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镰形棘豆总黄酮的含量测定方法研究

刘晓玲 杨育儒 蔡小辉 陈锦珊

温瑞睿, 许龙, 朱文静, 杨建伟. 浅谈国外药师主导开展戒烟服务的作用与挑战[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
引用本文: 刘晓玲, 杨育儒, 蔡小辉, 陈锦珊. 镰形棘豆总黄酮的含量测定方法研究[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(5): 422-425, 459. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018
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Citation: LIU Xiaoling, YANG Yuru, CAI Xiaohui, CHEN Jinshan. Study on the determination of total flavonoids in Oxytropis falcata Bunge[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(5): 422-425, 459. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018

镰形棘豆总黄酮的含量测定方法研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018
基金项目: 原南京军区科技创新项目(14MS085);漳州市自然科学基金(ZZ2018J15);第九〇九医院青年苗圃项目(NO. 17Y012)
详细信息
    作者简介:

    刘晓玲,主管药师,研究方向:医院制剂,Tel:0596-2975796,Email:1018943143@qq.com

    通讯作者: 陈锦珊,副主任药师,研究方向:医院药学,Tel:0596-2975701,Email:cjs18659341758@163.com
  • 中图分类号: R917

Study on the determination of total flavonoids in Oxytropis falcata Bunge

  • 摘要:   目的  建立紫外-可见分光光度法测定镰形棘豆总黄酮含量的方法。  方法  分别采用直接测定法、氯化铝-醋酸钠显色法和硝酸铝显色法,以芦丁为对照品,探究最优显色方法并进行显色条件优化和系统的方法学考察。  结果  最优显色法为氯化铝-醋酸钠显色法,以供试品不加显色剂为参比,0.3 mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,1.0 mol/L醋酸钠4.0 ml,放置16 min,最大吸收波长为277 nm,此方法项下芦丁对照品在8.8~44 μg/ml的范围内,浓度与吸光度呈现良好的线性关系,线性回归方程为Y=0.0353X+0.0267(r=0.9996),加样回收率平均值为100.91%(n=9,RSD=2.426%)。  结论  该方法简便、快速、准确、灵敏,可作为镰形棘豆总黄酮含量的测定方法。
  • 烟草流行是世界有史以来面临的最大公共卫生威胁之一,全球每年有800多万人由于烟草而死亡[1],吸烟不仅是各种非传染性疾病常见的主要风险因素,尤其是慢性呼吸道疾病、心血管疾病、癌症和糖尿病,同时会影响周围人的健康,而且对个人和国家的经济及社会形象产生负面影响[2]。据估计,每年全球消耗治疗烟草相关疾病的费用约1.4万亿美元[1]

    戒烟是降低非传染性疾病风险的最重要有效的干预措施之一。随着公共卫生工作的防范与发展,60%的烟草使用者希望戒烟[3],但只有约35%能够获得全面的戒烟服务,患者的戒烟意愿突显了在医疗系统内扩大戒烟可及服务及优先开展戒烟治疗的重要性[4-5]

    由于尼古丁的成瘾性,依靠吸烟者以自我管理的方式戒烟实施困难。事实证明,医疗保健专业人员提供的戒烟干预措施比自助式戒烟更有效[6]。药师的工作职责是为公众调配处方、提供用药指导与建议、解答用药咨询等,被认为是为公众提供戒烟服务的最佳专业人员,不仅能够指导其正确使用戒烟替代药品及提供相关建议,同时也可以给予戒烟行为上的专业支持[6-7]

    药师及其药房团队提供的戒烟服务有助于帮助吸烟者戒烟 [8]。葡萄牙进行的一项研究发现,接受药师服务的患者相较于对照组会参加更多社区药房主导的用药咨询(χ2=59.994,P<0.001)、更多电话会议(χ2=17.845,P<0.0013),因此戒烟成功率更高[9]。新加坡一家三级转诊皮肤病中心进行的一项单中心回顾性研究评估了由药师领导的结构化戒烟诊所的疗效,表明药师及其药房团队主导的患者咨询服务能有效为戒烟者提供行为支持[10]

    1.2.1   世界卫生组织的号召与行动

    1998年,世界卫生组织(WHO)首次认识到药师在帮助个人戒烟和防止潜在使用者方面的关键作用[11]。2003年为应对全球烟草流行,WHO成员国通过了《世界卫生组织烟草控制框架公约》(WHO FCTC)[12-13],要求缔约方采取有效措施促进戒烟。WHO FCTC是促进公众健康的一个里程碑,自2005年生效以来,WHO FCTC已有183个缔约方,涵盖90%以上的世界人口[14]

    为了扩大实施WHO FCTC中关于减少烟草需求的条款,WHO在2007年还启动了一项具有成本效益的实用行动MPOWER系列措施[15]。MPOWER措施中的策略与WHO FCTC相一致,已证明在挽救生命和降低医疗卫生费用方面卓有成效[1]。然而随着WHO FCTC的成功实施,一些中低收入国家也面临着来自烟草产业对其干扰的重大障碍[16-17]。药师可以在克服这些问题及现有制度和行业体系结构进行重大变革中发挥一定作用,为促进烟草控制和戒烟工作做出应有的贡献[18]。2019年WHO发布的全球烟草流行报告中,强调了药师为吸烟者戒烟提供帮助,并高度鼓励成员国就此采取行动[19]

    目前,151个国家至少实施了WHO FCTC及MPOWER措施中的一项,150个国家的烟草使用率正在下降。2000年,全世界大约1/3的成年人吸烟,然而,到2022年这一数字已大幅下降约1/5,这反映出各国在减少全球烟草消费方面取得了相当大的进展[20]

    1.2.2   国际药学会的响应与行动

    2003年,国际药学会(FIP)发布了关于药师在促进无烟未来中的作用的政策声明。2007年出版的《遏制烟草流行病:药学的全球作用》和2015年出版的《建立无烟社区:药师实用指南》均强调了药师在戒烟服务方面的重要贡献。

    2023年,FIP出版《支持戒烟和治疗烟草依赖:药师手册》强调药师在为寻求戒烟患者提供系统服务方面的关键作用,是药师支持个人戒烟过程中可参考的综合性实用资源。其涵盖了最新的循证实践、技术和策略,以帮助患者戒烟并减少复吸。该手册详细介绍了以药师为主导的支持戒烟所需的专业知识和实践技能,以及药师可干预的因素(包括非传染性疾病风险因素,如运动不足、不健康饮食习惯和过量饮酒等)及相关措施。随着近年来替代品电子烟使用的增多趋势,出于对电子烟安全性的担忧,同年FIP又发布了《关于电子烟使用对公众健康和经济的影响以及药房工作人员对消除电子烟贡献的声明》[21]

    2024年,WHO和FIP就药师在戒烟中的作用发表了一份新的联合声明,重申了药师在帮助吸烟者戒烟中发挥的关键作用。该声明中,WHO和FIP敦促各个国家烟草控制组织和国家药学协会制定并实施戒烟计划,同时在该计划和各国卫生系统服务的背景下,让药师参与到与烟草的斗争工作中[22]

    有研究表明患者更愿意社区药师参与戒烟服务[23],同时社区药师也有能力开展戒烟服务[24]。美国一家三级护理医院进行的一项研究表明,药师无论是在患者入院还是出院时,都可以对患者开展戒烟宣教与指导,在了解患者疾病与用药史、药物核对和出院咨询工作流程中与患者讨论吸烟问题,通过患者住院期间开展戒烟治疗并不断完善方案,达到有效戒烟的目的[25]

    英国在新型冠状病毒流行期间进行的一项研究表明,药师可以通过远程咨询为戒烟患者开具处方,提供有效的戒烟服务。目前,英国国家医疗服务体系(NHS)正在支持现有药师(包括社区药房药师)获得处方资格,根据患者需要开具戒烟药物从而促进戒烟服务开展。计划到2026年,在英国完成药学学位的毕业生将在监管机构注册为独立处方权药师, 进而扩大了可以提供戒烟服务药师的范围[26]

    美国药师有权根据合作处方协议或通过州范围的协议拥有自主处方权或授权开具处方。处方医生将开启、修改和停止药物治疗以及开具实验室检查的权利委托给药师。药师在完成继续教育课程后,可以根据国家法律法规授予的权限开具某些药物[27]

    药师的戒烟培训应包括基于行为支持的社区药师培训课程,通过戒烟服务个体化随访识别障碍并提供积极的强化措施,可以有效提高患者戒烟率,进而提高其生活质量[28]。El Hajj等[29]在卡塔尔进行的一项随机对照试验评估了戒烟培训计划对药师技能和能力的影响,共有86名社区药师(干预组54名,对照组32名)完成了6个目标结构化临床检查病例。研究结果表明,强化戒烟培训显著提高了社区药师提供戒烟服务的技能和能力。

    在一项评估埃塞俄比亚药师和药学学生对吸烟/戒烟的知识和态度的横断面调查中,与未接受过戒烟培训的人相比,接受过培训人员的平均知识和态度得分明显更高[30]。Greenhalgh等[31]通过定性和混合方法进行的描述性综合和真实世界调查表明,精心设计的戒烟培训课程将药师从生物医学和产品导向的角度,转变为以公共卫生和患者为中心的角度方面发挥至关重要的作用。

    促进戒烟的跨专业合作可以提高患者的戒烟率。一项探索医疗卫生保健专业人员与社区药师之间跨专业合作的研究表明,将社区药师为患者提供戒烟服务纳入患者护理项目是很有价值的,社区药房开展戒烟支持服务可以填补现有医院戒烟与家庭戒烟之间的空白。跨专业合作不仅为患者和医疗保健专业人员之间的有效沟通提供了途径,同时通过医疗保健专业人员汇总的患者电子健康记录,可以提高患者用药治疗的安全性[32]

    根据Greenhalgh等[31]的说法,增加药师和其他医疗从业者之间的跨专业互动是社区药房提供有效戒烟服务的先决条件。药师专业的能力增强了临床医生对药师的信任,因此,明确且精准的转诊途径,特别是当地全科医生将戒烟患者转诊给药师,对于跨专业开展戒烟服务是必要的。

    Bouchet-Benezech等[33]在法国进行的一项研究表明,与其他医疗保健专业人员的合作是发挥药师在戒烟服务中作用的关键之一。药师为戒烟者提供的尼古丁替代治疗处方没有得到社会医疗保险体系的支持,因此建议药师与具有尼古丁替代治疗处方权的其他医疗保健专业人员合作。

    吸烟是非传染性疾病的主要可变风险因素之一。药师主导的戒烟干预措施可以显著影响吸烟者的戒烟率,并在改善其健康状况方面发挥关键作用[34]

    Peletidi等[35]的调查研究表明,以社区药师主导的戒烟服务可以降低与吸烟相关慢病的发病率和病死率。Bouchet-Benezech等[33]为评估法国社区药房药师提供戒烟服务的可行性而进行的一项研究显示,在第6个月,23.3%的参与者参加了随访,其中75%的参与随访者自第一次随访以来一直保持戒烟状态,超过一半的参与者持续了90 d,从第二次随访开始,所有参与者的身心健康综合得分与基线相比都有所提高。

    药师作为一线医疗保健提供者,在戒烟工作中发挥着关键作用,可以在更大范围内对个体和公共健康产生重大影响。社区药房的戒烟服务应该被纳入国家公共卫生保健政策,这对于促进社区服务的健康有积极的促进作用[36]

    Peletidi等[35]在英国进行的一项系统综述强调了将药房主导的戒烟服务与对照组进行比较的研究,提供了强有力的证据证明药房主导的服务具有很高的成本效益。药房主导的服务要求每位戒烟者在为期4周的方案中支付772英镑的补充成本,而对照组基于集体小组的服务需要1 612英镑的戒烟补充成本。同时接受药房主导的戒烟服务,每周一对一的支持结合尼古丁替代疗法的治疗,与对照组接受集体戒烟治疗药物相比具有更高的有效戒烟率。此外,药房主导的服务每生命质量调整年的增量成本为2 600英镑,而对照组为4 800英镑。

    社区药师是提供戒烟服务的一种可获得的、未充分利用的但具有成本效益的资源[24,28,35]。一项随机试验旨在比较两个药师主导的戒烟计划(强化版与简化版)之间的戒烟率以及这些计划与基于文献的对照组之间的成本效益,揭示了强化版药师主导的戒烟计划是3种策略中最具成本效益的干预措施。强化版比简化版多花费了14 000美元(每100名参与者),但14人戒烟成功,取得10.8个生命年的获益额;强化版比对照组多花费35 300美元(每100名参与者),但29名戒烟者取得22.4个生命年的获益,每增加一名戒烟者多花费1 217美元,戒烟的增量成本效果比为1 576美元 [32]

    2000年,一项在英格兰进行的研究从提供者和NHS的角度比较了普通牙科诊所、普通医疗诊所(GMP)、社会药房和NHS戒烟服务(NHS SSS)中戒烟服务的成本效益,研究结果表明“成本效益高”的服务是在社区药房开展戒烟服务[37]

    由此可见,药师主导的戒烟服务不仅有效且极具成本效益,医疗卫生管理者及政策制定者可以基于此就最佳资源分配做出合理决策[24]

    然而,有证据表明,药师在承担戒烟服务提供者这一角色存在障碍,这影响了将全面戒烟服务纳入实践的可行性。障碍包括缺乏充分的培训、缺乏适当的转诊结构、社区药房环境中的时间限制、公众对药剂师提供戒烟服务缺乏认识、药房缺乏私人咨询区以及缺乏提供服务的报销[33]

    在许多国家,药师缺乏戒烟知识和技能以及缺乏培训被认为是药师在提供戒烟服务方面发挥作用的常见障碍[6,30,32,35,38-39]。Erku等[30]在埃塞俄比亚进行的一项由410名参与者(213名药学学生和197名药师)的横断面调查,提出药师在戒烟服务方面存在临床知识不足和实践技能差距。澳大利亚进行的另一项研究分析了250名大四药学专业学生、51名药师和20名戒烟教育工作者在当前基于证据的药房戒烟干预实践中的表现,得出了药学学生及药师与戒烟教育工作者之间存在较大的临床或药物治疗服务方面的差距[34]。药师由于缺乏戒烟相关教育与培训导致在戒烟服务中缺乏自信,从而阻碍了与患者的有效沟通,降低了提供的戒烟服务的质量[35,39]。在约旦,大多数药师认为,由于培训不到位导致对戒烟治疗的了解不足,致使药师无法提供足够的戒烟干预措施[40]

    缺乏戒烟计划或劳务报酬也是许多有意愿药师提供戒烟服务的一个障碍[31-33,39-40]。美国的一篇研究论文探讨了药师在护理过渡期间(住院到出院回家期间)如何衔接戒烟服务,得出支付报酬对维持任何医疗服务(包括药师提供的戒烟服务)至关重要。由于药师不被视为戒烟服务的提供者,因此美国大多数州的药师没有资格通过医疗补助获得提供戒烟服务的劳务报酬,通过商业保险获得报销的也很少见。缺乏鼓励药师向烟草使用者提供戒烟干预措施的计划和政策,药师没有戒烟药物处方权也大大阻碍了戒烟服务的开展[35]。研究表明,授予药师戒烟服务提供者身份或药师拥有戒烟药物处方权,并在医保政策中明确劳务报酬的支付标准,可能是解决该问题的最佳方式[40]

    社会药店缺乏相对私人空间为患者进行戒烟咨询服务也是障碍之一[6,33]。药店是否设有专门的可以为患者提供面对面戒烟服务咨询的区域,为患者咨询营造一个轻松舒适的环境,对于提高患者戒烟依从性是非常重要的影响因素[33]。药师实施戒烟服务与履行其他职责在时间上的矛盾也是限制戒烟服务工作开展的障碍之一[34-35]。根据Peletidi等[35]的系统调查结果显示,缺乏时间是所有参与戒烟服务者,包括患者在内的共性问题。日本对11家社区药房进行的一项随机研究显示,由于时间和精力有限,许多药房没有将戒烟服务纳入其日常运营范围[32]

    在法国、约旦和尼日利亚等一些国家,对戒烟服务的需求不足被视为药师开展戒烟服务的障碍[9,33,40]。由于缺乏戒烟服务,泰国的戒烟率很低,因此需要在药店开展戒烟服务,为药师提供机会[36]。为了解决这一问题,Bouchet等[33]评估了法国社区药房实施药师提供的戒烟方案的可行性,并建议向社区药房顾客有效推广戒烟服务,以解决需求不足的问题。

    社会药房在烟草控制政策中的参与度较低[9],原因是医疗机构与社会药房缺乏统一的转诊系统来保障提供安全、有效的戒烟服务[23,28]。社会药房药师在无法全面、详细获得患者医疗护理、处方记录的前提下,也就意味着无法了解到患者准确的疾病史与用药史,提供戒烟药物及相关指导可能会增加用药错误的可能性[26]。其他阻碍戒烟服务工作开展的因素还包括性别、年龄、民族、文化等不同所带来的戒烟者个性化差异及沟通交流障碍[23]

    全面了解药师主导的戒烟服务及其在不同地区和医疗保健环境中的影响,对于世界各国药师参与戒烟服务至关重要。基于药师缺乏戒烟知识、技能和培训有关的问题,政策制定者和教育工作者需要做更多的工作,以确保戒烟服务对患者的最大益处。有必要针对不同地区和国家的具体需求采取全面的能力建设措施,包括制定标准化的培训计划,采用线下结合远程学习方式助力药师实践技能发展,促进全球药师专业的持续深入发展。

    医药卫生政策制定应适时考虑将药师主导的戒烟服务纳入国家和地区医疗卫生服务指南,并开展宣传工作,提高人们对药师在戒烟方面发挥作用的认识。立法明确和药师薪酬补偿将有利于公众获得经许可的戒烟服务的机会,扩大药师在提供戒烟服务中的作用也有利于增强公众戒烟信心,同时在不同的医疗保健环境中实施和扩大这些服务争取足够的资源与支持。未来应促进药师、医师、护师、公共卫生专业人员及其他参与烟草控制工作的利益相关者之间更紧密的合作,激发出药师主导戒烟干预措施的全部潜力,提高戒烟的有效性和可持续性。

    随着医药卫生体制的改革及药师进一步以患者为中心的角色转变,药师的可及性被视为开展戒烟服务的最重要驱动因素之一。药师和社会药房团队能够通过结合药理学和行为学方法持续提供成本效益高的个体化戒烟服务,提高戒烟率,最终达到减轻烟草和尼古丁依赖以及烟草相关疾病的负担,促进医疗卫生系统的发展、改善全球卫生状况。

  • 图  1  镰形棘豆总黄酮测定方法的比较

    A.直接测定法;B.AlCl3显色法;C. Al(NO3)3显色法;a.空白;b.对照品;c.供试品

    图  2  反应体系干扰因素考察图谱

    A. AlCl3显色法;B. Al(NO3)3显色法;a.空白为60%乙醇;b.空白为供试品;c.空白为显色剂

    图  3  最优显色条件图谱

    a.供试品;b.对照品;c.空白溶液

    表  1  镰形棘豆总黄酮加样回收率试验结果(n=9)

    样品含量(μg/ml)加入量(μg/ml)测得量(μg/ml)回收率(%)平均值(%)RSD
    (%)
    8.86.2915.09100.00100.912.426
    8.86.2915.32103.66
    8.86.2915.29103.18
    8.89.6818.88104.13
    8.89.6818.55100.72
    8.89.6818.67101.96
    8.810.6519.3098.59
    8.810.6519.1997.56
    8.810.6519.2898.40
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    表  2  镰形棘豆总黄酮含量测定结果

    批号总黄酮(g/g)平均值(g/g)RSD (%)
    2020040910.47630.4653.30
    0.4654
    0.4547
    2020040920.46520.4570
    0.4562
    0.4495
    2020040930.49160.4880
    0.4851
    0.4873
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-12-23
  • 修回日期:  2021-05-16
  • 网络出版日期:  2021-09-28
  • 刊出日期:  2021-09-25

镰形棘豆总黄酮的含量测定方法研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018
    基金项目:  原南京军区科技创新项目(14MS085);漳州市自然科学基金(ZZ2018J15);第九〇九医院青年苗圃项目(NO. 17Y012)
    作者简介:

    刘晓玲,主管药师,研究方向:医院制剂,Tel:0596-2975796,Email:1018943143@qq.com

    通讯作者: 陈锦珊,副主任药师,研究方向:医院药学,Tel:0596-2975701,Email:cjs18659341758@163.com
  • 中图分类号: R917

摘要:   目的  建立紫外-可见分光光度法测定镰形棘豆总黄酮含量的方法。  方法  分别采用直接测定法、氯化铝-醋酸钠显色法和硝酸铝显色法,以芦丁为对照品,探究最优显色方法并进行显色条件优化和系统的方法学考察。  结果  最优显色法为氯化铝-醋酸钠显色法,以供试品不加显色剂为参比,0.3 mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,1.0 mol/L醋酸钠4.0 ml,放置16 min,最大吸收波长为277 nm,此方法项下芦丁对照品在8.8~44 μg/ml的范围内,浓度与吸光度呈现良好的线性关系,线性回归方程为Y=0.0353X+0.0267(r=0.9996),加样回收率平均值为100.91%(n=9,RSD=2.426%)。  结论  该方法简便、快速、准确、灵敏,可作为镰形棘豆总黄酮含量的测定方法。

English Abstract

温瑞睿, 许龙, 朱文静, 杨建伟. 浅谈国外药师主导开展戒烟服务的作用与挑战[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
引用本文: 刘晓玲, 杨育儒, 蔡小辉, 陈锦珊. 镰形棘豆总黄酮的含量测定方法研究[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(5): 422-425, 459. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018
WEN Ruirui, XU Long, ZHU Wenjing, YANG Jianwei. A brief discussion on the development and challenges of smoking cessation services led by pharmacist abroad[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
Citation: LIU Xiaoling, YANG Yuru, CAI Xiaohui, CHEN Jinshan. Study on the determination of total flavonoids in Oxytropis falcata Bunge[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(5): 422-425, 459. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202012018
  • 镰形棘豆(Oxytropis falcate Bunge)系豆科棘豆属多年生无茎草本植物。据《晶珠本草》记载,镰形棘豆以根及根茎或全草入药,被誉为“草药之王”,是我国青藏高原常用的民间草药之一[1]。研究表明镰形棘豆主要活性成分有黄酮类、生物碱类、多糖类等[2],其中黄酮类具有镇痛、抗炎、抗氧化、抑菌等生物活性,在抗肿瘤、抗2型糖尿病及防紫外线晒伤等领域已有较多的文献报道[3-4]。因此,寻找适宜的镰形棘豆总黄酮含量测定方法对其进一步研究具有重要意义。

    目前,中药中黄酮含量测定的常用方法有高效液相色谱法[5-6]、毛细管电泳法[7]和紫外可见分光光度法[8-13]。其中前两种方法用于测定黄酮单体,而紫外分光光度法则用于测定总黄酮。近年来,金属离子络合法[8-13]已成为总黄酮含量测定应用最广泛的方法[10],其原理是在酸性或碱性条件下,金属离子与黄酮发生络合反应,生成不同颜色的金属螯合物,再在紫外或可见光区用比色法测定其含量[10],常用的显色剂有氯化铝和硝酸铝。镰形棘豆总黄酮含量测定方法研究未见报道,本文以芦丁为对照品,对氯化铝显色法和硝酸铝显色法直接测定总黄酮进行考察,以期建立适用于镰形棘豆总黄酮的含量测定方法。

    • AUX220电子分析天平、2550紫外可见分光光度计(日本岛津);LD5-2A低速离心机(北京医用离心机厂);HH2数显恒温水浴锅(江苏金坛市江南仪器厂);SY-176华美冷柜(杭州华美电冰箱厂)。

    • 镰形棘豆(青海西宁,经联勤保障部队第909医院郑绍忠副主任药师鉴定为豆科棘豆属植物镰形棘豆);芦丁对照品(纯度92.6%,中国食品药品检定研究院,批号:100080-200707);95%乙醇、氢氧化钠、醋酸钠、氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯。

    • 精密称取适量镰形棘豆粗粉,置圆底烧瓶中,加入20倍量66%乙醇回流提取2次,每次84 min,过滤,合并滤液,即为上样液。以D-101大孔树脂上柱,上样浓度为275 mg/g,洗脱剂为80%乙醇,洗脱液减压浓缩真空干燥,得纯度为62.86%的总黄酮粉末。

    • 精确称取芦丁对照品0.0110 g,置于50 ml量瓶中,60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.22 mg/ml的芦丁对照品溶液,备用。

    • 精确称取镰形棘豆总黄酮粉末0.0875 g,置于25 ml量瓶中,60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得浓度为3.50 mg/ml的储备液。精密吸取1 ml储备液至10 ml量瓶中,用60%乙醇稀释并定容至刻度,摇匀,即得供试品溶液,备用。

    • 直接测定法:分别吸取对照品溶液和供试品溶液1.0 ml,置于25 ml量瓶中,用60%乙醇稀释并定容至刻度,摇匀。以60%乙醇为空白,于200~800 nm扫描,记录最大吸收波长。

      AlCl3显色法:分别吸取对照品溶液和供试品溶液1.0 ml置于25 ml量瓶中,加入0.1mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,再加入1.0 mol/L醋酸钠5.0 ml,用60%乙醇稀释并定容至25 ml,摇匀,放置5 min。以60%乙醇为空白,于200~800 nm处扫描,记录最大吸收波长。

      Al(NO3)3显色法:分别吸取对照品和供试品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液1 ml,摇匀放置6 min,再加入10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀放置6 min,继续加入4%氢氧化钠溶液10 ml,用60%乙醇定容至刻度,摇匀,放置15 min。以60%乙醇为空白,于200~800 nm处扫描,记录最大吸收波长。

      结果由图1可知,直接测定法的对照品与供试品最大吸收波长不一致,而氯化铝显色法和硝酸铝显色法对供试品溶液和对照品溶液的最大吸收波长接近,分别为277 nm和356 nm。笔者进一步研究供试品和显色剂对氯化铝显色法和硝酸铝显色法的影响,以优选出镰形棘豆总黄酮最适显色系统。

      图  1  镰形棘豆总黄酮测定方法的比较

    • AlCl3显色法:分别吸取供试品溶液1.0 ml于25ml量瓶中,加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,再加入1.0 mol/L醋酸钠5.0 ml,用60%乙醇稀释并定容至25 ml,摇匀,放置5 min。分别以60%乙醇、供试品和显色剂为空白,于200~800 nm处扫描,记录图谱。

      Al(NO3)3显色法:分别吸取供试品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀放置6 min,再加入10%硝酸铝溶液1ml,摇匀放置6 min,继续加入4%氢氧化钠溶液10 ml,用60%乙醇定容至刻度,摇匀,放置15 min。分别以60%乙醇、供试品和显色剂为空白,于200~800 nm处扫描,记录图谱。

      结果如图2所示。由图2A可知,在AlCl3显色体系中,以供试品作为空白时,其吸光度值相较于以60%乙醇作为空白时下降,表明供试品本身对AlCl3显色体系的信号是存在干扰的;以显色剂作为空白时,其吸光度值相较于以60%乙醇作为空白时保持不变,表明显色剂对AlCl3显色体系的信号不存在干扰。由图2B可知,在Al(NO3)3显色体系中,以供试品和显色剂作为空白时,其吸光度值相较于以60%乙醇作为空白时均有所下降,表明供试品和显色剂对Al(NO3)3显色体系的信号均存在干扰。

      图  2  反应体系干扰因素考察图谱

      考虑到干扰因素的可去除性,Al(NO3)3显色体系显然不适合镰形棘豆总黄酮的测定,因为其信号干扰因素供试品和显色剂无法同时去除。而AlCl3显色体系则可通过以供试液不加显色剂作为空白来去除信号干扰,因此选择AlCl3显色体系用于镰形棘豆总黄酮含量的测定,并进行显色条件优化。

    • 精密量取供试品溶液1.0 ml,置25 ml量瓶中,按照“2.4.1”项下方法,依次考察三氯化铝浓度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L)、醋酸钠浓度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)、氯化铝用量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml)、醋酸钠用量(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml)及反应时间(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min),试验结果表明,当氯化铝浓度为0.3 mol/L,用量为3.0 ml,醋酸钠浓度为1.0 mol/L,用量为4.0 ml,反应时间为16 min时,供试品吸光度值最大且趋于稳定。

      分别取供试液和对照品溶液1 ml于25 ml量瓶中,加入0.3 mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,再加入1.0 mol/L醋酸钠4.0 ml,用60%乙醇稀释并定容至25 ml,摇匀,放置16 min,以供试液不加显色剂为参比,于200~800 nm处扫描,记录最大吸收波长,结果见图3

      图  3  最优显色条件图谱

    • 精密量取芦丁对照溶液(0.22 mg/ml)1、1.5、2、3、4、5 ml,分别置于25 ml量瓶中,按“2.5”项下显色条件,制备系列浓度对照品溶液,以供试液不加显色剂为参比,在277 nm波长处测定吸光度,以芦丁对照品浓度X(μg/ml)为横坐标、吸光度Y(A)为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为Y=0.0353X+0.0267(r=0.9996),表明在8.8~44.0 μg/ml浓度范围内,芦丁对照品浓度与吸光度之间呈现良好的线性关系。

    • 精密量取按“2.2”项下制备的芦丁对照品溶液1.0 ml,6份,置于25 ml量瓶中,按“2.5”项下显色条件,在277 nm波长处测定吸光度,以吸光度计算RSD为0.15%(n=6),结果表明精密度良好。

    • 精密量取按“2.3”项下制备的镰形棘豆总黄酮供试品溶液1.0 ml,6份,置于25 ml量瓶中,按“2.5”项下显色条件,在277 nm波长处测定吸光度,以吸光度计算RSD为1.97%(n=6),表明本法重复性良好。

    • 精密量取按“2.3”项下制备的镰形棘豆总黄酮供试品溶液1.0 ml,置于25 ml量瓶中,按“2.5”项下显色条件,每隔10 min测定一次,在277 nm波长处测定吸光度,以吸光度计算RSD为1.2%(n=6),表明样品在60 min内稳定。

    • 精密量取按“2.3”项下制备的镰形棘豆总黄酮供试品溶液1.0 ml,置于25 ml量瓶中,再分别加入芦丁对照品溶液(0.242 mg/ml)0.65、1.00和1.10 ml,每个体积3份,共9份,按“2.5”项下显色条件,在277 nm波长处测定吸光度,标准曲线法计算总黄酮含量,并计算得回收率平均值为100.91%,RSD为2.426%(n=9),结果见表1

      表 1  镰形棘豆总黄酮加样回收率试验结果(n=9)

      样品含量(μg/ml)加入量(μg/ml)测得量(μg/ml)回收率(%)平均值(%)RSD
      (%)
      8.86.2915.09100.00100.912.426
      8.86.2915.32103.66
      8.86.2915.29103.18
      8.89.6818.88104.13
      8.89.6818.55100.72
      8.89.6818.67101.96
      8.810.6519.3098.59
      8.810.6519.1997.56
      8.810.6519.2898.40
    • 按“2.3”项下方法制备镰形棘豆总黄酮供试品溶液3批,按“2.5”项下显色条件,于277 nm波长处测定吸光度,以测得的吸光度结果计算RSD为3.30%(n=9),结果见表2

      表 2  镰形棘豆总黄酮含量测定结果

      批号总黄酮(g/g)平均值(g/g)RSD (%)
      2020040910.47630.4653.30
      0.4654
      0.4547
      2020040920.46520.4570
      0.4562
      0.4495
      2020040930.49160.4880
      0.4851
      0.4873
    • 黄酮类化合物是一类广泛存在于中草药中的化合物,是植物的重要次生代谢产物。黄酮类化合物的结构中有两个交叉共轭体系,即A环苯甲酰基系统和B环桂皮酰基系统,产生两个紫外吸收谱带,分别在240~280 nm(Ⅰ)处和300~400 nm(Ⅱ)处。此类化合物的苯环上多有酚羟基取代,因此在碱性条件下,两个紫外吸收谱带可发生红移。利用这一光谱性质可采用紫外分光光度法进行黄酮类化合物含量测定。其中,Al(NO3)3显色法原理为用亚硝酸钠先把还原酮还原,再加Al3+进行络合,最后在NaOH碱性条件下使黄酮C环裂解生成查尔酮而显示橙红色。AlCl3显色法原理为Al3+可与黄酮的3-羟基-4-羰基、5-羟基-4-羰基和B环邻二酚羟基络合[16],使黄酮的紫外吸收谱带红移再用该法测定。

      不同中药的总黄酮化合物组分各不相同,其显色方法需要经过研究及验证。现有文献报道[17-19],单纯以显色剂或供试品作为空白,其干扰因素的影响较为复杂。本文在显色方法选择时发现供试品和显色剂对Al(NO3)3显色体系在356 nm处的信号均存在干扰,其干扰因素无法去除,并且其专属性较差,存在多个小峰。而AlCl3显色体系中,供试品本身对AlCl3显色体系在277 nm处的信号存在干扰,但显色剂对AlCl3显色体系的信号不存在干扰,因此,可通过以供试液不加显色剂作为空白来去除信号干扰。

      通过AlCl3显色法的显色条件优化,最佳显色条件为0.3 mol/L三氯化铝溶液3.0 ml,1.0 mol/L醋酸钠4.0 ml,放置16 min,最大吸收波长为277 nm。经方法学考察,该方法用于镰形棘豆总黄酮含量测定,具有简便、快速、准确和灵敏等优点。

参考文献 (19)

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