137-1144. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.160622 -
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