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络塞维（rosavin）是从中国药用植物红景天的根和茎中提取的独特化学成分[1]，主要用于抗疲劳、抗缺氧、缓解压力、降血糖、提高工作能力效率和治疗神经系统的功能性疾病[2-3]。传统的络塞维获取方法主要是从红景天植物中分离提纯得到，但由于络塞维在红景天中的含量极低，且分离难度大，由于原材料的差异，含量也各有不同。鉴于天然络塞维的获取难度极大，而且价格昂贵，因此，开发一种廉价、简单、高收率的络塞维合成方法具有重大意义。本实验以廉价的葡萄糖、阿拉伯吡喃糖、肉桂醇为起始原料，经合成络思为其中一个中间体[4]，然后，对络思葡萄糖6位羟基以叔丁基二苯基硅基进行高选择性保护，再乙酰化保护2,3,4位羟基，选择性脱去6位叔丁基二苯基硅基作为糖基化受体，三氟甲磺酸三甲基硅酯为糖苷化催化剂，1-O-三氯亚胺酯三乙酰阿拉伯糖为供体，实现了络塞维的全合成，合成路线如图1所示。
图 1 络塞维的全合成
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β-D-五乙酰葡萄糖、四乙酰阿拉伯糖、肉桂醇、三氟甲磺酸三甲基硅脂、水合肼、甲醇钠等试剂均为分析纯，购买于上海阿达玛斯试剂有限公司。旋转蒸发仪、磁力搅拌器（德国艾卡仪器设备有限公司）；低温冷阱（上海豫康科技有限公司）；天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；AC-P600型核磁共振仪（Bruker-Spectrospin）；LC/MSD-iQ型质谱仪（安捷伦）。
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将β-D-五乙酰葡萄糖780 g（2 mol）加入到800 ml的二甲基甲酰胺（DMF）中，加入乙酸133 g（2.2 mol），冷却至0 ℃，滴加水合肼110 g（2.2 mol），滴加完毕后，升至室温反应，用薄层色谱法（TLC）检测反应进行程度，反应完毕后，加入1 mol/L盐酸300 ml淬灭反应，乙酸乙酯（EA）萃取，饱和碳酸钠洗涤，干燥后蒸干，得无色油状物，快速硅胶柱层析得化合物（1）640 g，收率92%。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.28 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 5.47~5.33(m, 1H), 5.24 (t, J = 3.3 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.73 (dd, J = 10.3、3.4 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 2H), 4.04 (dd, J = 15.5, 8.5 Hz, 1H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 1.98 (s, 3H)。13C -NMR (151 MHz, DMSO-d6, δ) 170.54, 170.17, 170.09 ~ 170.00 (4 C), 169.78, 89.50, 71.29, 69.85, 68.98, 66.76, 62.61, 20.88. ESI-MS C14H20O10 Na [M+Na]+ m/z=371.0951。
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将四乙酰葡萄糖216 g（620 mmol）溶于350 ml无水二氯甲烷中，加入三氯乙腈160 g（1117 mmol），搅拌均匀，冷却至0 ℃，滴加1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, DBU）9.4 g（62 mmol），升至室温，反应3 h，TLC检测反应完毕，蒸干，石油醚：乙酸乙酯(2:1)快速硅胶柱层析，得无色油状化合物（2）265 g，收率87%。1H-NMR (CDCl3, δ): 6.60 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-1), 5.54 (1H, t, J = 9.3 Hz, H-4), 5.30~5.10 (2H, 宽峰, H-2, H-3), 4.30~4.00 (3H, m, H-5, H2-6), 2.14~ 1.95 (12H, COCH3)。13C-NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) 170.5, 169.8, 169.7, 169.6, 159.7, 90.5, 71.2 (2 C), 67.8, 68.8, 65.4, 62.0, 21.0, 20.7, 20.65, 20.6。ESI-MS C16H20Cl3NO10Na [M+Na]+ m/z=514.0065。
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将化合物（2）170 g（346 mmol）溶于1 L无水二氯甲烷中，加入肉桂醇70 g（520 mmol），搅拌下加入4 Å分子筛100 g，室温下搅拌30 min，然后冷却至0 ℃，滴加三氟甲磺酸三甲基硅8 g（34.6 mmol），室温搅拌反应过夜，TLC检测反应完毕后，过滤，滤液加饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干，快速硅胶柱层析得化合物(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(acetoxymethyl)-6-(cinna-myloxy) tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triyl triacetate（3）131 g (282 mmol)，收率82%，mp.81～83 ℃。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.47 ~ 7.43 (m, 2H), 7.36 (dd, J = 8.4、7.0 Hz, 2H), 7.29 ~ 7.26 (m, 1H), 6.60 (dd, J = 16.0、1.7 Hz, 1H), 6.43 ~ 6.23 (m, 1H), 5.31 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 4.98 ~ 4.89 (m, 2H), 4.84 (dd, J = 9.7、8.0 Hz, 1H), 4.40 (ddd, J = 13.3、5.5、1.6 Hz, 1H), 4.30 ~ 4.18 (m, 2H), 4.10 ~ 3.98 (m, 2H), 2.03 (d, J = 3.6 Hz, 6H), 2.00 (s, 3H), 1.95 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6, δ) 170.51, 170.01, 169.74, 169.53, 136.71, 132.28, 129.11 (2 C), 128.24, 126.84 (2 C), 125.89, 99.18, 72.59, 71.51, 71.08, 69.57, 68.72, 62.23, 20.94, 20.88, 20.83, 20.73。ESI-MS C23H32NO10 [M+NH4]+ m/z=482.2030。将化合物（3）131 g (282 mmol)溶于1 L无水甲醇中，加入甲醇钠5 g，回流1 h，TLC检测反应完毕后，加入醋酸淬灭，然后蒸干甲醇，二氯甲烷∶甲醇-6∶1硅胶柱层析纯化，得化合物（4）78.4 g，收率95.2%。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, δ) 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.23 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.35 (dt, J = 16.0, 5.7 Hz, 1H), 4.49 ~4.34 (m, 1H), 4.28 ~ 4.13 (m, 2H), 3.68 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.45 (dd, J = 11.7, 5.3 Hz, 1H), 3.17 ~ 2.93 (m, 4H)。13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 136.97, 131.70, 129.09 (2 C), 128.05, 126.82, 126.77 (2 C), 102.61, 77.39, 77.22, 73.98, 70.57, 69.00, 61.58。ESI-MS C16H21O8[M+COOH]- m/z=341.1253。
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将化合物（4）57 g（200 mmol）溶于吡啶中，冷却到0 ℃，然后分批加入叔丁基二苯基氯硅烷（TBDPSCl）52 g（200 mmol），加毕后升至室温，搅拌过夜，TLC检测，反应完毕，蒸干，硅胶柱层析得化合物（5）96.1 g，收率93.2%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.76 ~ 7.67 (m, 4H), 7.49 ~7.39 (m, 9H), 7.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.25 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.40 (dt, J = 16.0, 5.8 Hz, 1H), 4.53 ~ 4.41 (m, 1H), 4.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.26 (dd, J = 13.7, 5.8 Hz, 1H), 4.02 ~ 3.97 (m, 1H), 3.80 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 1H), 3.36 ~ 3.27 (m, 2H), 3.24 ~ 3.16 (m, 2H), 3.08 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 1.02 (s, 9H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6, δ) 136.88, 135.64 (2 C), 135.59 (2 C), 133.87, 133.76, 131.82, 130.21, 130.18, 129.09 (3 C), 128.23 (3 C), 128.08, 126.75 (3 C), 102.44, 77.22, 77.11, 73.93, 70.26, 68.75, 64.24, 27.06 (3 C), 19.40。ESI-MS C31H42NO6Si [M+NH4] +m/z=552.2781。
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将化合物（5）96.1 g（180 mmol）加入300 ml醋酐，3 g二甲基氨基吡啶(DMAP)，室温反应6~8 h。TLC检测反应完毕后，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯溶解，加入1 mol/L盐酸洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，然后氯化钠洗涤，快速硅胶柱层析，得化合物（6）105 g，收率89%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.70 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.51 ~ 7.40 (m, 9H), 7.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.26 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.35 (dt, J = 16.0、5.8 Hz, 1H), 5.30 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 5.16 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 4.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.88 ~ 4.79 (m, 1H), 4.44 (dd, J = 13.4、5.3 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 13.4, 6.2 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 12.5、2.8 Hz, 1H), 3.75 (s, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.96 (d, J = 1.7 Hz, 6H), 1.00 (s, 9H)。13C NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 170.09, 169.58, 169.44, 136.68, 135.69 (2 C), 135.59 (2 C), 133.32, 133.06, 132.15, 130.34, 129.09 (2 C), 128.31 (6 C), 126.83 (2 C), 125.97, 99.08, 73.58, 73.05, 71.61, 69.18, 68.41, 62.46, 26.92 (3 C), 20.95, 20.86 (2 C), 19.32。ESI-MS C37H48NO9Si [M+NH4] +m/z=678.3135。
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将化合物（6）66 g（100 mmol）溶于300 ml四氢呋喃中，搅拌溶解后，0 ℃下加入吡啶40 ml、48%氢氟酸（30 ml），然后室温搅拌，TLC跟踪监测，反应完毕后，加入1 L乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠洗涤，1 mol/L盐酸洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，得化合物（7）35.8 g，收率84%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.45 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.27 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.34 (dt, J = 16.0, 5.7 Hz, 1H), 5.42 ~ 5.14 (m, 1H), 4.94 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 4.88 ~ 4.80 (m, 2H), 4.45 (dd, J = 13.5, 4.9 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 9.7、5.2、2.1 Hz, 1H), 3.56 (dd, J = 12.0、1.9 Hz, 1H), 3.46 (dd, J = 12.1、5.3 Hz, 1H), 2.02 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.95 (s, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6, δ) 170.08, 169.70, 169.55, 136.74, 132.12, 129.10 (2 C), 128.20, 126.83 (2 C), 125.97, 99.22, 74.22, 73.13, 71.69, 69.39, 69.10, 60.52, 20.94 (2 C), 20.81。ESI-MS C21H30NO9 [M+NH4]+ m/z=440.1922。
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将1-羟基-2,3,4-三乙酰阿拉伯吡喃糖276 g（1000 mmol）溶于800 ml无水二氯甲烷中，加入三氯乙腈216 g（1500 mmol），搅拌均匀，冷却至0 ℃，滴加二氮杂二环（DBU）18 g（120 mmol），升至室温，反应3 h，TLC检测反应完毕，蒸干，石油醚：乙酸乙酯(2:1)快速硅胶柱层析，得无色油状物化合物（8）322 g，收率76%。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 9.88 (s, 1H), 6.45 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.42 ~ 5.38 (m, 1H), 5.30 (dd, J = 10.7、3.4 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 10.8、3.5 Hz, 1H), 4.10 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 13.4、2.0 Hz, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.99 (s, 3H). 13C NMR (151 MHz, DMSO, δ) 170.27, 170.24, 170.05, 158.69, 93.46 (2 C), 68.34, 67.26, 66.99, 63.06, 21.07, 20.89, 20.71。ESI-MS C13H20Cl3N2O8 [M+NH4]+ m/z=443.9826。
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将化合物（7）42 g（100 mmol）、化合物（8）63 g（150 mmol）溶于500 ml无水二氯甲烷中，加入4Å分子筛100 g，氮气保护，室温下搅拌30 min，然后冷却到0 ℃，滴加三甲基硅三氟甲磺酸酯（TMSOTf）2.2 g（10 mmol），然后升至室温反应，TLC跟踪监测。反应完毕后，加入少量三乙胺淬灭反应，1 mol/L盐酸洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干，得乙酰络塞维，无须纯化，直接进行下一步反应。将乙酰络塞维粗品62 g（90 mmol）溶于无水甲醇中，溶解，再加甲醇钠5 g，回流3 h，反应完毕后，加入醋酸淬灭，然后蒸干甲醇，C-18液相分离，得白色固体络塞维32 g，两步收率75.7%，mp.171～173 ℃。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ) 7.43 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.27 ~ 7.19 (m, 1H), 6.66 (dd, J = 16.0、3.8 Hz, 1H), 6.44 ~ 6.26 (m, 1H), 5.08 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 5.00 ~ 4.92 (m, 2H), 4.82 (dd, J = 13.2、3.1 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.40 (ddd, J = 13.2、5.3、1.7 Hz, 1H), 4.21 (dd, J = 11.1、4.9 Hz, 3H), 3.93 (dd, J = 11.3、1.7 Hz, 1H), 3.84 ~ 3.69 (m, 1H), 3.69 ~ 3.59 (m, 2H), 3.57 ~ 3.27 (m, 8H), 3.14 (td, J = 8.9、4.8 Hz, 1H), 3.08 ~ 2.96 (m, 2H). 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6, δ) 136.98, 131.98, 129.08 (2 C), 128.05, 126.80 (2 C), 126.70, 103.98, 102.37, 77.09, 76.15, 73.89, 73.01, 71.02, 70.66, 68.93, 68.61, 67.79, 65.31。ESI-MS C20H28O10Na [M+Na]+ m/z=451.1580。
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本研究所用的合成方法以β-D-五乙酰基葡萄糖和阿拉伯吡喃糖为起始原料，合成1-O-三氯亚胺酯-2,3,4,6四乙酰葡萄糖、1-O-三氯亚胺酯-2,3,4,三乙酰阿拉伯糖为高活性糖基化供体，合成络思为中间体，经选择性保护和脱保护后，以三氟甲磺酸三甲基硅脂为糖苷化反应催化剂合成络塞维，此方法较三氟化硼乙醚糖基化收率更高[5],比碳酸银、三氟甲磺酸银[6]催化溴代四乙酰葡萄糖的方法更为简单，无需避光操作，而且原料便宜，成本更低，合成过程中无高危险性反应。三氯亚胺酯为活化基团的供体，较端位乙酰基糖为活化基团供体的糖基化反应收率更高。在葡萄糖6位-OH的选择性保护上，叔丁基二苯基硅基[7, 8]以足够的空间位阻，具有高效的选择性，稳定性较好，较-Li[4]用三苯甲基保护更有优势，而且后期选择性脱除简单，极大简化了合成过程，提高了合成中间体的反应收率。本方法合成络塞维工艺简单，合成路径短，生产成本低，原料便宜，安全性高，污染少，收率高，适合于络塞维的规模性放大生产。
Synthesis of the active ingredient rosavin of Rhodiola rosea
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摘要:
目的 研究红景天活性成分络塞维（rosavin）的化学全合成方法。 方法 以β-D-五乙酰葡萄糖、1-羟基-2,3,4-三乙酰阿拉伯吡喃糖、肉桂醇为起始原料，经1-位选择性脱乙酰基、糖苷化反应、葡萄糖6-OH选择性保护及脱保护等8步反应制备目标化合物。 结果 以高收率成功获得目标产物络塞维，结构经ESI-MS和1H-NMR、13C-NMR确证。首次报道以叔丁基二苯基氯硅烷高选择性、高收率保护6-OH的技术途径。 结论 该合成路线具有操作简单，收率高，安全性好等优点。 Abstract:Objective To establish the chemical synthesis of the active ingredient rosavin of Rhodiola rosea. Methods β-D-pentaacetylglucose, 1-hydroxy-2,3,4-triacetylarabinose and cinnamyl alcohol were used as starting materials. The target compound was prepared by 1-position selective of β-D-pentaacetylglucose deacetylation, glycosylation reaction, glucose 6-OH selective protection and deprotection and other 8-step reactions. Results The target product, rosavage, was successfully obtained with high yield. The structure was confirmed by ESI-MS, 1H-NMR and 13C-NMR. The protection of 6-OH with high selectivity and high yield of tert-butyldiphenyl chlorosilane played a vital role in the synthesis process,. Conclusion The synthetic route has the advantages of simple operation, high yield, and good safety. -
Key words:
- Rhodiola rosea /
- rosavin /
- total synthesis /
- selective protection
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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