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脑卒中是人类疾病中最常见的脑血管疾病，已经成为人类死亡的第二大原因[1]。脑卒中引起的一系列并发症和后遗症给患者家庭带来了不可估量的负担。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种，其中，缺血性脑卒中又称脑中风，是脑卒中主要的发病方式，约占脑卒中患者的83%以上[2]。目前，尚无有效的治疗药物用于脑卒中引起的损伤，尤其是对于神经损伤的治疗[3]。活性多肽GRGDS是由甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS）5种氨基酸构成，主要通过形成一个β转角的方式与其他细胞发生黏连[4]，因而，能够阻断细胞外基质和细胞表面整合素的结合和黏附，可应用于组织工程或者癌症和肿瘤方面。本试验采用PC12细胞体外模拟脑缺血模型，探讨活性多肽GRGDS对氧糖剥夺损伤后的PC12细胞是否具有保护作用。
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PC12细胞购自ATCC细胞库，培养在含有10%胎牛血清的完全培养液中，每12 h观察一次细胞的生长状态，每24 h更换一次细胞培养液，待细胞长到80%进行传代。
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活性多肽GRGDS（上海淘普生物科技有限公司）；高糖DMEM培养液、DMEM无糖培养液（Gibco公司）；凋亡试剂盒、蛋白质提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗体：β-肌动蛋白（β-actin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-SAPK/JNK)、Bax蛋白（美国CST公司）。
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细胞培养箱、酶标仪（美国Thermo公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；细胞缺氧装置（美国Billips-Rothenberg公司）；流式细胞仪（BDBiosci-ences公司）；Western blot图像扫描仪（美国Odyssey公司）。
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氧糖剥夺模型参照文献[5]体外模拟脑缺血模型，即OGD模型，再根据实验过程中的实际情况稍作改造。将细胞培养在培养板中，待细胞生长至培养板底面积80%以上，将对照组的培养液换成无血清高糖完全培养液，OGD组换成无糖培养液，活性多肽GRGDS给药组换成加有GRGDS药物处理的无糖培养液。将含有3组细胞的培养板置于恒温培养箱中孵育1 h，然后将模型组和给药组的细胞置于缺氧装置中，通入混合气体（95%N2，5%CO2），使装置内的氧气完全排出，分别将细胞缺糖和缺氧2、4、6、8 h后取出，采用MTT法选出细胞损伤的最佳时间，进行后续试验研究。
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将PC12细胞以2.0×105个/ml的密度铺于96孔板中，按照“2.1”项下方法进行操作，在缺糖、缺氧之前，将给药组细胞的培养液换成含有不同浓度的活性多肽GRGDS（10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 μg/ml）的无糖培养液置于培养箱中适应1 h，OGD组和给药组一同置于缺氧装置中缺氧4 h。缺氧过后取出培养板，在避光条件下将所有组的细胞加入每孔20 μl提前配好的0.5%MTT溶液（5 mg/ml），用锡箔纸包好将其放入37 ℃恒温培养箱中，继续孵育4 h后弃掉上清液，再向每个细胞培养孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，温室振荡5 min，用全自动酶标仪在492 nm波长处检测每个孔中细胞的吸光值（A）。
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将PC12细胞铺于6孔板中，待细胞贴壁后将OGD组中的培养液换成无糖DMEM培养液，给药组中的培养液换成加有活性多肽GRGDS处理的无糖DMEM培养液，恒温孵育1 h后置于缺氧装置中缺氧4 h，缺糖、缺氧后弃掉每孔中的细胞上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，洗掉细胞表面残留的培养液，再用不含依地酸(EDTA)的胰蛋白酶消化液消化1～2 min。将各组细胞置于不同的离心管中，以1200 r/min离心5 min，弃上清液，再加入PBS，将细胞进行重悬后再离心。离心后弃掉上清液，每个离心管中加入500 μl的1×缓冲液轻轻吹打混匀，避光条件下向各离心管中加入5 μl的细胞凋亡检测试剂(annexin V-FITC)，室温放置5 min后，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色液。充分混匀后室温避光放置15 min，用流式细胞仪进行检测。
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将PC12细胞氧糖剥夺后取细胞上清液，4 ℃、300 r/min，离心15 min。离心后取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，若不能及时检测，应将上清液放在−20 ℃冷冻保存。按照试剂盒中的说明书建立标准曲线，检测各组样本吸光值，并计算其浓度。
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将氧糖剥夺损伤后的各组细胞上清液弃掉，用预冷的PBS清洗细胞表面残留的培养液，用细胞刮刀将各组细胞刮掉，置于预冷的RIPA裂解液中裂解30 min，使细胞中的蛋白完全裂解，以12 000 r/min，离心10 min，取上清液。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。各组蛋白中加入20 μl 5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min。10%SDS-PAGE分离蛋白，转膜，用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭1 h，孵育一抗4 ℃环境下过夜，回收一抗，洗膜3次（5 min/次），室温条件下加二抗，避光孵育2 h后洗膜。使用Western blot图像扫描仪扫描并统计结果。
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所有实验数据均以（
$\bar x $ ± s）表示，并采用单因素方差分析比较组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。 -
为了选择合适的缺糖缺氧时间，本实验设置了2、4、6、8 h的时间点，结果显示，细胞生存率随着氧糖剥夺时间的增长而显著降低，与对照组相比有显著性差异（P<0.01），且缺糖缺氧4 h细胞明显皱缩，细胞活性明显降低，细胞的损伤率达到50%，此时的损伤率有利于药物补救，更有助于细胞的恢复，因此，氧糖剥夺损伤时间为4 h条件最佳（图1A）。活性多肽GRGDS给药浓度为0.01 μg/ml，可显著提高缺糖缺氧4 h后PC12细胞的活力（P<0.01）。因此，选择缺糖缺氧4 h，给药浓度0.01 μg/ml作为实验条件进行后续研究（图1B）。
图 1 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞的影响（n=3）
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将细胞以2.0×105个/ml细胞密度铺于6孔板中，培养16 h后，将OGD组细胞的高糖培养液换成无糖的DMEM培养液，给药组细胞的高糖培养液换成给予活性多肽GRGDS药物处理的无糖DMEM培养液，37 ℃恒温培养箱中平衡1 h，缺氧4 h，而正常对照组细胞的培养液换成新的高糖DMEM培养液继续培养。缺糖缺氧结束后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。图2结果显示，与正常对照组比较，OGD组细胞的凋亡率显著增加（P<0.01），由正常对照组（2.26±0.61）%上升到（12.14±1.69）%。给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，细胞凋亡率明显降低，凋亡率降至（6.94±1.45）%（P<0.01）。
图 2 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞凋亡率的影响（n=3）
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正常对照组细胞上清液中TNF-α的含量为（27.16±2.69）pg/ml，两者相比，OGD组细胞中的TNF-α含量明显增加（P<0.01），为（54.51±2.89）pg/ml；与OGD比较，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理的细胞上清液TNF-α的含量显著降低，为（38.32±18）pg/ml（P<0.01，图3A）。正常对照组细胞上清液IL-1β的含量为（15.4±0.11）pg/ml，OGD组细胞上清液中IL-1β的含量为（35.99±2.25）pg/ml，两者相比，OGD中的IL-1β含量显著增加（P<0.01）。与OGD比较，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理的细胞上清液中IL-1β的含量显著降低，为（21.84±1.18）pg/ml（P<0.01，图3B）。
图 3 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β的影响（n=3）
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本实验检测了MAPKs信号通路中的JNK信号通路中相关蛋白表达的影响。结果如图4所示，PC12细胞经过氧糖剥夺损伤后，细胞中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达与正常对照组细胞相比均显著升高（P<0.01）；而给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，可明显降低氧糖剥夺损伤后细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白的表达（P<0.01）。
图 4 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达的影响（n=3）
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将原始浓度为10 mmol/ml的JNK抑制剂（SP600125）稀释成10 μmol/ml的浓度加入到PC12细胞中，缺糖缺氧后提取细胞蛋白分别检测p-JNK及其下游Bax蛋白的表达情况。结果如图5所示，OGD组细胞中p-JNK、Bax的蛋白表达与正常对照组细胞相比都显著增加（P<0.01）；给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度以及JNK抑制剂处理后，p-JNK、Bax蛋白的表达水平与OGD组相比均明显降低（P<0.01）。
图 5 活性多肽GRGDS对OGD的PC12细胞加入JNK抑制剂后p-JNK、Bax蛋白表达的影响（n=3）
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缺血性脑卒中是由血管阻塞引起的脑血液循环障碍诱发的神经系统损伤，致死、致残率较高，且病理机制十分复杂，目前医学上仍缺乏行之有效的治疗方法。在急性缺血的早期阶段，细胞凋亡可能是对氧糖剥夺的一种自我保护反应，有助于维护重要细胞的生存。然而，在局部缺血的大部分期间，钙超载、氧自由液和溶酶体酶的释放均会导致细胞坏死[6]。
最新研究表明，活性多肽GRGDS可激活体内干细胞，促进细胞的增长和分化[7]。但是，活性多肽GRGDS对于PC12细胞凋亡引起的一系列炎症反应的作用尚未见研究报道。因此，本实验研究了活性多肽GRGDS对氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡和凋亡反应的抑制作用，并初步探讨其可能存在的药理和药效机制。首先，建立氧糖剥夺损伤的PC12细胞模型，同时加入不同给药剂量浓度的活性多肽GRGDS进行处理。结果发现，活性多肽GRGDS的不同给药剂量浓度可有效抑制氧糖剥夺PC12细胞的损伤，并且当活性多肽GRGDS的剂量浓度为0.01 μg/ml时药物作用效果最佳。故确定0.01 μg/ml浓度作为机制探讨剂量。
TNF-α是一种促炎性多效细胞因子，研究表明，TNF-α可以通过激活转录因子NF-κB的机制阻止神经元的死亡或凋亡，从而诱导Mn-SOD和Bcl-2的表达[8]。TNF-α在大脑发育过程中起着效应分子的作用，经常参与不同的信号通路，激活巨噬细胞和神经胶质细胞，促进神经毒素的产生，并启动神经细胞的凋亡或死亡过程[9]。IL-1β作为一种炎症和免疫源性细胞因子，可在多个环节参与脑缺血损伤机制。研究表明，大量炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α）参与脑缺血再灌注损伤后脑细胞的凋亡和坏死[10]。因此检测了氧糖剥夺损伤的PC12细胞上清液，结果显示，氧糖剥夺损伤后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量显著增加，给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后，上清液中的TNF-α和IL-1β含量明显降低。
本研究结果显示，经过氧糖剥夺损伤后，PC12细胞的凋亡率明显增加，而给予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度处理后PC12细胞的凋亡率显著下降，这提示了活性多肽GRGDS可能通过抑制PC12的凋亡而发挥神经保护作用。为了进一步研究活性多肽GRGDS是否通过抗凋亡作用发挥对PC12细胞的保护作用，本实验试着对凋亡信号通路中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3等相关蛋白的表达进行了检测。据报道，caspase 3是细胞凋亡中的关键部分，是其信号传导的效应通路。caspase 3可能通过线粒体、内质网和死亡受体三种途径激活体内细胞中的死亡信号。缺血性脑卒中一般会引起体内线粒体细胞色素c的释放导致caspase 3的表达、激活和裂解，从而促进细胞凋亡。在细胞死亡引起的凋亡过程中，cleaved caspase 3的表达会增加[11]。研究发现，MAPK可以参与调节多种信号通路诱导或减轻细胞凋亡，活化的JNK会引起脑缺血应激反应的细胞凋亡，而JNK抑制剂在脑缺血再灌注损伤后提供神经保护作用。Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡Bcl-2（Bcl-xL）和促凋亡Bax蛋白之间的动态平衡在决定脑缺血期间的细胞命运中起关键作用。越来越多的证据表明，Bcl-2（Bcl-xL）/Bax比率的增加抑制Bax易位至线粒体并保护神经元免受细胞凋亡的损伤，而平衡向Bax过量的转变会引起缺血诱导的神经细胞凋亡。本研究结果显示，氧糖剥夺损伤后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白的表达水平显著升高，综合流式细胞仪检测氧糖剥夺损伤后PC12细胞凋亡的结果，表明活性多肽GRGDS可能通过抑制凋亡信号通路中的JNK/Bax信号通路，进而抑制氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡反应，最终发挥神经保护作用。
本研究结果表明，活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml剂量浓度可以明显抑制氧糖剥夺损伤的PC12细胞凋亡，降低细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量，并通过调控JNK/Bax信号通路蛋白的表达发挥神经保护作用。活性多肽GRGDS可能在脑缺血中对PC12细胞引起的损伤具有一定的神经保护作用。进一步的研究还需在动物模型上进行更深一层的体内药效试验解释活性多肽GRGDS对缺血性脑卒中的影响及其作用机制，为活性多肽GRGDS在临床上用于缺血性脑卒中的药物治疗提供良好的药理学基础。
Protective effect and mechanism of active peptide GRGDS on PC12 cells damage by oxygen-glucose deprivation
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摘要:
目的 研究活性多肽GRGDS对氧糖剥夺（OGD）损伤模型中大鼠神经细胞（PC12细胞）的保护作用，并探讨其作用机制。 方法 将PC12细胞分成对照组、ODG组、活性多肽GRGDS治疗组，通过氧糖剥夺模拟体外脑缺血建立损伤模型。用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测氧糖剥夺后细胞凋亡情况，酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测氧糖剥夺后PC12细胞上清液中炎症因子，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的含量变化，蛋白质印迹法(Western blot)检测凋亡通路相关蛋白表达情况。 结果 MTT法和流式细胞仪检测结果表明，活性多肽GRGDS显著降低氧糖剥夺后PC12细胞凋亡（P<0.05）；ELISA检测结果表明，活性多肽GRGDS明显降低氧糖剥夺后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量（P<0.05），Western blot结果显示，活性多肽GRGDS可显著降低氧糖剥夺损伤介导的PC12细胞p-JNK、Bax、cleaved caspase 3等的蛋白表达水平（P<0.01）。 结论 活性多肽GRGDS对氧糖剥夺损伤的PC12细胞具有保护作用，其机制可能与抗凋亡、抗炎作用有关。 Abstract:Objective To study the protective effect of active peptide GRGDS on rat nerve cells (PC12 cells) in oxygen glucose deprivation (OGD) injury model and explore its mechanism of action. Methods PC12 cells were divided into control group, ODG group, and active peptide GRGDS treatment group. The injury model was established by simulating in vitro cerebral ischemia by oxygen and sugar deprivation. MTT and flow cytometry were used to detect apoptosis after oxygen-glucose deprivation. ELISA method was used to detect the changes of inflammatory factors TNF-α and IL-1β in PC12 cell supernatant after oxygen-glucose deprivation. Western blot was used to detect the expression of apoptosis pathway-related proteins. Results The results of MTT and flow cytometry showed that the active peptide GRGDS significantly reduced the apoptosis of PC12 cells after oxygen glucose deprivation (P<0.05). ELISA test results showed that the active peptide GRGDS significantly reduced the content of TNF-α and IL-1β in the supernatant of PC12 cells after oxygen-glucose deprivation. (P<0.05). Western blot results showed that the active peptide GRGDS significantly reduced the expression levels of p-JNK, Bax, and cleaved caspase 3 in PC12 cells mediated by oxygen-glucose deprivation injury (P <0.01). Conclusion The active peptide GRGDS has protective effect on PC12 cells damaged by oxygen and glucose deprivation. The mechanism may be related to anti-apoptotic and anti-inflammatory effects. -
Key words:
- active peptide /
- GRGDS /
- oxygen glucose deprivation /
- PC12 cells /
- apoptosis
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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
1. 材料和方法
1.1 样品
菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
1.2 仪器与试剂
Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
1.3 发酵与萃取
取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
1.4 提取分离
乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
2. 结构鉴定
化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。3. 活性测试
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
4. 讨论
本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
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图 1 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞的影响（n=3）
A.不同的氧糖剥夺时间；B.不同的GRGDS药物浓度（μg/ml）**P<0.01，与对照组比较；#P<0.05，与OGD组比较。
图 2 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞凋亡率的影响（n=3）
A.细胞凋亡情况；B.细胞凋亡比例**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。
图 3 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞上清液中TNF-α和IL-1β的影响（n=3）
A.TNF-α含量；B.IL-1β含量**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。
图 4 活性多肽GRGDS对OGD后PC12细胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达的影响（n=3）
A. p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的Western blot经典图；B. p-JNK、Bax、cleaved caspase 3蛋白灰度值**P<0.01，与正常对照组比较；##P<0.01，与OGD组比较。
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