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补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，是由30多种广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面的蛋白质组成的，具有精密调控机制的蛋白质反应系统，其主要通过3种途径激活：经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素途径。补体系统正常激活，可在靶细胞上形成膜攻击复合物，导致靶细胞的溶解，补体的这一功能在机体的免疫系统中起重要的防御和免疫监视作用，对抵御外来微生物的入侵和维持机体平衡有重要的作用。然而该系统的过度激活将释放炎性过敏毒素C3a和C5a，具有化学诱导作用的C5a能趋化嗜中性粒细胞、中核细胞和嗜酸性粒细胞，这些细胞释放蛋白酶和具有趋化作用细胞因子，进一步聚集T、B淋巴细胞和其他炎性细胞，从而促进炎症反应的发生，引起系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎等[1-2]。近年来已有研究表明[3]，补体系统的激活是类风湿性关节炎中慢性滑膜炎的发病因素之一。因此，抑制补体系统的过度激活可能是治疗类风湿性关节炎的重要机制之一。
三色片为复旦大学附属中山医院的院内制剂，由雷公藤、黄芪和丹参三味药材按1∶1∶1的比例配伍组成，在临床上用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病。我院临床医生在长期的医疗实践中总结出来的经验方，效果显著[4]。组方中雷公藤，性味辛寒，有大毒，归肝、肾经，具有清热解毒、活血化瘀、通络止痛、杀虫止痒等功效。现代研究表明，雷公藤内酯醇对大鼠脑皮质内注射β-淀粉酶后补体C1q和C3的表达有抑制作用，表明雷公藤对补体系统有抑制作用，目前临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和湿疹等结缔组织疾病[5]。组方中的黄芪用于脾肺气血或中气下陷之症、卫气虚所致表虚自汗、气虚血滞导致的肢体麻木、关节痹痛等症，可联合治疗类风湿性关节炎[6]。黄芪在治疗2型糖尿病大鼠的研究中发现其能降低补体C3的水平，表明其对补体系统具有一定的调节作用[7-8]。丹参是最常用的活血化瘀中药之一，具有祛瘀止痛，养血安神的功效，现代药理学研究表明其还具有保护肝脏的功能[9]，可拮抗雷公藤的肝毒性。本研究通过经典途径抗补体活性测定方法筛选出三色片醇提物的乙酸乙酯部位抗补体活性最佳，并采用UPLC-Q-TOF-MS法对该部位的化学成分进行结构表征，为三色片抗补体活性药效物质基础及治疗补体过度激活相关疾病提供科学依据。
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Tripie TOF5600+型四级杆-飞行时间串联质谱仪，配备电喷雾电离源和CDS自动校正系统（美国Applied Biosystems公司）；Peak view2.2和Master view1.1数据处理系统（美国Applied Biosystems公司）；LC-30A超高效液相色谱仪，包括高压输液泵，自动进样器，柱温箱和在线脱气机（日本岛津公司）；KQ5200E型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）; 蒸馏水（娃哈哈集团）；三色片提取物由作者自制，现样品存放于复旦大学附属中山医院药剂科（SSP2018）；补体、溶血素（自制）；毛蕊异黄酮（批号：ST088101），雷公藤甲素（批号：ST020501），雷公藤内酯酮（批号：ST049901），丹参酮II A（ST014601）、黄芪甲苷（ST001601）（纯度≥ 98%，均购自上海斯丹德生物技术有限公司）。
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雷公藤、黄芪和丹参三味药材按1∶1∶1配伍，其中，黄芪和丹参加6倍量的水浸泡2 h后，煎煮2次，第一次1.5 h，第二次加水4倍量煎煮1 h，煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度为1.10～1.20（70 ℃），加入2倍量的乙醇，静置沉淀24 h，取上清液备用。雷公藤分别加4倍量的乙醇加热回流2次，每次1.5 h，合并提取液，滤过，加入上述备用药液，混匀，回收乙醇至无醇味，浓缩后即得三色片醇提物，经现有的质量标准检验为制备三色片制剂合格的提取物。精密称取三色片醇提物2.0 g，置于100 ml萃取瓶中，加25 ml蒸馏水溶解后，用等量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，浓缩干燥后，放冷至室温，得到三色片醇提物的石油醚部位0.36 g，乙酸乙酯部位0.42 g，正丁醇部位0.56 g和水溶性部位。
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取各极性部位样品2 mg溶于DMSO，采用BBS缓冲液稀释成不同浓度的样品，并加入临界浓度的补体（1∶80稀释的豚鼠血清），溶血素和2%绵羊红细胞（SRBC）。37 ℃水浴30 min，离心后取上清液在405 nm波长下测定吸光度（A）值。同时设置中药对照组（将等量的中药提取物加入BBS缓冲液中，用于测定中药本底A值）、补体组（取临界浓度的补体直接加入适量的BBS缓冲液、溶血素和2%SRBC，用于测定临界浓度补体所造成红细胞溶血的A值）和全溶血组（将2%SRBC加入水中使之全溶血，用于观察补体组是否达到或接近全溶血水平），并以肝素作为阳性对照组，计算溶血抑制率。以供试品浓度为横坐标（X），溶血抑制率为纵坐标（Y），计算CH50（经典途径50%抑制溶血所需供试品浓度）。溶血抑制率=1−（A中药−A中药对照）/A全溶血。
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色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸和水溶液（A）−乙腈（B）；梯度洗脱：0～9 min，10%～23% B；9～13 min，23% B；13～28 min，23%～40% B；28～32 min，40%～50% B；32～37 min，50%～100% B；37～42 min，100% B；42～42.1 min，10%B；42.1～50 min，10% B；流速为0.25 ml/min，柱温为35 ℃；进样量为2 μl。
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在正/负离子模式，离子源选择电喷雾离子化源（ESI）；使用m/z 50~1250扫描范围；碰撞能量35 eV，碰撞能量叠加（35±15）eV；喷雾电压5 500 V；雾化气温度550 ℃；去簇电压100 V；雾化气和辅助气均为50 psi；气帘气25 psi；数据采集时间50 min；采用母离子触发的子离子（TOF-MS-IDA-MS/MS）扫描方式；多重质量亏损和动态背景扣除为触发二级的条件，满足该条件进行二级扫描。
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精密称取毛蕊异黄酮、雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、丹参酮Ⅱ A和黄芪甲苷对照品1.0 mg，加甲醇2 ml，溶解，摇匀，即得各对照品溶液。
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取三色片醇提物的乙酸乙酯部位样品0.2 g，置于10 ml量瓶中，加入70%甲醇5 ml，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，70%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
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根据三色片中各药材化学成分研究文献，收集3种药材所含化合物成分的基本信息，包括化合物名称、分子式、精确分子量、准分子离子峰和碎片离子峰。通过精确分子量匹配，对照品的保留时间，二级谱所得到的离子碎片与文献报道进行比对，最终确定化合物的结构。
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分别对三色片醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行经典途径的抗补体活性测定，以肝素为对照品，结果发现乙酸乙酯部位的抗补体活性最好，其抗补体活性略低于肝素钠，其次是正丁醇部位，结果见表1。
表 1 三色片提取物不同部位抗补体活性测定
编号 研究对象 抗补体活性（CH50，μg/ml） 1 肝素 14.4±1.2 2 三色片-石油醚部位 − 3 三色片-乙酸乙酯部位 233.9±10.1 4 三色片-正丁醇部位 344.0±14.5 注：“—”表示该部位无抗补体活性。 -
精密吸取对照品溶液和供试品溶液2 μl，采用“2.1”项下的色谱与质谱条件对样品进行分析，通过正、负离子全扫描，获得正、负离子模式下的总离子流图，见图1。
图 1 三色片提取物UPLC-Q-TOF-MS正和负离子模式下的总离子流图
通过与对照品比对，分子离子峰质谱数据解析，与参考文献比对，共鉴定出三色片醇提物乙酸乙酯部位42个化合物，结果见表2。
表 2 三色片提取物中各成分主要碎片离子及谱峰归属
化合物
编号tR/min 分子式 理论值(m/z) 模式 实测值(m/z) 误差(×10−6) 碎片离子（m/z） 化合物名称 参考文献 1 3.54 C7H6O3 139.039 0 [M+H]+ 139.039 4 3.0 121.028 7 原儿茶醛 [10] 2 4.76 C21H27N3O3 370.212 5 [M+H]+ 370.214 3 4.8 249.124 6,160.112 6,95.013 3,166.086 6,100.076 2,91.054 8 南蛇藤糠酰胺碱 [11] 3 6.63 C22H22O10 447.128 6 [M+H]+ 447.130 4 4.2 285.077 5,270.053 5,253.050 8,225.055 6,137.023 5 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 [12] 4 7.04 C23H29N3O2 380.233 3 [M+H]+ 380.235 1 4.8 176.106 9,160.112 6,105.033 8,100.076 5 苯代南蛇碱 [11] 5 9.41 C9H10O5 197.045 6 [M-H]− 197.044 7 −4.2 179.038 3,135.044 3 丹参素 [10] 6 9.42 C9H8O4 179.035 0 [M-H]− 179.034 2 4.7 135.044 8 咖啡酸 [13] 7 11.16 C16H12O4 431.133 7 [M+H]+ 431.136 3 6.1 269.082 6,253.050 3,225.055 5,213.091 7,197.060 2,136.014 6,118.041 7 芒柄花苷 [12] 8 12.71 C16H12O5 285.075 8 [M+H]+ 285.077 4 5.7 270.053 4,253.050 3,225.055 3,137.023 5 毛蕊异黄酮* [12] 9 12.76 C17H16O5 301.107 1 [M+H]+ 301.109 0 6.4 167.070 8,152.047 3,147.043 2,105.034 0,123.043 3 astrapterocarpan [12] 10 13.06 C20H24O6 361.164 6 [M+H]+ 361.166 5 5.5 269.154 3,227.108 3,185.096 9,157.101 7,129.070 3,91.054 9 雷公藤甲素* [14-15] 11 13.92 C17H14O6 315.086 3 [M+H]+ 315.088 1 5.6 300.064 7,243.065 5,167.034 2 熊竹素 [16] 12 18.21 C18H12O7 341.065 6 [M+H]+ 341.066 9 3.9 295.060 7,277.050 9,249.056 0 丹酚酸G [17] 13 19.76 C26H20O10 491.098 4 [M-H]− 491.097 0 −2.9 311.054 9,293.044 6,267.064 6,135.044 7 丹酚酸C [18] 14 21.46 C16H12O4 269.080 8 [M+H]+ 269.082 7 4.1 253.015 3,237.052 6,225.055 5,213.092 3,136.015 9,118.041 7,197.060 2 芒柄花素 [12] 15 22.57 C36H45NO17 764.276 0 [M+H]+ 764.278 3 2.9 746.276 1,686.246 3,644.235 1,206.081 7,188.070 9,178.086 5 aquifoliunine E-Ⅲ [14] 16 23.45 C20H22O6 359.148 9 [M+H]+ 359.150 7 4.9 267.138 0，225.019 5，183.079 9,128.061 8,91.054 3 雷公藤内酯酮* [19] 17 24.01 C38H47NO19 822.281 5 [M+H]+ 822.284 1 3.2 804.275 8,204.066 2,176.071 4 alatusinnine [20] 18 25.01 C39H45NO19 832.265 9 [M+H]+ 832.269 0 3.8 804.273 3,194.081 9,176.071 2 hypoglaunine E [11] 19 26.14 C41H68O14 829.458 0 [M+COOH]− 829.460 7 3.3 783.457 9,621.404 3,489.357 2 黄芪甲苷* [14] 20 28.19 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.290 3 3.8 788.279 5,686.247 0,206.082 1, 178.086 5 雷公藤定宁 E [20] 21 28.65 C39H45NO18 816.271 0 [M+H]+ 816.273 9 3.6 798.261 9,756.250 9,206.081 3,178.086 1,160.075 2 1-去乙酰基雷公藤吉碱 [11] 22 28.70 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 2,489.356 8 黄芪皂苷Ⅱ [13] 23 29.09 C41H47NO20 874.276 4 [M+H]+ 874.278 5 2.3 856.269 2,846.282 9,828.272 3,674.245 1,204.065 6,176.070 7 雷公藤春碱 [11] 24 29.72 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.291 2 3.8 788.280 4,686.247 4,206.082 4 peritassine A [20] 25 30.24 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 3 2.5 825.464 1,765.440 5 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体1）[16] 26 30.89 C19H16O4 309.112 1 [M+H]+ 309.114 2 6.7 281.667 0,263.106 0,235.076 7 丹参醛 [21] 27 31.58 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 0 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体2）[13] 28 32.12 C21H20O4 337.143 4 [M+H]+ 337.142 5 −2.7 309.686 6 丹参新醌丁 [10] 29 32.16 C43H49NO19 884.297 2 [M+H]+ 884.299 7 2.8 856.304 5,674.246 0,204.663 0,176.071 2 雷公藤定碱 [14] 30 32.96 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.482 4 3.5 867.481 7,825.469 8,807.464 3,765.450 6 黄芪皂苷Ⅰ [16] 31 32.99 C41H47NO19 858.281 5 [M+H]+ 858.285 4 4.6 840.275 7,798.263 8,746.269 1,738.243 5,686.248 0,206.082 5,178.087 1 雷公藤晋碱 [20] 32 33.04 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.289 7 3.8 788.278 3,686.244 4,206.082 1,728.257 0 卫矛碱 [20] 33 33.70 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.484 7 3.8 867.478 5,825.283 5,807.458 4,765.432 6 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体1）[16] 34 34.60 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.483 3 3.8 867.477 8,825.282 1,807.456 4,765.443 2 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体2）[16] 35 34.92 C46H49NO22 968.281 9 [M+H]+ 968.286 3 4.5 856.677 0,838.257 4,684.228 8,204.065 6,178.070 8 雷公藤素B [20] 36 35.01 C43H49NO18 868.302 2 [M+H]+ 868.304 6 2.7 868.364 0,850.295 8,746.268 9,686.247 6,206.082 4,178.087 1 雷公藤次碱 [20] 37 35.02 C41H47NO17 826.291 7 [M+H]+ 826.295 1 4.2 808.285 3,748.264 0,206.082 2,178.086 8 tripterygiumine Ⅰ [20] 38 35.49 C19H20O3 297.148 5 [M+H]+ 297.145 0 4.8 251.144 0,279.139 3,254.054 9,268.110 5,282.126 3 隐丹参酮 [10,17] 39 35.70 C20H28O2 299.201 7 [M-H]− 299.199 6 −6.7 283.168 2,213.090 8,201.916 0, 雷酚萜 [22] 40 35.86 C48H51NO18 930.317 9 [M+H]+ 930.321 3 3.7 912.308 7,310.111 0,206.081 8,188.071 2,178.086 5,105.033 6 ebenifoline E-Ⅱ [20] 41 36.81 C19H18O3 295.132 9 [M+H]+ 295.134 9 4.0 277.124 3,249.127 5,266.095 3,262.097 7,280.109 9 丹参酮Ⅱ A* [10,18,23] 42 37.49 C19H22O2 283.169 3 [M+H]+ 283.169 3 0 265.098 1,240.032 2,223.106 7,195.095 8,181.101 1 丹参新酮 [17,21,24] 注：*表示与对照品鉴定的化合物。 -
在乙酸乙酯部位中共鉴定出6个黄酮类化合物，其中4个黄酮苷元和2个黄酮苷，苷元为黄酮、异黄酮和紫檀烷，该类化合物在正离子模式下具有较好的响应。二级质谱中黄酮苷元易发生中性丢失，形成[M+H-H2O]+、[M+H-CO]+、[M+H-CH3]+等碎片离子，如在化合物8的二级质谱中可见m/z 270.053 4和m/z 253.050 3，则为m/z 285.077 4分别脱去-CH3和CH3OH形成的[M+H-CH3]+和[M+H-CH3OH]+碎片离子峰，m/z 225.055 3是m/z 253.050 3脱去1分子的CO形成的碎片离子峰，通过对照品的保留时间和参考文献[12]质谱数据比对确定化合物8为毛蕊异黄酮，m/z 137.023 5的碎片离子峰为异黄酮母核C环发生RDA裂解所产生。黄酮苷类易脱去糖基形成较强的分子离子峰，如化合物3（m/z 447.130 4）的二级质谱脱去糖基形成m/z 285.077 5的分子离子峰，并与化合物8（m/z 285.077 4）的二级质谱图非常相似，说明化合物3和化合物8在结构上是相似的，但化合物3的分子量多了162（C6H10O5），通过数据库比对和参考文献[12]推测化合物3则为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。化合物9（m/z 301.109 0）通过数据库比对发现两种候选化合物分别为astrapterocarpan和astraisoflavan，二级质谱中主要碎片离子峰为C环裂解产生的含A环和B环片段的碎片离子，其中，m/z 167.070 8为含B环的碎片离子峰且为基峰，进一步脱甲基形成m/z 152.047 3，m/z 123.043 3为含A环的碎片离子峰，进一步脱水形成m/z 105.034 0，m/z 147.043 2为母离子m/z 301.109 0脱去B环形成的碎片离子峰，根据m/z 167.070 8的碎片离子峰为基峰和含有m/z 147.043 2的碎片离子峰这两个特征，结合参考文献[12]的质谱数据，推测该化合物为astrapterocarpan，其相关裂解途径见图2。
图 2 化合物astrapterocarpan的质谱裂解规律
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在乙酸乙酯部位中鉴定出7个三萜皂苷类化合物，在负离子模式下均具有较好的响应，一级质谱中产生[M+COOH]−的准分子离子峰，二级质谱中产生较强的[M-H]-碎片离子峰和脱去糖基的较弱的分子离子峰。化合物19在负离子模式下产生的准分子离子峰为[M+COOH]−（m/z 829.458 0），二级质谱中产生m/z 783.457 9[M-H]−峰，脱去1分子六碳糖（C6H10O6）形成m/z 621.404 3的碎片离子峰，m/z 489.357 2则为m/z 621.404 3进一步脱去1分子五碳糖（C5H6O5）后形成的苷元碎片离子峰，推测其苷元为9,19-环阿尔廷烷，通过对照品的保留时间，参考文献[13]的离子碎片比对确定该化合物为黄芪甲苷。
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三色片提取物中共鉴定出16个生物碱类化合物，均来自雷公藤药材，在正离子模式下具有较好的响应，一级质谱中产生[M+H]+的准分子离子峰，二级质谱发现该类型的化合物容易脱去H2O、CO和CH3COOH等中性小分子而产生碎片离子峰，多数生物碱含有吡啶二羧酸部位的碎片离子峰。如化合物23在正离子模式下产生m/z 874.278 5的准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子CO的m/z 846.282 9的基峰，脱去1分子H2O的m/z 856.2692的碎片离子峰和脱去1分子HCOOH的m/z 828.272 3的碎片离子峰，m/z 674.245 1峰为m/z 846.2829脱去C5H4O3侧链和CH3COOH形成的碎片离子峰，m/z 204.065 6峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子，该离子进一步脱羧形成m/z 176.070 7的碎片离子，通过数据库和参考文献[11]质谱数据的比对，推测化合物23为雷公藤春碱。化合物31在正离子模式下产生m/z 858.285 4的准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子H2O的m/z 840.275 7的碎片离子峰，准分子离子峰脱去1分子CH3COOH形成较强的m/z 798.263 8峰，在进一步脱去1分子CH3COOH形成738.243 5峰，准分子离子峰m/z 858.285 4脱去FuOH（C5H4O3）侧链形成的m/z 746.269 1的碎片离子峰，再进一步脱去1分子CH3COOH，形成m/z 686.248 0的碎片离子，m/z 206.082 5峰为大环开裂产生的吡啶二羧酸部分脱水产生的碎片离子，该离子进一步脱羧形成m/z 178.087 1的碎片离子，通过数据库和参考文献[20]质谱数据的比对，推测化合物31为雷公藤晋碱。雷公藤晋碱中吡啶二羧酸部分较雷公藤春碱中少一个羟基，故其易产生m/z 206.0825的碎片离子峰，并通过脱羧产生m/z 178.087 1峰。两种化合物的质谱图见图3。以雷公藤晋碱为例，解析此类化合物的裂解规律，见图4。因此得出吡啶二羧酸部分含有羟基的生物碱会产生m/z 204系列的特征碎片离子峰，不含羟基的生物碱则产生m/z 206系列的特征碎片离子峰。
图 3 雷公藤春碱和雷公藤晋碱质谱图
图 4 化合物雷公藤晋碱的质谱裂解规律
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本研究共鉴定出8种萜类化合物，其中源于丹参药材中的5种萜类成分，丹参中的萜类化合物因其结构中主要含有羟基，羰基等取代基，所以质谱碰撞中主要丢失H2O，CO和-CH3等中性分子，产生一系列的碎片离子峰。化合物41在正离子模式下产生m/z 295.134 9的[M+H]+准分子离子峰，二级质谱中产生脱去1分子甲基形成的m/z 280.1099的碎片离子峰，在此基础上有丢失1分子水形成m/z 262.097 7峰，准分子离子峰脱去1分子H2O或脱去1个-CHO形成m/z 277.124 3峰或m/z 266.095 3峰，m/z 249.127 5峰是m/z 277.124 3脱去1分子H2O形成的碎片峰，通过对照品的保留时间和参考文献[10,18,23]数据比对，鉴定该化合物为丹参酮Ⅱ A，其质谱裂解规律见图5。
图 5 化合物丹参酮II A的质谱裂解规律
来源于雷公藤药材中的3种二萜类成分，该类化合物的二级质谱中出现一系列的脱水、脱CO和异丙基等碎片离子峰。化合物11在正离子模式下产生m/z 361.166 5的准分子离子峰，脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 269.154 3的碎片离子峰，m/z 227.108 3为m/z 269.154 3脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子，其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 185.096 9的碎片离子，通过对照品比对和参考文献[14-15]的质谱数据，确定化合物10为雷公藤甲素。化合物18在正离子模式下产生m/z 359.148 9的准分子离子峰，脱去2分子H2O和2分子CO形成m/z 267.138 0的碎片离子峰，m/z 225.019 5为m/z 267.138 0脱去1分子CH2CHCH3形成的碎片离子，其进一步脱1分子H2O和HCHO形成m/z 183.0799的碎片离子，通过对照品比对和参考文献[19]的质谱数据，确定化合物16为雷公藤内酯酮。化合物39在负离子模式下产生m/z 299.199 6 的准分子离子峰，二级质谱中产生m/z 283.168 2的碎片离子, 提示为丢失1个-CH3后形成双键产生的碎片离子峰，A环发生RDA裂解产生m/z 213.090 8的碎片离子峰，通过数据库比对和参考文献[22]的质谱数据，推测化合物39为雷酚萜。
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在正负离子模式下共鉴定出乙酸乙酯部位中5种酚酸类成分，均来自于丹参药材，参考文献[18]报道的丹参中酚酸类成分的裂解规律发现，酚酸类化合物主要含有羰基、羧基和羟基，所以在质谱碰撞中易丢失CO、H2O和CO2的中性碎片；丹参素和咖啡酸作为基本母核而其他的水溶性酚酸类化合物大多数为这两者的聚合或缩合产物，主要为缩酚酸类的成分，在质谱碰撞中易丢失[M-H-180]−和[M-H-198]−中性碎片；含有羧基的单体化合物在负离子模式下会产生135[C8H7O2]−和179[C9H7O4]−的特征性碎片。化合物5中，在负离子模式下产生m/z 197.044 7的[M-H]−准分子离子峰，二级质谱进一步产生丢失1分子H2O和1分子CO2，形成的m/z 179.038 3和m/z 135.044 3的碎片离子峰，推测出结构中含有羧基，结合其精确分子量和参考文献[10]质谱数据，推测该化合物为丹参素。化合物12中，负离子模式下产生m/z 491.097 0的[M-H]−准分子离子峰，二级质谱中产生m/z 311.054 9和m/z 293.044 6的碎片离子峰，分别为[M-H-180]−和[M-H-198]−, m/z 267.064 6峰为m/z 311.054 9脱去1分子CO2所产生，根据m/z 135.044 7峰推测结构中含有羧基，结合其精确分子量和参考文献[18]质谱数据的比较，推测该化合物为丹酚酸C。化合物1中，正离子模式下给出m/z 139.039 4的[M+H]+准分子离子峰，脱去1分子H2O形成m/z 121.028 7的碎片离子峰，通过数据库比对和参考文献[10]，推测该化合物1为原儿茶醛。化合物13中，在正离子模式下产生m/z 341.066 9的[M+H]+准分子离子峰，脱去1分子CO2形成m/z 295.060 7的碎片离子峰，m/z 277.050 9和m/z 249.056 0的碎片离子峰是m/z 295.060 7峰分别脱去1分子H2O和1分子CO2形成的，通过数据库比对和参考文献[17]质谱数据，推测该化合物为丹酚酸G。
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本实验流动相考察了乙腈-水系统和甲醇-水系统，结果乙腈-水系统中化合物的分离度较好，加入甲酸可以改善峰形，有助于化合物的离子化，提高质谱的响应，最终选择乙腈-0.1%甲酸水系统作为本次研究的流动相。
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据以往文献中三色片各化学成分的研究报道，收集各药材的主要化学成分的精确分子量，碎片离子峰等信息，建立相应的化学成分数据库。通过数据库比对，对照品保留时间及参考文献中质谱数据鉴定三色片醇提物乙酸乙酯部位的化学成分。本研究共鉴定出42个化合物，其中5个是通过对照品鉴定得出，对无对照品的化合物，通过质谱的裂解特征及参考文献进行结构表征，对同分异构体应结合其在液相色谱中化合物的保留时间及质谱行为，综合对其定性鉴别。
三色片醇提物的乙酸乙酯部位具有较强的抗补体活性，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法对其中的化学成分进行结构表征，结果发现该部位主要含有生物碱类，萜类，黄酮和酚酸类等化学成分。其中以来源于雷公藤药材中极性中等的生物碱类成分含量较多，这与三色片提取物的制备工艺有关，三色片中雷公藤药材采用乙醇加热回流提取的方式，而黄芪和丹参药材采用水提取醇沉淀的方式。此外，先前的研究发现广藿香中的黄酮和萜类化合物对旁路途径的补体激活具有明显的抑制作用，紫花地丁中的生物碱类成分对旁路途径也有抑制作用（AP50=0.22~0.50 g/L）, 牡丹皮和毛七公的抗补体活性成分研究中发现酚羟基决定抗补体活性的存在与否，没食子酰基可改善抗补体活性，甲基则对抗补体活性不利[25-27]。通过本次研究对三色片醇提物的乙酸乙酯部位的化学成分进行了初步表征，为阐明三色片的药效物质基础提供参考依据。研究的不足之处在于，仍有部分化学成分尚未定性鉴定，含量较高的单体成分未进行体外抗补体活性的测定，未来将通过中药化学的方法获得含量较高的单体成分，并进行结构鉴定和抗补体活性测定。
Study on components with anti-complement activity from ethanol extract of Sanse tablets by UPLC-Q-TOF-MS/MS
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摘要:
目的 分析三色片醇提物抗补体活性部分的化学成分，为阐明其药效物质基础提供参考依据。 方法 通过经典抗补体途径对不同极性部位的三色片醇提物进行活性测定，确定其具有抗补体活性的部位，采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS)法对活性部位进行成分分析。通过与对照品的保留时间，精确分子量和参考文献中质谱裂解碎片比对，对其中的化学成分进行鉴定。 结果 三色片醇提物的乙酸乙酯部位具有较强的抗补体活性，应用质谱分析，鉴定出42个化合物，化合物的类型包括：生物碱类16个，萜类15个，黄酮6个和酚酸类5个。 结论 通过对三色片中抗补体活性部位化学成分特征的分析，为阐明其药效物质基础提供一定的科学依据，有助于院内中药复方制剂的二次开发。 -
关键词:
- 三色片 /
- 抗补体活性 /
- UPLC-Q-TOF-MS/MS /
- 化学成分
Abstract:Objective To analyze the chemical components in the ethanol extract of Sanse tablets with anti-complement activity, and to provide scientific basis for its therapeutic effects. Methods The classical anti-complement pathway was used to compare the activity of different portions of Sanse tablet alcohol extract, and to identify the fraction with anti-complement activity. The chemical composition in active fraction was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS. The chemical components were identified by comparing the retention time, exact molecular weight and mass spectrum information with the standard chemicals. Results The ethyl acetate fraction of the Sanse tablet ethanol extract had the best anti-complement activity. 42 chemicals were identified, including 16 alkaloids, 15 terpenoids, 6 flavonoids and 5 phenolic acids. Conclusion The characterization of the chemical components in the anti-complement active fraction of Sanse tablets provides a scientific basis for the therapeutic effects of Sanse tablets, which will help the future development of the compound preparations of Chinese medicine in our hospital. -
Key words:
- Sanse tablets /
- anti-complement activity /
- UPLC-Q-TOF-MS/MS /
- chemical components
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 三色片提取物不同部位抗补体活性测定
编号 研究对象 抗补体活性（CH50，μg/ml） 1 肝素 14.4±1.2 2 三色片-石油醚部位 − 3 三色片-乙酸乙酯部位 233.9±10.1 4 三色片-正丁醇部位 344.0±14.5 注：“—”表示该部位无抗补体活性。 
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表 2 三色片提取物中各成分主要碎片离子及谱峰归属
化合物
编号tR/min 分子式 理论值(m/z) 模式 实测值(m/z) 误差(×10−6) 碎片离子（m/z） 化合物名称 参考文献 1 3.54 C7H6O3 139.039 0 [M+H]+ 139.039 4 3.0 121.028 7 原儿茶醛 [10] 2 4.76 C21H27N3O3 370.212 5 [M+H]+ 370.214 3 4.8 249.124 6,160.112 6,95.013 3,166.086 6,100.076 2,91.054 8 南蛇藤糠酰胺碱 [11] 3 6.63 C22H22O10 447.128 6 [M+H]+ 447.130 4 4.2 285.077 5,270.053 5,253.050 8,225.055 6,137.023 5 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 [12] 4 7.04 C23H29N3O2 380.233 3 [M+H]+ 380.235 1 4.8 176.106 9,160.112 6,105.033 8,100.076 5 苯代南蛇碱 [11] 5 9.41 C9H10O5 197.045 6 [M-H]− 197.044 7 −4.2 179.038 3,135.044 3 丹参素 [10] 6 9.42 C9H8O4 179.035 0 [M-H]− 179.034 2 4.7 135.044 8 咖啡酸 [13] 7 11.16 C16H12O4 431.133 7 [M+H]+ 431.136 3 6.1 269.082 6,253.050 3,225.055 5,213.091 7,197.060 2,136.014 6,118.041 7 芒柄花苷 [12] 8 12.71 C16H12O5 285.075 8 [M+H]+ 285.077 4 5.7 270.053 4,253.050 3,225.055 3,137.023 5 毛蕊异黄酮* [12] 9 12.76 C17H16O5 301.107 1 [M+H]+ 301.109 0 6.4 167.070 8,152.047 3,147.043 2,105.034 0,123.043 3 astrapterocarpan [12] 10 13.06 C20H24O6 361.164 6 [M+H]+ 361.166 5 5.5 269.154 3,227.108 3,185.096 9,157.101 7,129.070 3,91.054 9 雷公藤甲素* [14-15] 11 13.92 C17H14O6 315.086 3 [M+H]+ 315.088 1 5.6 300.064 7,243.065 5,167.034 2 熊竹素 [16] 12 18.21 C18H12O7 341.065 6 [M+H]+ 341.066 9 3.9 295.060 7,277.050 9,249.056 0 丹酚酸G [17] 13 19.76 C26H20O10 491.098 4 [M-H]− 491.097 0 −2.9 311.054 9,293.044 6,267.064 6,135.044 7 丹酚酸C [18] 14 21.46 C16H12O4 269.080 8 [M+H]+ 269.082 7 4.1 253.015 3,237.052 6,225.055 5,213.092 3,136.015 9,118.041 7,197.060 2 芒柄花素 [12] 15 22.57 C36H45NO17 764.276 0 [M+H]+ 764.278 3 2.9 746.276 1,686.246 3,644.235 1,206.081 7,188.070 9,178.086 5 aquifoliunine E-Ⅲ [14] 16 23.45 C20H22O6 359.148 9 [M+H]+ 359.150 7 4.9 267.138 0，225.019 5，183.079 9,128.061 8,91.054 3 雷公藤内酯酮* [19] 17 24.01 C38H47NO19 822.281 5 [M+H]+ 822.284 1 3.2 804.275 8,204.066 2,176.071 4 alatusinnine [20] 18 25.01 C39H45NO19 832.265 9 [M+H]+ 832.269 0 3.8 804.273 3,194.081 9,176.071 2 hypoglaunine E [11] 19 26.14 C41H68O14 829.458 0 [M+COOH]− 829.460 7 3.3 783.457 9,621.404 3,489.357 2 黄芪甲苷* [14] 20 28.19 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.290 3 3.8 788.279 5,686.247 0,206.082 1, 178.086 5 雷公藤定宁 E [20] 21 28.65 C39H45NO18 816.271 0 [M+H]+ 816.273 9 3.6 798.261 9,756.250 9,206.081 3,178.086 1,160.075 2 1-去乙酰基雷公藤吉碱 [11] 22 28.70 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 2,489.356 8 黄芪皂苷Ⅱ [13] 23 29.09 C41H47NO20 874.276 4 [M+H]+ 874.278 5 2.3 856.269 2,846.282 9,828.272 3,674.245 1,204.065 6,176.070 7 雷公藤春碱 [11] 24 29.72 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.291 2 3.8 788.280 4,686.247 4,206.082 4 peritassine A [20] 25 30.24 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 3 2.5 825.464 1,765.440 5 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体1）[16] 26 30.89 C19H16O4 309.112 1 [M+H]+ 309.114 2 6.7 281.667 0,263.106 0,235.076 7 丹参醛 [21] 27 31.58 C43H70O15 871.468 6 [M+COOH]− 871.470 8 2.5 825.470 2,765.448 0 异黄芪皂苷Ⅱ
（异构体2）[13] 28 32.12 C21H20O4 337.143 4 [M+H]+ 337.142 5 −2.7 309.686 6 丹参新醌丁 [10] 29 32.16 C43H49NO19 884.297 2 [M+H]+ 884.299 7 2.8 856.304 5,674.246 0,204.663 0,176.071 2 雷公藤定碱 [14] 30 32.96 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.482 4 3.5 867.481 7,825.469 8,807.464 3,765.450 6 黄芪皂苷Ⅰ [16] 31 32.99 C41H47NO19 858.281 5 [M+H]+ 858.285 4 4.6 840.275 7,798.263 8,746.269 1,738.243 5,686.248 0,206.082 5,178.087 1 雷公藤晋碱 [20] 32 33.04 C38H47NO18 806.286 6 [M+H]+ 806.289 7 3.8 788.278 3,686.244 4,206.082 1,728.257 0 卫矛碱 [20] 33 33.70 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.484 7 3.8 867.478 5,825.283 5,807.458 4,765.432 6 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体1）[16] 34 34.60 C45H72O16 913.479 1 [M+COOH]− 913.483 3 3.8 867.477 8,825.282 1,807.456 4,765.443 2 异黄芪皂苷Ⅰ
（异构体2）[16] 35 34.92 C46H49NO22 968.281 9 [M+H]+ 968.286 3 4.5 856.677 0,838.257 4,684.228 8,204.065 6,178.070 8 雷公藤素B [20] 36 35.01 C43H49NO18 868.302 2 [M+H]+ 868.304 6 2.7 868.364 0,850.295 8,746.268 9,686.247 6,206.082 4,178.087 1 雷公藤次碱 [20] 37 35.02 C41H47NO17 826.291 7 [M+H]+ 826.295 1 4.2 808.285 3,748.264 0,206.082 2,178.086 8 tripterygiumine Ⅰ [20] 38 35.49 C19H20O3 297.148 5 [M+H]+ 297.145 0 4.8 251.144 0,279.139 3,254.054 9,268.110 5,282.126 3 隐丹参酮 [10,17] 39 35.70 C20H28O2 299.201 7 [M-H]− 299.199 6 −6.7 283.168 2,213.090 8,201.916 0, 雷酚萜 [22] 40 35.86 C48H51NO18 930.317 9 [M+H]+ 930.321 3 3.7 912.308 7,310.111 0,206.081 8,188.071 2,178.086 5,105.033 6 ebenifoline E-Ⅱ [20] 41 36.81 C19H18O3 295.132 9 [M+H]+ 295.134 9 4.0 277.124 3,249.127 5,266.095 3,262.097 7,280.109 9 丹参酮Ⅱ A* [10,18,23] 42 37.49 C19H22O2 283.169 3 [M+H]+ 283.169 3 0 265.098 1,240.032 2,223.106 7,195.095 8,181.101 1 丹参新酮 [17,21,24] 注：*表示与对照品鉴定的化合物。
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