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鼻渊净胶囊为纯中药内服制剂[批准文号：总制字（2016）F405004]，由苍耳子、辛夷、连翘、白芷、羌活、野菊花等六味中药组成，具有散风消炎、宣通鼻窍、稀化鼻窦与气管粘稠分泌物的功效，主要用于鼻渊的治疗。由于该制剂原有质量标准制定年代久远，质量控制仅有白芷一味药材的薄层鉴别，主要药味均无含量测定项，不能较好地反映制剂质量，本课题组前期对其原有的工艺参数进行了优选[1]，并进行了质量标准研究。新的质量标准增加了辛夷、连翘、羌活、野菊花四味药的薄层定性鉴别，并建立了辛夷中木兰脂素、连翘中连翘苷、白芷和羌活中欧前胡素、野菊花中蒙花苷等主要成分的HPLC含量测定[2]，本研究在此基础上，建立了鼻渊净胶囊的HPLC指纹图谱，拟从多成分角度对其质量进行全面控制，进一步保证制剂的质量均一和临床用药安全。
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Agilent 1260高效液相色谱仪，含G1329A自动进样器、G4212B DAD检测器（美国，Agilent公司）；JM-B2102型电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；FA1605型电子天平（上海横平仪表厂）；KH-100B型超声波清洗器（昆山和创超声仪器有限公司)。
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10个批次(标记为S1～S10)的鼻渊净胶囊样品（批号：150901、150902、150904、150905、150910、150913、150916、150920、150921、150923，本院制剂室自制）；连翘苷（批号：110753-201314）、蒙花苷（批号：110805-200508）、木兰脂素（批号：110780-201007）、欧前胡素（批号：111730-201307）、异欧前胡素（批号：111640-201005）等对照品，购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为自制纯水；其他试剂均为国产分析纯。
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取鼻渊净胶囊内容物适量，研碎，精密称取粉末约1 g置于具塞锥形瓶中，加入甲醇20 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，加甲醇补足损失重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
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分别取紫花前胡苷、连翘苷、蒙花苷、木兰脂素、欧前胡素和异欧前胡素对照品各10 mg，精密称定，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。分别精密量取1 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
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分别取野菊花、连翘、苍耳子、辛夷、羌活、白芷单味药材适量，按照鼻渊净胶囊的制备方法及供试品溶液的制备方法，制备各单味药的样品溶液。
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色谱柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱：0～5 min，20% A；5～15 min，20%～30% A；15～35 min，30%～40% A；35～50 min，40%～50% A；50～70 min，50%～55% A；70～80 min，55% A；流速：1.0 ml/min；检测波长210 nm；进样量10 μl。
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精密度试验：取鼻渊净胶囊S1号样品（批号：150901）胶囊内容物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，用“2.2.1”项下的色谱条件测定，连续进样6次，记录指纹图谱，以峰9为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。
重复性试验：取鼻渊净胶囊S1号样品（批号：150901）胶囊内容物，共6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，用“2.2.1”项下色谱条件测定，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以峰9为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。
稳定性试验：取同一S1号样品（批号：150901）的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h依法进样测定，以峰9为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。
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取鼻渊净胶囊S1～S10号共10批样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，用“2.2.1”项下色谱条件测定，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”进行分析。
根据10批供试品溶液的色谱峰生成参照图谱，选择参照图谱中峰面积大于500且分离度较好的峰为共有指纹峰，分析确定鼻渊净胶囊的共有指纹峰。
釆用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》评价10批鼻渊净胶囊的图谱的相似性，并进行综合评价。
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精密度试验结果显示各共有峰平均相对保留时间的RSD为0.62%，平均相对峰面积的RSD为1.17%，在该方法下的精密度良好；重复性试验结果显示各共有峰平均相对保留时间的RSD为0.29%，平均相对峰面积的RSD为1.15%，在该方法下重复性良好；稳定性试验结果显示各共有峰平均相对保留时间的RSD为0.90%、平均相对峰面积的RSD为1.10%，样品在12 h内稳定。
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以批号150901（S1）的指纹图谱作为参照谱，多点校正，采用中位数法生成对照指纹图谱，结果见图1。
图 1 10批样品的HPLC特征图谱叠加图
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分析结果确定鼻渊净胶囊有20个共有指纹峰，其中峰9为鼻渊净胶囊的指标成分木兰脂素，该峰吸收信号最强、保留时间适中，峰形较好且稳定，故将其作为参照峰。鼻渊净胶囊指纹图谱见图2。
图 2 鼻渊净胶囊HPLC指纹图谱
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比较10批鼻渊净胶囊的色谱图，以木兰脂素峰（峰9）的保留时间和色谱峰面积为1，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1和表2。
表 1 10批次鼻渊净胶囊指纹图谱共有峰的相对保留时间
峰号 批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.135 0.145 0.140 0.138 0.138 0.138 0.139 0.138 0.145 0.146 2 0.238 0.238 0.239 0.237 0.239 0.239 0.240 0.238 0.238 0.238 3 0.371 0.370 0.371 0.376 0.371 0.371 0.372 0.371 0.371 0.371 4 0.409 0.408 0.409 0.409 0.409 0.409 0.411 0.409 0.410 0.409 5 0.430 0.430 0.431 0.430 0.431 0.430 0.432 0.430 0.431 0.431 6 0.520 0.520 0.521 0.520 0.521 0.520 0.522 0.520 0.521 0.521 7 0.801 0.801 0.802 0.801 0.801 0.801 0.800 0.801 0.800 0.801 8 0.953 0.953 0.953 0.953 0.953 0.953 0.952 0.953 0.952 0.953 9 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 10 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 11 1.094 1.093 1.094 1.107 1.093 1.094 1.095 1.094 1.094 1.094 12 1.158 1.157 1.157 1.157 1.157 1.157 1.159 1.158 1.158 1.158 13 1.200 1.200 1.200 1.199 1.199 1.199 1.201 1.199 1.201 1.200 14 1.238 1.237 1.237 1.238 1.237 1.237 1.237 1.237 1.239 1.238 15 1.345 1.344 1.344 1.345 1.341 1.344 1.346 1.344 1.347 1.345 16 1.510 1.509 1.509 1.509 1.509 1.509 − − 1.512 1.509 17 1.596 1.595 1.596 1.583 1.595 1.596 1.585 1.581 1.599 1.595 18 1.625 1.625 1.626 1.619 1.626 1.627 − − 1.628 1.624 19 1.684 1.683 1.684 1.684 1.683 1.684 − − 1.687 1.683 20 1.748 − 1.749 1.748 1.748 1.748 1.751 1.746 1.752 1.749 表 2 10批次鼻渊净胶囊指纹图谱共有峰的相对峰面积
峰号 批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.053 0.043 0.267 0.293 0.113 0.173 0.117 0.183 0.070 0.075 2 0.046 0.022 0.146 0.163 0.025 0.124 0.082 0.076 0.044 0.046 3 0.022 0.019 0.018 0.044 0.061 0.029 0.027 0.031 0.022 0.022 4 0.077 0.040 0.122 0.189 0.054 0.111 0.094 0.107 0.072 0.074 5 0.122 0.015 0.032 0.039 0.156 0.223 0.190 0.114 0.113 0.120 6 0.066 0.089 0.038 0.073 0.156 0.198 0.102 0.127 0.063 0.063 7 0.068 0.100 0.032 0.071 0.115 0.130 0.087 0.118 0.068 0.069 8 0.308 0.420 0.392 0.319 0.347 0.370 0.359 0.327 0.296 0.308 9 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 10 0.341 0.227 0.203 1.426 0.452 0.248 0.252 0.293 0.338 0.334 11 0.163 0.274 0.230 0.095 0.095 0.209 0.235 0.178 0.170 0.162 12 0.168 0.202 0.125 0.075 0.099 0.116 0.046 0.057 0.160 0.164 13 0.031 0.016 0.026 0.045 0.037 0.025 0.028 0.029 0.033 0.033 14 0.092 0.122 0.066 0.038 0.066 0.099 0.010 0.015 0.091 0.093 15 0.024 0.027 0.028 0.023 0.046 0.039 0.029 0.069 0.020 0.019 16 0.046 0.037 0.029 0.007 0.032 0.037 − − 0.046 0.046 17 0.224 0.290 0.203 0.333 0.150 0.201 0.074 0.120 0.220 0.220 18 0.046 0.053 0.033 0.018 0.019 0.036 − − 0.049 0.048 19 0.031 0.031 0.021 0.012 0.009 0.021 − − 0.033 0.031 20 0.183 − 0.083 0.232 0.040 0.117 0.235 0.337 0.174 0.1867 -
指纹相似度在0.9～1.0之间，各批次之间的相似性较强，说明鼻渊净胶囊的制备工艺及样品分析方法稳定可行，相似度结果见表3。
表 3 10批次鼻渊净胶囊HPLC指纹图谱相似度
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照图谱 相似度 0.979 0.952 0.966 0.951 0.932 0.959 0.936 0.920 0.949 0.948 1.000 -
采用对照品对照法对共有峰进行确认，取“2.1”项下配制的各对照品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进行检测，在对照品溶液保留时间处，供试品溶液的色谱峰与对照品色谱峰的在线UV图一致，由此来判断共有峰化学成分的归属。通过此方法，判断4号峰为连翘苷，5号峰为蒙花苷，9号峰为木兰脂素，15号峰为欧前胡素，17号峰为异欧前胡素（见图3）。
图 3 鼻渊净胶囊与蒙花苷HPLC叠加图及蒙花苷的UV光谱图
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采用各单味药阳性对照试验，取“2.1”项下各单味药材溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件进行测定。通过比较各色谱峰的保留时间和UV光谱图，对鼻渊净胶囊样品中共有峰的来源进行追溯。结果表明，峰1、2、4、6、7来自连翘，峰5来自野菊花，峰8～13来自辛夷，峰15、17、20来自白芷，其中峰17、20为羌活和白芷的共有峰。
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在预实验中，曾尝试多种不同的溶剂系统作为流动相，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸，发现选用甲醇-水时，基线总是漂移；选用乙腈-水时，乙腈比甲醇的洗脱效果更明显，且加入酸溶液并不能改善峰型、基线平稳，各峰的峰型和分离度均良好，故选择乙腈-水作为流动相。经过对供试品采用DAD检测器进行全波长扫描发现，在210 nm波长下供试品溶液图谱的信息量较多、各吸收峰强度较大，故最终选择210 nm作为鼻渊净胶囊HPLC指纹图谱的检测波长。
对中成药的评价需要全面方能准确反映制剂质量。本研究采用HPLC法，建立了以木兰脂素为参照物的鼻渊净胶囊的指纹图谱，标定了21个共有指纹峰，指认了5个成分，10批次样品指纹图谱整体的相似性结果在0.9以上。在此次建立的鼻渊净胶囊HPLC-UV指纹图谱中，苍耳子药材的特征性成分表达很少，可能是因为其特征性成分在该波长下紫外吸收较少，或者是受其他成分的影响未能表达，此不足考虑在以后的研究中运用液质联用技术对其成分进行分析与检测来弥补[21-22]，从而为鼻渊净胶囊的质量评价提供更全面可靠的依据。
Study on HPLC fingerprints of Biyuanjing capsules
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摘要:
目的 建立鼻渊净胶囊的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。 方法 采用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱，乙腈-水为流动相、以1.0 ml/min流速行梯度洗脱，检测波长210 nm，柱温30 ℃，洗脱时间为80 min。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）对检测出色谱进行指纹图谱相似度评价。 结果 建立了鼻渊净胶囊的HPLC指纹图谱，确定了20个共有峰，15个峰归属到各药材，其中5个峰确认了化学成分；10批样品的指纹图谱的整体相似度与对照图谱比较，均在90%以上。 结论 所建立的鼻渊净胶囊指纹图谱有助于从整体上控制该制剂的质量。 Abstract:Objective To establish a HPLC fingerprints of Biyuanjing capsules. Methods The column was Agilent SB-C18(4.6mm×250 mm, 5 µm). The mobile phase was acetonitrile-water with gradient elution at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 210 nm. The detection time was 80 min. Results The HPLC fingerprints of Biyuanjing capsules were established. Twenty common peaks were confirmed, of which, 15 peaks were belonging to each crude drug and 5 peaks were identified as chemical components. The overall similarity of the fingerprints of 10 batches of samples was above 90% comparing with the control. Conclusion This method can be used for the quality control of Biyuanjing capsules. -
Key words:
- Biyuanjing capsules /
- fingerprints /
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phillyr /in - linarin /
- magnolin /
- imperatorin /
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isoimperatorin
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 3 鼻渊净胶囊与蒙花苷HPLC叠加图及蒙花苷的UV光谱图
A. 鼻渊净胶囊与蒙花苷HPLC叠加图（a.鼻渊净胶囊；b.蒙花苷对照品；）B. 蒙花苷对照品的UV图；C. 5号峰在鼻渊净胶囊中的UV图
表 1 10批次鼻渊净胶囊指纹图谱共有峰的相对保留时间
峰号 批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.135 0.145 0.140 0.138 0.138 0.138 0.139 0.138 0.145 0.146 2 0.238 0.238 0.239 0.237 0.239 0.239 0.240 0.238 0.238 0.238 3 0.371 0.370 0.371 0.376 0.371 0.371 0.372 0.371 0.371 0.371 4 0.409 0.408 0.409 0.409 0.409 0.409 0.411 0.409 0.410 0.409 5 0.430 0.430 0.431 0.430 0.431 0.430 0.432 0.430 0.431 0.431 6 0.520 0.520 0.521 0.520 0.521 0.520 0.522 0.520 0.521 0.521 7 0.801 0.801 0.802 0.801 0.801 0.801 0.800 0.801 0.800 0.801 8 0.953 0.953 0.953 0.953 0.953 0.953 0.952 0.953 0.952 0.953 9 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 10 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 11 1.094 1.093 1.094 1.107 1.093 1.094 1.095 1.094 1.094 1.094 12 1.158 1.157 1.157 1.157 1.157 1.157 1.159 1.158 1.158 1.158 13 1.200 1.200 1.200 1.199 1.199 1.199 1.201 1.199 1.201 1.200 14 1.238 1.237 1.237 1.238 1.237 1.237 1.237 1.237 1.239 1.238 15 1.345 1.344 1.344 1.345 1.341 1.344 1.346 1.344 1.347 1.345 16 1.510 1.509 1.509 1.509 1.509 1.509 − − 1.512 1.509 17 1.596 1.595 1.596 1.583 1.595 1.596 1.585 1.581 1.599 1.595 18 1.625 1.625 1.626 1.619 1.626 1.627 − − 1.628 1.624 19 1.684 1.683 1.684 1.684 1.683 1.684 − − 1.687 1.683 20 1.748 − 1.749 1.748 1.748 1.748 1.751 1.746 1.752 1.749 
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表 2 10批次鼻渊净胶囊指纹图谱共有峰的相对峰面积
峰号 批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 0.053 0.043 0.267 0.293 0.113 0.173 0.117 0.183 0.070 0.075 2 0.046 0.022 0.146 0.163 0.025 0.124 0.082 0.076 0.044 0.046 3 0.022 0.019 0.018 0.044 0.061 0.029 0.027 0.031 0.022 0.022 4 0.077 0.040 0.122 0.189 0.054 0.111 0.094 0.107 0.072 0.074 5 0.122 0.015 0.032 0.039 0.156 0.223 0.190 0.114 0.113 0.120 6 0.066 0.089 0.038 0.073 0.156 0.198 0.102 0.127 0.063 0.063 7 0.068 0.100 0.032 0.071 0.115 0.130 0.087 0.118 0.068 0.069 8 0.308 0.420 0.392 0.319 0.347 0.370 0.359 0.327 0.296 0.308 9 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 10 0.341 0.227 0.203 1.426 0.452 0.248 0.252 0.293 0.338 0.334 11 0.163 0.274 0.230 0.095 0.095 0.209 0.235 0.178 0.170 0.162 12 0.168 0.202 0.125 0.075 0.099 0.116 0.046 0.057 0.160 0.164 13 0.031 0.016 0.026 0.045 0.037 0.025 0.028 0.029 0.033 0.033 14 0.092 0.122 0.066 0.038 0.066 0.099 0.010 0.015 0.091 0.093 15 0.024 0.027 0.028 0.023 0.046 0.039 0.029 0.069 0.020 0.019 16 0.046 0.037 0.029 0.007 0.032 0.037 − − 0.046 0.046 17 0.224 0.290 0.203 0.333 0.150 0.201 0.074 0.120 0.220 0.220 18 0.046 0.053 0.033 0.018 0.019 0.036 − − 0.049 0.048 19 0.031 0.031 0.021 0.012 0.009 0.021 − − 0.033 0.031 20 0.183 − 0.083 0.232 0.040 0.117 0.235 0.337 0.174 0.1867
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表 3 10批次鼻渊净胶囊HPLC指纹图谱相似度
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 对照图谱 相似度 0.979 0.952 0.966 0.951 0.932 0.959 0.936 0.920 0.949 0.948 1.000
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