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萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠模型的药效作用及其对肾脏尿酸盐转运体表达的影响

王琼 周冰 杨全伟

杨贺英, 罗彩萍, 彭婷, 梁文仪, 沈颂章, 苏娟. 花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
引用本文: 王琼, 周冰, 杨全伟. 萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠模型的药效作用及其对肾脏尿酸盐转运体表达的影响[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 143-145. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101017
YANG Heying, LUO Caiping, PENG Ting, LIANG Wenyi, SHEN Songzhang, SU Juan. Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
Citation: WANG Qiong, ZHOU Bing, YANG Quanwei. Effect of Bixie deacidification fang on hyperuricemia mouse model and its effect on the expression of renal urate transporter[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(2): 143-145. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101017

萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠模型的药效作用及其对肾脏尿酸盐转运体表达的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101017
基金项目: 武汉市卫生健康委科研项目(WZ21A01、WZ18D12)
详细信息
    作者简介:

    王 琼,硕士研究生,医师,研究方向:中医内分泌学,Email:35293674@qq.com

    通讯作者: 杨全伟,主管药师,研究方向:中医药药效作用机理,Email:553657004@qq.com
  • 中图分类号: R285

Effect of Bixie deacidification fang on hyperuricemia mouse model and its effect on the expression of renal urate transporter

  • 摘要:   目的  研究萆薢降酸方提取物对高尿酸血症小鼠的抗高尿酸血症药效作用及其对肾脏蛋白的转运机制。  方法  采用氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠模型,观察萆薢降酸方提取物对高尿酸血症小鼠的影响。以220、440、880mg/kg的剂量,连续10 d,以别嘌醇(5mg/kg)为阳性对照。采用比色法测定血清、尿酸、肌酐水平。同时用Western blot法分析肾脏尿酸盐转运蛋白1(URAT1)和阴离子转运蛋白1(OAT1)的蛋白质水平。  结果  与模型组比较,高剂量萆薢降酸方可抑制血清中黄嘌呤氧化酶(XOD)活性(18.12±1.33u/L)和肝脏活性蛋白(70.15±5.20u/g)(P<0.05),降低血清尿酸(2.04±0.64mg/L)(P<0.05)和血清肌酐(0.35±0.18mol/L)尿素氮(8.83±0.71mmol/L)(P<0.05);升高尿酸(38.34±8.23mg/L)和尿肌酐(34.38±1.98mmol/L)水平,URAT1表达水平下调,OAT1表达水平上调(P<0.05)。  结论  萆薢降酸方可能通过上调OAT1蛋白表达促进尿酸排泄、下调URAT1蛋白表达抑制尿酸重吸收的双重调节功能来促进尿酸在肾脏中的排泄。
  • 花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮,味辛,性温,具有温中止痛、杀虫止痒的功效,主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分,组成丰富、结构多样,具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中,不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素(HAS)、羟基-β-山椒素(HBS)已经被证实能够调节脂质代谢,对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而,对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础,有利于花椒药用价值的深度开发,因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。

    大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段,具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点,在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此,本实验以HAS、HBS的得率为指标,筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型,采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件,建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MSE)技术鉴定成分,以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。

    花椒药材(批号:20220705-2,购于陕西省渭南韩城市),经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)的干燥果皮。

    1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱(美国沃特世科技有限公司);R-100型旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司);XS205DU电子分析天平(梅特勒托利多科技公司)。

    HAS对照品(纯度≥98%,批号:P2834270,源叶);HBS对照品(纯度≥98%,批号:P2832664,诗丹德);95%乙醇(分析纯,上海泰坦科技股份有限公司);甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技公司);APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);HPD-400型大孔吸附树脂(上海一飞生物科技有限公司);HP-20型大孔吸附树脂(日本三菱化学株式会社)。

    2.1.1   溶液的配制

    称取50 g花椒于圆底烧瓶中,加入500 ml的50%乙醇,95℃水浴加热,回流提取1 h,共提取3次。过滤后合并滤液,45℃减压浓缩至无醇味,过滤,加水分散至250 ml,即得上样液。

    取216 ml上样液,上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱,动态吸附30 min,静置1 h后,取216 ml 20%乙醇除杂24 min;540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得提取物粉末。

    对照品溶液:精密称定HAS、HBS对照品适量,加50%乙醇定容,分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。

    供试品溶液:精密称定适量提取物粉末,加50%乙醇定容后,0.45 μm微孔滤膜过滤,即为供试品溶液。

    2.1.2   色谱条件

    色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流速:0.3 ml/min;检测波长:270 nm;柱温:30℃;进样量:5 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%三乙胺(B);洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~30 min,35%→50%A;30~36 min,50%→90%A,36~39 min,90%A,39~40 min,90%→10%A。

    2.1.3   线性关系

    取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤,在“2.1.2”项下色谱条件下进样。

    2.1.4   精密度

    取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中,50%乙醇定容至刻度,混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤,连续进样6次。

    2.1.5   稳定性

    取“2.1.1”项下的供试品溶液,于0、1、2、4、8、24 h分别进样。

    2.1.6   重复性

    按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份,在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。

    2.1.7   加样回收率

    精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份,分别准确加入HAS、HBS对照品适量,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液,进样分析并计算加样回收率。

    2.2.1   树脂类型

    95%乙醇浸泡树脂24 h,充分溶胀后湿法装柱,95%乙醇淋至洗脱液澄清透明,水洗至洗脱液无醇味,备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂,按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样,计算HAS、HBS的总得率。

    2.2.2   上样量

    湿法装柱,取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml,以2 BV/h上样,流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样,以累计上样体积(V/ml)为横坐标(X),以HAS、HBS的总泄漏率(%)为纵坐标(Y),绘制泄漏曲线。

    2.2.3   单因素实验考察上样条件

    除变量外固定其他工艺条件(树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇,2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h)不变的情况下,分别考察上样液浓度(0.1、0.2、0.4 g生药/ml)、树脂柱径高比(1∶5、1∶7、1∶9)及吸附流速(1、2、4 BV/h)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。

    2.2.4   正交试验考察除杂、洗脱条件

    在单因素实验的基础上,采用L9(33)正交试验进一步分析除杂条件(除杂溶剂、体积、流速)、洗脱条件(洗脱溶剂、体积、流速)对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响(表1),总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。

    表  1  除杂、洗脱条件正交试验因素水平表
    条件 水平 因素
    A因素溶剂 B因素体积(BV) C因素流速(BV/h)
    除杂 1 蒸馏水 1 2
    2 10%乙醇 2 3
    3 20%乙醇 3 5
    洗脱 1 55%乙醇 3 2
    2 70%乙醇 5 3
    3 80%乙醇 8 5
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    2.3.1   样品制备

    精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg,50%甲醇定容至25 ml,0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

    2.3.2   色谱条件

    色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3柱(2.1×100 mm, 1.7 μm);检测波长:270 nm;流速:0.3 ml/min;柱温:30℃;进样量:3 μl。流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),洗脱梯度:0~18 min,10%→35%A;18~24 min,35%→46%A;24~30 min,46%→90%A;30~32 min,90%A;32~33 min,90%~10%A;33~36 min,10%A。

    2.3.3   质谱条件

    电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描。离子源温度120℃,雾化气流速为800 L/h,毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V,补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV,高能量扫描电压30~60 eV;喷雾器压力为6.5×105 Pa,气帘气体积流量为50 L/h,扫描范围m/z为50~1500。亮氨酸-脑啡肽(m/z∶ 554.261 5 [M-H])和(m/z∶ 556.277 1[M+H]+)作为外标进行质量实时校正,体积流量设为5 μl/min。

    MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。

    3.1.1   花椒生物碱的HPLC图

    供试品HPLC图如图1所示,该色谱条件下,HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于30000、峰形稳定、无干扰,能够满足样品分析检测要求。

    图  1  供试品溶液的HPLC图
    1.羟基-α-山椒素;2.羟基-β-山椒素
    3.1.2   线性关系考察结果

    以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得到HAS的回归方程Y=3312.7 X−8.887,r=0.999;HBS的回归方程Y=33030 X+12.061,r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

    3.1.3   精密度实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%,仪器精密度良好,符合定量测定要求。

    3.1.4   稳定性实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%,表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

    3.1.5   重复性实验结果

    HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%,表明方法重复性良好。

    3.1.6   加样回收率实验结果

    计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为(103.66±0.62)%、(100.22±3.10)%、(102.47±1.24)%;HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为(101.35±0.89)%、(98.58±2.48)%、(98.86±1.02)%。结果表明该测定方法准确性好,可用于样品中HAS、HBS的含量测定。

    3.2.1   树脂类型的确定

    使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时,HAS、HBS两成分的总含量(X)最高且结果稳定,结果见表2。因此,优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。

    表  2  不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响(n=3)
    树脂类型 HAS、HBS
    总浓度(mg/ml)
    HAS、HBS
    总含量(%)
    $ \bar{X} $±SD(%)
    APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17
    NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76
    宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09
    AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28
    HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98
    三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62
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    3.2.2   上样量的确定

    图2可知,当上样液体积为90 ml时,花椒生物碱开始少量泄漏;随着上样体积增加,流出液中生物碱浓度呈现上升趋势;当上样液为210 ml时,累计泄漏率为9.61%,接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml,即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。

    图  2  三菱HP-20型大孔树脂动态吸附泄漏曲线
    3.2.3   上样条件的确定

    图3可知,当上样液浓度为0.2 g生药/ml时,HAS和HBS的得率最高;随着浓度升高,杂质增多,与生物碱竞争吸附活性位点,得率下降;此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时,HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱,动态吸附流速为4 BV/h。

    图  3  不同上样条件对HAS、HBS总得率的影响
    A.上样液浓度;B树脂柱径高比;C吸附流速*P<0.05,**P<0.01,与白色组比较。
    3.2.4   除杂、洗脱条件的确定

    表3所示,以HAS、HBS总得率为指标时,影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂(A)>除杂流速(C)>除杂体积(B)。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV,结果差异并不明显,为节约溶剂、提高效率,优选2 BV为除杂体积。

    表  3  除杂条件L9(33)正交设计及结果
    编号 因素 总得率(%)
    除杂溶剂(A) 除杂体积(B) 除杂流速(C)
    1 1 1 1 7.87
    2 1 2 2 9.09
    3 1 3 3 9.31
    4 2 1 2 10.33
    5 2 2 3 10.42
    6 2 3 1 10.67
    7 3 1 3 11.82
    8 3 2 1 10.73
    9 3 3 2 11.66
    k1 8.75 10.06 9.71
    k2 10.44 10.07 10.34
    k3 11.37 10.48 10.52
    R 2.62 0.64 0.81
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    表4可知,洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂(A)>洗脱流速(C)>洗脱体积(B);最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇,洗脱体积为5 BV,洗脱流速5 BV/h。

    表  4  洗脱条件L9(33)正交设计及结果
    编号 因素 总得率
    (%)
    洗脱溶剂(A) 洗脱体积(B) 洗脱流速(C)
    1 1 1 1 2.55
    2 1 2 2 5.38
    3 1 3 3 7.15
    4 2 1 2 5.75
    5 2 2 3 8.11
    6 2 3 1 9.57
    7 3 1 3 9.20
    8 3 2 1 8.28
    9 3 3 2 6.36
    k1 5.03 5.83 6.80
    k2 7.81 7.26 5.83
    k3 7.95 7.69 8.15
    R 2.92 1.86 2.32
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    3.2.5   花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证

    实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10,溶剂为50%乙醇,95℃水浴加热,每次回流提取1 h,提取3次,过滤后合并滤液;45℃减压浓缩至无醇味,纱布过滤,加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液;按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml,上样于三菱HP-20型大孔树脂,树脂柱径高比1∶7,动态吸附流速4 BV/h,静置1 h后,2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂;80%乙醇洗脱,体积5 BV,流速5 BV/h。收集洗脱液,45℃减压浓缩并干燥,即得花椒生物碱提取物。

    表5可知,三次重复实验花椒生物碱得膏率相近,富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%,证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠,重复性高。此外,经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%,与富集纯化前相比,花椒生物碱的含量得到明显升高。

    表  5  最佳工艺验证结果
    编号 得膏率
    (%)
    富集前
    总含量(%)
    富集后
    总含量(%)
    富集后
    总含量RSD(%)
    1 6.88 0.82 5.73 0.87
    2 6.91 0.81 5.72 0.87
    3 6.95 0.82 5.64 0.87
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    通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献,收集花椒的化学成分信息,包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等,建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。

    图4可知,在正离子模式下,生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收,并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析,共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物,包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等(见表6)。

    图  4  正离子模式下花椒生物碱BPI图
    表  6  正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果
    峰号 保留时
    间(t/min)
    化合物 分子式 离子模式 理论值
    m/z
    实测值
    m/z
    误差
    (ppm)
    碎片离子
    m/z
    参考
    文献
    1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17]
    2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18]
    4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19]
    5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19]
    6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20]
    7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18]
    9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18]
    10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21]
    11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22]
    12* 22.701 羟基-α
    山椒素
    C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23]
    13* 23.113 羟基-β
    山椒素
    C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23]
    14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24]
    15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22]
    16 26.379 羟基-γ
    异山椒素
    C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22]
    17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15]
    18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15]
    19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23]
    20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25]
    *:为与对照品比对的化合物。
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    实验前期,考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法,经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时,耗时长、水溶性杂质较多,而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应,破坏分子结构,综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。

    HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱,具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性,受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱,显著提高HAS、HBS含量,为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分,但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中,8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离,后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。

    本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺,利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定,使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效,可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据,对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。

  • 图  1  小鼠肾脏组织中OAT1和URAT1蛋白的表达结果

    表  1  萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影响(n=10)

    组别剂量(mg/kg)血清UA(mg/L)尿液UA(mg/L)血清Cr(µmol/L)尿液Cr(mmol/L)血清BUN (mmol/L)
    阴性组1.42±0.1835.25±5.730.29±0.1141.56±3.427.58±0.85
    模型组6.13±0.76*12.68±4.79*0.95±0.38*17.33±4.68*16.43±1.13*
    阳性组 51.85±0.3719.26±5.280.34±0.2224.26±3.329.37±1.14
    低剂量组2203.73±1.1#19.79±6.21#0.56±0.21#18.13±2.7913.38±0.68#
    中剂量组4402.85±0.91#28.65±7.55#0.45±0.21#26.72±3.02#11.37±0.74#
    高剂量组8802.04±0.64#38.34±8.23#0.35±0.18#34.38±1.98#8.83±0.71#
    注:*P < 0.05,与阴性组比较;#P< 0.05,与模型组比较
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    表  2  萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠血清和肝脏中XOD活性的影响(n=10)

    组别剂量 (mg/kg)血清XOD
    (u/L)
    肝脏XOD
    (u/g prot)
    阴性组16.27±1.1565.34±3.68
    模型组26.58±1.4684.53±4.56
    阳性组 518.43±1.2437.38±4.59
    低剂量组22023.83±1.3679.63±5.27
    中剂量组44022.65±1.4276.14±5.34
    高剂量组88018.12±1.33*70.15±5.20*
    注:*P<0.05,与模型组比较
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-03
  • 修回日期:  2022-03-03
  • 网络出版日期:  2022-03-29
  • 刊出日期:  2022-03-25

萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠模型的药效作用及其对肾脏尿酸盐转运体表达的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101017
    基金项目:  武汉市卫生健康委科研项目(WZ21A01、WZ18D12)
    作者简介:

    王 琼,硕士研究生,医师,研究方向:中医内分泌学,Email:35293674@qq.com

    通讯作者: 杨全伟,主管药师,研究方向:中医药药效作用机理,Email:553657004@qq.com
  • 中图分类号: R285

摘要:   目的  研究萆薢降酸方提取物对高尿酸血症小鼠的抗高尿酸血症药效作用及其对肾脏蛋白的转运机制。  方法  采用氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠模型,观察萆薢降酸方提取物对高尿酸血症小鼠的影响。以220、440、880mg/kg的剂量,连续10 d,以别嘌醇(5mg/kg)为阳性对照。采用比色法测定血清、尿酸、肌酐水平。同时用Western blot法分析肾脏尿酸盐转运蛋白1(URAT1)和阴离子转运蛋白1(OAT1)的蛋白质水平。  结果  与模型组比较,高剂量萆薢降酸方可抑制血清中黄嘌呤氧化酶(XOD)活性(18.12±1.33u/L)和肝脏活性蛋白(70.15±5.20u/g)(P<0.05),降低血清尿酸(2.04±0.64mg/L)(P<0.05)和血清肌酐(0.35±0.18mol/L)尿素氮(8.83±0.71mmol/L)(P<0.05);升高尿酸(38.34±8.23mg/L)和尿肌酐(34.38±1.98mmol/L)水平,URAT1表达水平下调,OAT1表达水平上调(P<0.05)。  结论  萆薢降酸方可能通过上调OAT1蛋白表达促进尿酸排泄、下调URAT1蛋白表达抑制尿酸重吸收的双重调节功能来促进尿酸在肾脏中的排泄。

English Abstract

杨贺英, 罗彩萍, 彭婷, 梁文仪, 沈颂章, 苏娟. 花椒生物碱富集纯化工艺优化及其成分分析[J]. 药学实践与服务, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
引用本文: 王琼, 周冰, 杨全伟. 萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠模型的药效作用及其对肾脏尿酸盐转运体表达的影响[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(2): 143-145. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202101017
YANG Heying, LUO Caiping, PENG Ting, LIANG Wenyi, SHEN Songzhang, SU Juan. Optimization of purification process and component analysis of alkaloids from Zanthoxylum bungeanum Maxim[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2025, 43(2): 75-81. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404066
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  • 高尿酸血症是一种威胁人类健康的常见代谢性疾病。血液中尿酸水平偏高,会导致关节及肾脏沉积尿酸盐晶体,是痛风性关节炎、急性尿酸肾病、心血管及肾脏疾病,特别是高血压的重要危险因子[1]。虽然抗高尿酸血症药物在治疗高尿酸血症和痛风方面已有进展,但作为常用的黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制剂,别嘌醇可致严重的过敏(如轻度出疹)和粒细胞缺乏症,并会损害嘧啶代谢,从而加剧肾脏毒性。目前,中医药在抗高尿酸疾病中,有很好的临床疗效,受到研究者的青睐[2]

    萆薢降酸方是我院使用多年的协定处方,临床效果良好,深受患者认可,其治疗高尿酸血症、痛风和刺激性关节炎的疗效而被广泛应用。由萆薢、土茯苓、金钱草、泽泻、苍术等五味中药组成,具有利湿健脾,泄浊除痹的功效,临床上用于“腰痛” “石淋” “痹证”等病证,能消除代谢紊乱所致尿酸产生过多或排泄减少。方中萆薢具有利湿去浊、祛风除痹的功效,为“君药”;土茯苓具有清热解毒、健脾祛湿的功效,金钱草具有利湿退黄、利尿通淋、解毒消肿的功效,辅助“君药”排除尿酸,为“臣药”;泽泻具有利水渗湿、泄热、化浊降脂的功效,苍术具有燥湿健脾、祛风散寒的功效,辅佐“君臣”利湿去浊。

    萆薢降酸方在降尿酸过程中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨萆薢降酸方对实验性高尿酸血症小鼠血氧活性和尿酸排泄的影响。

    • 实验用雄性ICR健康小鼠,体重约18~22 g,购自武汉大学动物实验中心,由武汉大学动物护理及使用委员会批准(编号:20121012)。

    • 尿酸(UA,美国Sigma公司);肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)测定试剂盒(美国BioAssay Systems);黄嘌呤氧化酶(XOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);RNA提取试剂盒(成都福际生物);逆转录试剂盒(日本Takara);Mill-iQ型纯水系统(美国Millipore);3K30高速低温离心机(德国Sigma);InfiniteM200型酶标仪(瑞士TECAN);7500型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)

    • 萆薢、土茯苓、金钱草、泽泻、苍术(均购自安徽亳州中药材有限公司);别嘌醇片(江苏方强制药厂,国药准字H20033683);氧嗪酸钾(美国Sigma-aldrich,规格:25g/瓶)。

    • 将ICR小鼠随机分为6组,每组10只。①阴性对照组:给予正常饲料喂养;②模型组:给予氧嗪酸钾(250 mg/kg,溶于5%CMC-Na溶液);③阳性对照组:给予氧嗪酸钾(同模型组)+别嘌醇(5 mg/kg);④高剂量组:给予氧嗪酸钾(同模型组)+药物(880 mg/kg);⑤中剂量组:给予氧嗪酸钾(同模型组)+药物(440 mg/kg);⑥低剂量组:给予氧嗪酸钾(同模型组)+药物(220mg/kg)。除阴性对照组外,其余各组按上述剂量灌胃给药,灌胃体积0.5ml/100g,每天1次,连续10 d。

    • 经过连续10 d给药后,眼眶取血(取血前12 h禁食禁水),以3500r/min转速,离心20 min,分离血清;代谢笼收集24 h尿液,记录尿液体积,采用市售试剂盒以比色法测定血清及尿液中的黄嘌呤氧化酶(XOD)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)水平。

    • 将肾组织匀浆,使用样品缓冲液裂解细胞,离心后收集上清液。样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到硝化纤维素膜上。使用尿酸转运蛋白1(URAT1)、有机阴离子转运蛋白1(OAT1)抗体孵育后,使用增强型化学发光检测试剂盒检测。使用Lab works 软件(GelPro 4.0)对条带光密度进行量化。

      应用SPSS 16.0统计软件包对所有数据进行统计分析,计量资料以($\bar x $±s)表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,以 P<0. 05为差异有统计学意义。

    • 表1所示,模型组大鼠经灌胃氧嗪酸钾后,UA水平明显高于阴性组(P<0.05),表明高尿酸血症大鼠模型造模成功。连续给药治疗10 d后,与模型组比较,萆薢降酸方高、中、低剂量组血清尿酸水平显著降低(P<0.05)。虽然萆薢降酸方药物组小鼠血清尿酸水平均高于阳性组小鼠,但其尿酸排泄量呈剂量依赖性增加;与模型组比较,血清肌酐和尿素氮水平均有明显的降低(P<0.05),萆薢降酸方药物组对血清肌酐水平的改善作用约为模型组的2~3倍。如表2所示,与模型组比较,高剂量组萆薢降酸方对高尿酸血症模型小鼠中血清和肝脏氧化酶活性也有显著影响(P< 0.05)。

      表 1  萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影响(n=10)

      组别剂量(mg/kg)血清UA(mg/L)尿液UA(mg/L)血清Cr(µmol/L)尿液Cr(mmol/L)血清BUN (mmol/L)
      阴性组1.42±0.1835.25±5.730.29±0.1141.56±3.427.58±0.85
      模型组6.13±0.76*12.68±4.79*0.95±0.38*17.33±4.68*16.43±1.13*
      阳性组 51.85±0.3719.26±5.280.34±0.2224.26±3.329.37±1.14
      低剂量组2203.73±1.1#19.79±6.21#0.56±0.21#18.13±2.7913.38±0.68#
      中剂量组4402.85±0.91#28.65±7.55#0.45±0.21#26.72±3.02#11.37±0.74#
      高剂量组8802.04±0.64#38.34±8.23#0.35±0.18#34.38±1.98#8.83±0.71#
      注:*P < 0.05,与阴性组比较;#P< 0.05,与模型组比较

      表 2  萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠血清和肝脏中XOD活性的影响(n=10)

      组别剂量 (mg/kg)血清XOD
      (u/L)
      肝脏XOD
      (u/g prot)
      阴性组16.27±1.1565.34±3.68
      模型组26.58±1.4684.53±4.56
      阳性组 518.43±1.2437.38±4.59
      低剂量组22023.83±1.3679.63±5.27
      中剂量组44022.65±1.4276.14±5.34
      高剂量组88018.12±1.33*70.15±5.20*
      注:*P<0.05,与模型组比较
    • 萆薢降酸方剂量依赖性地降低了URAT1的表达,增加了OAT1的表达。与模型组相比,萆薢降酸方组小鼠URAT1蛋白表达显著降低,而OAT1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图1

      图  1  小鼠肾脏组织中OAT1和URAT1蛋白的表达结果

    • 高尿酸血症是临床上痛风和慢性肾炎的主要危险因素。近年来,降低血清尿酸的治疗药物因其不良反应而受到限制。一些研究表明,中药可以下调高尿酸血症小鼠的肝氧化,并促进肾尿酸排泄[3]。为了扭转高尿酸血症早期复杂的病理状态,采用萆薢降酸方促进肾尿酸排泄。与模型组比较,不同剂量组血清尿酸水平显著降低,尿液尿酸水平显著升高(P<0.05)。高剂量萆薢降酸方对高尿酸血症患者血清和肝脏氧化酶活性也有显著影响(P<0.05)。越来越多的临床报道表明,高尿酸血症不仅与痛风有关,还与慢性肾炎和肾功能不全有关[4]。尿素氮和血肌酐水平是肾功能的有用指标,肾脏损害伴随着尿素氮和血肌酐的增加,表明尿素和肾功能下降[5]。与模型组相比,不同剂量的萆薢降酸方能显著抑制BUN和血清Cr水平(P<0.05),相反,萆薢降酸方诱导的尿液Cr水平是模型组的3倍左右。尿酸排泄是萆薢降酸方的主要调节因子,URAT1和OAT1在尿酸处理中起着重要作用[6]。URAT1是尿酸盐重吸收的重要因素,调解尿酸的一个药物靶点。OAT1介导主动摄取有机阴离子,并通过ATP动力转运器和双向交换器控制尿液的最终排出[7]。为了探讨萆薢降酸方增加尿酸清除率的作用机制,本文研究了萆薢降酸方对尿酸(URAT1)和氧化物(OAT1)活性的影响。萆薢降酸方对高尿酸血症小鼠肾组织中URAT1蛋白表达有剂量依赖性的抑制作用,并增强 OAT1蛋白的表达(P<0.05)。这些结果与萆薢降酸方促进尿酸排泄的作用是一致的,也提示萆薢降酸方抑制了由尿酸和OAT1信号转导靶点介导的尿酸的积累和尿量的减少。

参考文献 (7)

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