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替考拉宁是一种糖肽类抗生素，临床上主要用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，包括不能用青霉素类和头孢菌素类其他抗生素者。该药的血药浓度与临床疗效密切相关，对于重症感染患者，监测血药浓度可以提高治愈率[1]。临床一般检测其在血浆中的稳态谷浓度，而在不同疾病中，替考拉宁谷浓度需达到对应的目标值才能满足治疗要求，但由于替考拉宁成分复杂，患者在常规剂量使用过程中低于目标谷浓度的发生率很高，因此，对替考拉宁进行血药浓度监测很有必要[2-4]。替考拉宁血浆谷浓度的检测方法目前主要为高效液相色谱（HPLC）法，需要专职人员进行，很多单位尚无条件进行检测。因此，寻找替考拉宁谷浓度的临床预测指标，探讨其与替考拉宁谷浓度的关系，就显得尤为重要。替考拉宁血浆蛋白结合率高，与白蛋白的结合率为 90%～95%，消除半衰期长，除 2%～3% 经肝脏代谢外，大部分以原型经肾脏排泄。肾功能的变化必然对替考拉宁谷浓度产生明显影响，既往研究也显示肌酐清除率会对替考拉宁谷浓度产生明显影响[5-7]。胱抑素C是一种能灵敏反映肾小球滤过率变化的内源性标志物[8]，其血中浓度由肾小球滤过率决定，不受炎症反应、肌肉、性别等的影响。本研究主要探讨胱抑素C水平与替考拉宁血浆稳态谷浓度的关系，以期为临床替考拉宁的合理应用提供依据。
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本研究收集2017年10月−2020年7月在陆军军医大学第一附属医院进行替考拉宁血药浓度监测患者。患者纳入标准：①年龄≥18岁；②住院患者；③替考拉宁谷浓度为稳态谷浓度。排除标准：①孕妇；②未监测肝肾功能者；③血液透析者。本研究经本院伦理委员会批准（批号：KY2020109）。
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患者每日经静脉滴注给予替考拉宁（给药剂量为200～800 mg，qd，根据患者疗效和不良反应以及血药浓度监测结果对给药剂量进行调整；患者疗程为7～67 d），最早于第6剂（替考拉宁谷浓度达稳态）给药前30 min，用EDTA管采集静脉血4 ml，3 500 r/min室温离心5 min，取出血浆按下述高效液相色谱（HPLC）法测定其谷浓度。替考拉宁对照品溶液：取替考拉宁对照品适量，精密称定（20.00 mg）后置于10 ml棕色量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，混匀，即得。哌拉西林钠对照品溶液：取哌拉西林钠对照品（内标）适量，精密称定（15.43 mg）后置于100 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得。色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：40 ℃；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钠-乙腈（76∶24，V/V）；流速：1.6 ml/min；紫外检测波长为240 nm；进样量：20 µl。取待测血浆0.4 ml，加入50 µl内标甲醇液（150 µg/ ml），涡旋混匀30 s，随后再加入乙腈0.6 ml，涡旋混匀1 min，13 000 r/min，离心5 min，取出上清液0.9 ml加入0.4 ml二氯甲烷，涡旋混匀1 min，13 000 r/min，离心5 min，上清液20 µl进样测定。
空白血浆中加入替考拉宁对照品溶液适量，再依次用空白血浆分别稀释成3.125、6.250、12.50、25.00、50.00、100.0 µg/ml系列浓度，处理后上液相色谱仪测定，记录色谱图，将替考拉宁（TA2-2）与内标的峰面积比值（R）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程（n=6）：R＝0.6821C−2.186×10−2，r=0.9999，线性范围：3.125～100.0 µg/ml，本试验最低定量限为3.125 µg/ml，其5次测量值的RSD为2.57 %。
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炎症指标、肾功能指标、肝功能指标及其他实验室检查指标均由本院检验科测定。胱抑素C的检测采用胶乳增强免疫比浊法测定。质控品按其说明书进行操作，每天进行一次质控实验。试剂空白吸光度：波长546 nm，光径10 mm，测得吸光度值A≤1.5000。线性范围：0.2～8 mg/L范围内线性相关系数r≥0.995，0.2～2.0 mg/L范围内绝对偏差≤0.2 mg/L，2.0～8 mg/L范围内相对偏差≤10.0%。准确度：相对偏差≤10.0%。分析灵敏度：样本浓度为1.0 mg/L时，吸光度差值为0.0060～0.0600。
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收集患者的人口统计学资料，包括患者性别、年龄、感染类型和病原菌，给药剂量、给药方式、替考拉宁谷浓度，与替考拉宁谷浓度监测同一时间点的炎症指标降钙素原（PCT），肾功能指标血肌酐和胱抑素C，肝功能相关指标谷丙转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白、白蛋白、胆红素、直接胆红素，以及葡萄糖水平等。
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采用SPSS 18.0统计软件进行分析。对计数资料行χ2检验；对连续性变量先进行正态分布检验，对不符合正态分布的变量，以中位数（第25百分位数，第75百分位数）表示。不同胱抑素C水平下替考拉宁谷浓度不符合正态分布，行 Mann-Whitney检验；Logistic回归分析替考拉宁谷浓度不达标（<15 µg/ml）的影响因素，以P<0.05为差异有统计学意义。
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共入组98例患者141个谷浓度，其中男65例、女33例，年龄19～94（52.2±16.2）岁，60岁以上者32例（32.0%）。患者肺部感染57例，粒细胞缺乏伴感染14例，腹腔感染12例，感染性心内膜炎4例，其他11例；感染检出病原菌有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、大肠埃希菌和嗜麦芽窄食单胞菌等。入组患者的炎症指标PCT的均值为2.09，说明患者的感染程度较重。患者的实验室检查指标情况见表1。
表 1 患者的实验室检查指标
指标 中位数（第25，
第75百分位数）范围 ALT（U/L） 7.60（3.45，22.42） 3.2～339.4 AST（U/L） 21.30（12.50，45.40） 5.4～624.6 总蛋白（g/L） 60.05（54.52，67.28） 42.3～103.8 白蛋白（g/L） 32.00（28.30，35.15） 20.8～43.9 胆红素（mol/L） 19.70（13.10，44.20） 4.8～698.78 直接胆红素（mol/L） 7.00（5.36，9.63） 1.0～437.8 血肌酐（mol/L） 66.04（46.00，98.60） 22.6～482.9 胱抑素C（mg/L） 1.22（0.91，1.94） 0.45～6.37 降钙素原（ng/ml） 0.61（0.26，2.07） 0.02～20.98 注：表中括弧中数据为四分位中位数。 -
患者替考拉宁谷浓度为11.51（8.35，19.07）µg/ml，范围为3.57～41.93 µg/ml，谷浓度<15 µg/ml者95例次（67.38 %）。替考拉宁给药剂量为400 mg时，谷浓度<15 µg/ml的百分比为80.90 %（72/89）；替考拉宁给药剂量为800 mg时，谷浓度<15 µg/ml的百分比为42.86 %（18/42）；两种给药剂量比较，差异有统计学意义（χ2=19.205，P<0.01）。
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胱抑素C浓度>1.05 mg/L时，替考拉宁谷浓度明显高于胱抑素C浓度在0.3～1.05 mg/L时（Z=-2.636，P=0.008），见表2。
表 2 不同胱抑素C水平下替考拉宁谷浓度
胱抑素C（mg/L） 替考拉宁浓度（µg/ml） 替考拉宁浓度范围（µg/ml） ≤1.05 8.68（6.34，11.79） 3.57～26.47 >1.05 11.37（8.96，20.52） 3.73～41.93 注：表中括弧中数据为四分位中位数。 -
炎症指标PCT，肝功能相关指标总蛋白、白蛋白、胆红素、直接胆红素和葡萄糖水平与替考拉宁谷浓度不相关（P>0.05）。血肌酐浓度与替考拉宁谷浓度呈正相关（P<0.01），胱抑素C浓度与替考拉宁谷浓度呈正相关（P<0.05），见表3。
表 3 各指标与替考拉宁谷浓度的相关性
指标名称 r值 P值 胱抑素C（mg/L） 0.225 0.036 血肌酐（mol/L） 0.248 0.009 降钙素原（ng/ml） 0.048 0.706 总蛋白（g/L） 0.032 0.746 白蛋白（g/L） 0.140 0.134 胆红素（mol/L） −0.025 0.798 直接胆红素（mol/L） −0.041 0.670 葡萄糖（mmol/L） 0.084 0.426 -
通过纳入替考拉宁谷浓度影响因素如患者性别、年龄、胱抑素C、血肌酐、ALT、AST、白蛋白、总蛋白、胆红素、直接胆红素进行Logistic回归分析，结果显示，替考拉宁谷浓度不达标（<15 µg/ml）的影响因素是患者年龄、胱抑素C和白蛋白水平（P<0.05），见表4。
表 4 替考拉宁谷浓度不达标影响因素的Logistic回归分析
因素 OR值 95%CI P值 胱抑素C 1.529 1.001～2.336 0.049 白蛋白 1.154 1.025～1.299 0.018 年龄 0.952 0.917～0.989 0.012 -
替考拉宁的血药浓度与临床疗效间存在较强的相关性，研究显示，治疗严重感染时，替考拉宁有效血谷浓度不应<10 mg/L，但目前临床使用中却发现其血药浓度达标率普遍偏低[3-4, 9]。2017年，注射用替考拉宁说明书的变更获批，提出重度感染时，替考拉宁谷浓度应达到15～30 mg/L。因此，本研究以替考拉宁谷浓度<15 µg/ml为不达标，而本研究中不达标患者百分比为67.38%，值得引起重视。给予标准负荷剂量6 mg/kg的替考拉宁早期均不能达到目标谷浓度，不论患者肌酐清除率正常与否；给予高负荷剂量10 mg/kg替考拉宁的低肌酐清除率者早期可达目标谷浓度[10-11]。本研究中，替考拉宁给药剂量为800 mg时，其谷浓度达标的百分比明显高于替考拉宁给药剂量为400 mg时，提示临床上应提高替考拉宁负荷剂量的使用率。
近年来研究表明血清胱抑素C能更准确地评价患者肾功能[5]。正常情况下，胱抑素C在血清和血浆中的浓度为0.3～1.05 mg/L。当肾功能受损时，胱抑素C在血液中的浓度会升高。有研究考察了胱抑素C、肌酐清除率和肾小球滤过率3种评价指标对替考拉宁体内代谢的影响，结果显示胱抑素C是影响替考拉宁清除率最显著的协变量[12-13]。因此，本研究考察了胱抑素C水平与替考拉宁谷浓度的关系，结果显示，胱抑素C水平高于正常值上限时，替考拉宁谷浓度明显升高。另外，替考拉宁谷浓度不达标影响因素的Logistic回归分析结果显示，胱抑素C是替考拉宁谷浓度不达标的影响因素。
研究显示，肌酐清除率显著影响替考拉宁的谷浓度[4,7,11]，但血肌酐对替考拉宁谷浓度的影响无统计学意义[4]。本研究中，血肌酐浓度越高，替考拉宁谷浓度越高，但血肌酐不是替考拉宁谷浓度不达标的影响因素。有研究显示，白蛋白为影响替考拉宁清除率的主要因素[7]。本研究中，白蛋白水平虽与替考拉宁谷浓度不存在相关性，与相关研究相符[5]，但白蛋白是替考拉宁谷浓度不达标的影响因素。另有研究显示，替考拉宁谷浓度与剂量的比值与炎症指标超敏 C 反应蛋白成负相关[6]，本研究考察了另一炎症指标PCT与替考拉宁谷浓度的相关性，结果显示PCT与替考拉宁谷浓度不存在相关性。分析原因可能与影响替考拉宁谷浓度的其他因素，如年龄、性别、体重指数、给药剂量和肾功能差异等有关；也可能与PCT和C反应蛋白虽然同是炎症指标，但二者产生的机制，发挥的生理作用和临床预测价值不同有关。
本研究的不足之处：由于每例患者替考拉宁谷浓度监测次数多为1～2次，本研究未考察替考拉宁谷浓度与疗效的相关性，而只是考察了替考拉宁谷浓度的影响因素。终上所述，本研究结果显示，替考拉宁给药剂量为400 mg时，谷浓度不达标<15 µg/ml的百分比明显高于替考拉宁给药剂量为800 mg时，提示临床上应提高替考拉宁负荷剂量的使用率。胱抑素C浓度高于正常值上限时替考拉宁谷浓度明显升高，是替考拉宁谷浓度不达标的影响因素，提示除肌酐清除率外，无条件进行替考拉宁血药浓度监测的单位，可以考虑将胱抑素C作为替考拉宁剂量调整的参考指标。
Study on the relationship between cystatin C level and the plasma trough concentration of teicoplanin
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摘要:
目的 探讨胱抑素C水平与替考拉宁血浆谷浓度的关系，为临床替考拉宁的合理应用提供依据。 方法 回顾性分析2017年10月至2020年7月我院收治的使用替考拉宁患者的临床资料。考察替考拉宁血浆谷浓度的分布情况，比较不同胱抑素C水平下替考拉宁血浆谷浓度，Logistic回归分析替考拉宁谷浓度不达标（<15 µg/ml）的影响因素。 结果 共入组98例患者，141个谷浓度，其中男65例、女33例，年龄19～94（52.2±16.2）岁。替考拉宁血浆谷浓度为11.51 (8.35，19.07) µg/ml，范围为3.57～41.93 µg/ml，谷浓度<15 µg/ml者95例次（67.38%）。胱抑素C浓度高于正常值上限（>1.05 mg/L）时，替考拉宁谷浓度为11.37 (8.96，20.52) µg/ml，明显高于胱抑素C浓度在正常范围内的8.68 (6.34，11.79) µg/ml（Z=−2.636，P<0.05）。Logistic回归分析显示胱抑素C水平为替考拉宁谷浓度不达标的影响因素（OR=1.529，95% CI=1.001～2.336，P<0.05）。 结论 胱抑素C浓度高于正常值上限时替考拉宁谷浓度明显升高，是替考拉宁谷浓度不达标的影响因素，临床上可以考虑将其作为替考拉宁剂量调整的参考指标。 Abstract:Objective To investigate the relationship between cystatin C level and the plasma trough concentration of teicoplanin, so as to provide a reference for the rational application of teicoplanin in clinical practice. Methods The clinical data of the patients receiving teicoplanin, who admitted to our hospital from October 2017 to July 2020 were retrospectively analyzed. The distribution of teicoplanin concentration, the difference of teicoplanin concentration under different cystatin C level, and influence factors for teicoplanin concentration (<15 µg/ml) were analyzed. Results A total of 98 patients including 65 males and 33 females, aged 19 to 94 (52.2±16.2) years old, with 141 trough concentrations were enrolled. The trough concentration of teicoplanin was 11.51 (8.35, 19.07) µg/ml, and the range was 3.57-41.93 µg/ml. 95 cases (67.38%) had teicoplanin concentration <15 µg/ml. When the concentration of cystatin C was >1.05 mg/L, the trough concentration of teicoplanin were 11.37 (8.96, 20.52) µg/ml, significantly higher than those when the concentration of cystatin C was in normal [8.68 (6.34, 11.79) µg/ml, Z=−2.636, P<0.05]. Logistic regression analysis showed that cystatin C level was the influencing factor for teicoplanin trough concentration does not meet the standard (OR=1.529, 95%CI=1.001-2.336, P<0.05). Conclusion The concentration of teicoplanin is significantly increased when the cystatin C level is higher than the normal. Cystatin C level is the influence factor for teicoplanin trough concentration not meeting the standard. The cystatin C level may be considered as a reference for teicoplanin dosage adjustment in clinical practice. -
Key words:
- teicoplanin /
- infection /
- therapeutic drug monitoring /
- cystatin C
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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表 1 患者的实验室检查指标
指标 中位数（第25，
第75百分位数）范围 ALT（U/L） 7.60（3.45，22.42） 3.2～339.4 AST（U/L） 21.30（12.50，45.40） 5.4～624.6 总蛋白（g/L） 60.05（54.52，67.28） 42.3～103.8 白蛋白（g/L） 32.00（28.30，35.15） 20.8～43.9 胆红素（mol/L） 19.70（13.10，44.20） 4.8～698.78 直接胆红素（mol/L） 7.00（5.36，9.63） 1.0～437.8 血肌酐（mol/L） 66.04（46.00，98.60） 22.6～482.9 胱抑素C（mg/L） 1.22（0.91，1.94） 0.45～6.37 降钙素原（ng/ml） 0.61（0.26，2.07） 0.02～20.98 注：表中括弧中数据为四分位中位数。 
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表 2 不同胱抑素C水平下替考拉宁谷浓度
胱抑素C（mg/L） 替考拉宁浓度（µg/ml） 替考拉宁浓度范围（µg/ml） ≤1.05 8.68（6.34，11.79） 3.57～26.47 >1.05 11.37（8.96，20.52） 3.73～41.93 注：表中括弧中数据为四分位中位数。
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表 3 各指标与替考拉宁谷浓度的相关性
指标名称 r值 P值 胱抑素C（mg/L） 0.225 0.036 血肌酐（mol/L） 0.248 0.009 降钙素原（ng/ml） 0.048 0.706 总蛋白（g/L） 0.032 0.746 白蛋白（g/L） 0.140 0.134 胆红素（mol/L） −0.025 0.798 直接胆红素（mol/L） −0.041 0.670 葡萄糖（mmol/L） 0.084 0.426
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表 4 替考拉宁谷浓度不达标影响因素的Logistic回归分析
因素 OR值 95%CI P值 胱抑素C 1.529 1.001～2.336 0.049 白蛋白 1.154 1.025～1.299 0.018 年龄 0.952 0.917～0.989 0.012
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