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骨质疏松症(osteoporosis, OP)是以骨微细结构破坏和骨量减少为特征的全身性骨代谢疾病，可导致骨脆性和骨折风险增加，多见于老年人。衰老是致骨质疏松的一个重要因素，随着机体的衰老，骨骼中过多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨细胞的增殖、分化和成熟，抑制成骨细胞分泌骨基质及骨基质的矿化，同时促进破骨细胞骨吸收，导致骨质疏松的发生。2018年国家卫生健康委员会发布OP流行病学调查结果显示，我国65岁以上人群OP患病率达32.0%，其中，男性为10.7%，女性为51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在临床上常单独或协同用于防治老年性骨质疏松症，疗效显著[2-3]，是我国现版《原发性骨质疏松症诊疗指南》和《骨质疏松症中西医结合诊疗指南》的推荐药物[1-2]。药理研究发现，MK4能促进成骨增殖、分化和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通过调节氧化应激相关基因和蛋白，在成骨细胞骨形成中发挥保护作用[5]，且能阻止成骨细胞凋亡[6]。过氧化氢(H2O2)是ROS在体内存在的主要形式，会穿透成骨细胞造成细胞损伤，本研究拟探讨MK4对H2O2刺激成骨细胞氧化损伤的保护作用和调控机制，阐明MK4抗老年性骨质疏松的作用机制。
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成骨细胞系MC3T3-El（中国科学院上海生命科学研究细胞资源中心）；特级胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、双抗(青霉素和链霉素混合液)和PBS缓冲液(pH=7.2)均购自美国GIBCO公司；噻唑蓝（MTT）、MK4（Sigma公司）。过氧化氢(H2O2，比利时Acros Organics公司）；丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、JC-1线粒体膜电势(MMP)试剂盒和活性氧(ROS)试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、核酸提取试剂盒、反转录试剂盒和扩增试剂盒（均为Thermo Fisher公司产品）；叉头框蛋白(FoxO1和FoxO3)、β细胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
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复苏MC3T3-El小鼠成骨细胞系，置于5 ml含10% FBS的DMEM培养基中，放入37 ℃、5% CO2培养箱。以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h后，分别采用0、10、20、50和100 μmol/L(n =10)的H2O2处理，培养4、12、24 h后，采用碧云天MTT试剂盒测定细胞活力。
以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h后，并按空白、氧化应激模型、药物剂量分组：①对照组，②选择合适浓度H2O2组，③H2O2 +10 μmol/L MK4组，④H2O2 +1 μmol/L MK4组，⑤H2O2 + 0.1 μmol/L MK4组。加入药物培养24 h，采用MTT法检测细胞增殖活性。
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以2×104/ml浓度的成骨细胞接种于96孔培养板中培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，连续培养6 d，每3 d换液1次，采用硝基苯酚磷酸二钠法检测ALP活性。给药6 d后，弃培养液，PBS洗3次，依次加入100 μl二乙醇胺（50 mmol/L），50 μl的对硝基苯酚磷酸二钠（2.5 mmol/L），在37 ℃孵育30 min，再加入50 μl的0.3 mol/L氢氧化钠溶液终止反应，置405nm处，测吸光度值(A)。以不同浓度的对硝基苯酚溶液绘制标准曲线，ALP活性由每孔释放的对硝基苯酚的μmol数表示。
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以5×104/ml浓度的成骨细胞将MC3T3-El细胞接种于12孔板内，放入37 ℃，5% CO2培养箱，12 h后换骨结节诱导培养基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml抗坏血酸以及10%胎牛血清的DMEM培养基)培养24 h，按照方法“2.1”项下设置各实验组，每3 d换液1次，连续培养14 d，采用0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3)染色，37 ℃下染色30 min，采用倒置相差显微镜(Leica DMI 3000)观察，并随机拍照10张，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨结节面积。
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以2×105/ml细胞浓度铺6孔板，培养24 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，用荧光酶标仪法分别测定JC-1单体和复合物的荧光，DCFH-DA探针法测活性氧水平，ELISA法测定GSH、SOD和MDA水平。
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以1×106/ml细胞浓度铺6孔板，培养12 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，依据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书，采用流式细胞仪法检测。
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以1×106/ml细胞浓度铺6孔板，培养12 h后，按照方法“2.1”项下设置各实验组，干预24 h后，依据试剂盒说明书进行提取总RNA和反转录后，分别对GAPDH、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2和bax进行RT-PCR扩增，引物序列见表1，PCR反应条件：采用预变性95 ℃、10 min，变性95 ℃、45 s，退火60 ℃、45 s，延伸72 ℃、50 s，循环40次，总反应体系为10 μl。
表 1 小鼠引物序列
基因 上游引物 下游引物 SOD2 TCCCAGACCTGCCTTACGA TCGGTGGCGTTGAGATTG FoxO1 GTACGCCGACCTCATCACCAAG GCACGCTCTTCACCATCCACTC FoxO3 TGCTAAGCAGGCCTCATCTCAA AAGCTGTAAACGGATCACTGTC Bcl-2 AGGAGCAGGTGCCTACAAGA GCATTTTCCCACCACTGTCG bax CATCCAGGATCGAGCAGA GCCTTGAGCACCAGTTTG GAPDH TGAACGGGAAGCTAAGG TCCACCACCCTGTTGCTGGA -
每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验，差异有统计学意义（α=0.05），再采用Student's t test检验进行两组比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
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MC3T3-E1经0～100 μmol/L H2O2分别处理4、12、24 h，结果发现0～100 μmol/L H2O2处理4 h对细胞活力均无显著性影响(P>0.05)，处理12 h后，在50和100 μmol/L H2O2下的细胞活力显著降低，分别降低19.4%和33.4%。H2O2干预24 h后，在20、50、100 μmol/L均具有显著性差异，分别降低13.2%，47.4%和57.9%(表2)。故后续实验选择20 μmol/L处理24 h。
表 2 H2O2处理的时间与浓度对成骨细胞活力的影响
处理时间(t/h) 对照组 H2O2浓度(μmol/L) 10 20 50 100 4 0.22±0.04 0.23±0.03 0.22±0.04 0.21±0.05 0.20±0.04 12 0.31±0.05 0.33±0.04 0.30±0.04 0.27±0.02* 0.22±0.03* 24 0.38±0.03 0.39±0.03 0.34±0.02* 0.20±0.03** 0.16±0.04** *P<0.05，**P<0.01，与对照组比较。 -
MC3T3-E1经20 μmol/L H2O2处理24 h后，结果显示，显著抑制了成骨细胞的细胞活力(P<0.05)，ALP活性(P<0.05)和骨结节形成面积(P<0.05)，与空白组比较，分别降低13%、16%和85%，见表3和图1。与模型组比较，MK4在1～10 μmol/L可促进H2O2损伤成骨细胞增殖(P<0.05)。同样，MK4在1～10 μmol/L能显著改善ALP活性(P<0.05)和提高骨结节形成面积(P<0.05)，分别增加50.7%和44.5% (表3和图1)。
图 1 MK4对H2O2损伤成骨细胞骨结节的影响(×200)
表 3 MK4对H2O2损伤成骨细胞的影响
组别 MTT(%对照) ALP(%对照) MPP(%对照) 活性氧(%对照) MDA(μmol/g) 细胞凋亡率(%) 对照组 1.00±0.01* 1.00±0.02* 1.00±0.02* 1.00±0.01* 27.2±4.3** 2.3±0.3* H2O2组 0.87±0.02 0.84±0.03 0.78±0.05 1.13±0.02 51.0±3.7 7.3±0.3 H2O2+MK4(10 μmol/L)组 1.03±0.04* 0.99±0.03* 1.05±0.07* 1.02±0.02* 27.3±3.1** 1.8±0.2* H2O2+MK4(1 μmol/L)组 0.96±0.03 0.87±0.04 0.88±0.21 1.06±0.05 44.8±2.0 2.9±0.3* H2O2+MK4(0.1 μmol/L)组 0.85±0.03 0.80±0.03 0.82±0.09 1.09±0.05 51.6±0.3 5.7±0.4 *P<0.05，**P<0.01，与H2O2组比较。 -
MC3T3-E1成骨细胞经20 μmol/L H2O2处理24 h后，结果发现显著降低成骨细胞膜电势和增高活性氧含量(P<0.05)。与模型组比较，MK4在10 μmol/L可促进H2O2损伤成骨细胞膜电势升高和降低活性氧含量(P<0.05)。与空白组比较，20 μmol/L H2O2能显著降低FoxO1, FoxO3和SOD2的mRNA表达(P<0.05)。与H2O2组比较，给予10 μmol/L MK4后，FoxO1, FoxO3和SOD2的mRNA表达均显著增高(P<0.01)。
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在通道1和通道2观察单个细胞分布区域，选定99.9%的细胞区域用于后续分析，在通道3和通道4观察凋亡细胞分布，Q4为正常细胞，Q1为坏死细胞；Q2为晚期凋亡细胞，Q3为早期凋亡细胞。与对照组比较，20 μmol/L H2O2处理24 h后，细胞的凋亡率显著增高(P<0.05)。经0.1～10 μmol/L浓度MK4干预24 h后发现，1～10 μmol/L浓度MK4能显著降低细胞凋亡率(P<0.05)，与对照组相近，见表3和图2。与空白组比较，20 μmol/LH2O2能显著降低Bcl-2的mRNA表达(P<0.001)，bax表达无显著差异，给予10 μmol/L MK4后，Bcl-2和bax的mRNA表达均显著增高(P<0.01)，见图3。H2O2组的bax/Bcl-2比值为对照组的22.5倍，而MK4处理后降低至对照组的7.6倍。
图 2 MK4对H2O2损伤成骨细胞凋亡的影响
图 3 MK4对H2O2损伤成骨细胞氧化和凋亡相关mRNA表达的影响
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骨代谢中，机体通过调节FoxOs转录因子的活性，产生抗氧化物酶，对抗氧化应激对骨骼的损伤，包括FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6等，其中，FoxO1和FoxO3是调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要分子[7]。活性氧可激活FoxO1的转录，调节线粒体抗氧化酶Mn-SOD的活性[8]。随着活性氧的升高，FoxO3下调，成骨细胞分化受损，抑制骨形成作用[9]。本研究发现，MK4对H2O2引起的氧化应激具有显著的改善作用，降低活性氧和脂质氧化产物MDA水平，上调转录因子FoxO1、FoxO3和抗氧化酶SOD的mRNA表达。
Bcl-2蛋白可减少氧化应激水平，而bax基因可与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2的作用，进而诱导细胞凋亡。MK4可上调Bcl-2/bax比值，抑制了成骨细胞凋亡[10]。本研究发现，H2O2能显著提高成骨细胞凋亡率，同时增加bax的表达，降低Bcl-2蛋白表达。MK4处理组对成骨细胞凋亡的拮抗作用明显，随着剂量浓度增加而增加。MK4在在氧化应激状态下，可显著上调Bcl-2，下调bax的基因表达，bax/Bcl-2比值显著降低，抑制了成骨细胞凋亡。
FoxOs激活促进Bcl-2相关凋亡调节蛋白(Bim)转录，Bim是线粒体凋亡通路的核心调控者，引起成骨细胞线粒体膜电位降低[10]。线粒体跨膜电位降低说明线粒体膜通透性转运孔(MPTP)过度开放。若MPTP过度开放，易引起呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压增高，使得促凋亡活性物质从线粒体释放入细胞基质，导致细胞凋亡。MK4显著改善了H2O2刺激的成骨细胞线粒体膜电势降低，表明MK4对H2O2刺激成骨细胞的氧化损伤具有保护作用。
综上所述，MK4能显著抑制H2O2刺激的成骨细胞氧化损伤，机制与FoxO转录因子相关。同时，MK4对H2O2引起的成骨细胞凋亡具有拮抗作用，其机制为上调Bcl-2和下调bax的基因表达。
Study on the protective effect of menatetrenone against the oxidative stress of osteoblasts
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摘要:
目的 考察四烯甲萘醌(MK4)对成骨细胞氧化损伤的保护作用，阐明MK4防治骨质疏松作用机制。 方法 采用过氧化氢(H2O2)刺激小鼠成骨细胞系（MC3T3-E1）氧化应激模型，考察细胞活力、ALP活性和骨结节面积，DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平，JC-1检测线粒体膜电势，Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率，RT-PCR法考察氧化应激相关基因FoxO1、FoxO3、SOD、Bcl-2和bax等的mRNA表达。 结果 10 μmol/L四烯甲萘醌能显著提高H2O2刺激的成骨细胞增殖、ALP活性、骨结节形成面积和增强细胞膜电势，显著降低H2O2刺激的成骨细胞内丙二醛和活性氧水平，同时显著降低成骨细胞凋亡率和细胞凋亡因子bax/Bcl-2的mRNA表达水平，显著提高抗氧化酶SOD和转录因子FoxO1、FoxO3的mRNA表达。 结论 四烯甲萘醌可通过调控FoxO通路保护成骨细胞氧化损伤和通过下调bax/Bcl-2比例，降低成骨细胞凋亡。 Abstract:Objective To investigate the protective effect of menatetrenone (MK4) on the osteoblasts in oxidative stress, and to clarify the anti-osteoporosis mechanism of MK4. Methods Mouse osteoblasts (MC3T3-E1) induced by hydrogen peroxide (H2O2) was used. Cell viability, ALP activity and the area of bone nodule were observed. The level of ROS was detected by DCFH-DA, mitochondrial membrane potential by JC-1, apoptosis rate by annexin V-FITC/PI, and the expression of FoxO1, FoxO3, SOD, bcl-2 and bax by RT-PCR. Results Menatetrenone at 10 μmol/L significantly increased the proliferation of osteoblasts stimulated by H2O2, ALP activity, bone nodule formation area, cell membrane potential, the antioxidant SOD and transcription factors FoxO1 and FoxO3 mRNA expression. In the meantime, the elevated malondialdehyde and reactive oxygen species level in cells induced by H2O2, the apoptosis rate and the mRNA expression level of bax/Bcl-2 were significantly reduced. Conclusion menatetrenone can protect osteoblasts from oxidative damage by regulating FoxO pathway and reduce osteoblasts apoptosis by up regulating the proportion of Bcl-2/bax. -
Key words:
- menatetrenone /
- osteoporosis /
- osteoblasts /
- oxidative stress /
- FoxO pathway
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奥卡西平(oxcarbazepine, OXC)是第二代抗癫痫药物，可用于儿童全面强直-阵挛发作，部分伴或不伴继发性全面发作的一线治疗[1]，其具有与传统的抗癫痫药物（AEDs）如苯妥英钠、卡马西平和丙戊酸钠相同的疗效，但其对肝药酶和自身的诱导作用小，药物间相互作用较少，临床上可用于替代传统的AEDs。OXC是卡马西平（carbamazepine, CBZ）的一种10-酮类衍生物，但两者之间的药动学存在差异，OXC的耐受性好且不良反应少[2]。OXC是无活性的前体药物，在体内经过肝脏内细胞溶质芳基酮还原酶的作用转化为具有药理活性的中间代谢产物单羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine, MHD）[3-4]。国际抗癫痫联盟推荐MHD血清浓度的参考范围为3～35 μg/ml[5]，有研究表明，当血药浓度高于30 μg/ml时，容易发生药物不良反应，且在许多患者中，不良反应间歇性的发生与MHD浓度的波动有关[6]。在临床用药中也发现OXC服药后的药物浓度个体化差异大，年龄、性别、体重、肝肾功能等均会影响MHD的药动学参数[7]，故需要对其血药浓度进行监测。本研究在参考既往研究的基础上[8-12]，对色谱条件进行了优化，并简化了血样处理的过程，建立了HPLC法测定OXC活性代谢产物MHD血药浓度的方法，该方法快速、简单、准确、选择性好、灵敏度高，为临床监测血药浓度、调整给药剂量提供了手段。
1. 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；SHB-B95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Discovery DV215CD型分析天平（美国OHAUS公司）；Vortex-5型涡旋混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 材料
MHD对照品（美国CATO公司）；内标：奥硝唑（中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海科丰化学试剂有限公司）；空白血浆（医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），预柱为Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（80:20，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μl；双波长检测：在192 nm处检测MHD，318 nm处检测奥硝唑。
2.2 溶液及血浆样品的配制
2.2.1 储备液的配制
精密称取MHD对照品10 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为1 mg/ml的储备液，置于−20 ℃下保存。
2.2.2 内标工作液的配制
精密称取奥硝唑1.4 mg于10 ml的量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为140 μg/ml的内标工作液，置于−20 ℃下保存。
2.2.3 血浆标准曲线和质控样品的配制
分别精密量取适量储备液，用甲醇稀释成20、50、100、200、300、400、500 μg/ml浓度梯度的标准对照溶液。取以上6个标准对照溶液，加入适量空白血浆，得2、5、10、20、30、40、50 μg/ml系列浓度的血浆标准曲线样品。同法配制相应的低、中、高浓度的血浆质控样品（QC），使得MHD对应的浓度分别为5、15、40 μg/ml。
2.3 血浆样品的预处理
取200 μl血浆样品，加入200 μl内标工作液、400 μl甲醇，涡旋混合30 s，10 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，取上清液直接进样。
3. 结果
3.1 专属性试验
通过考察6份不同生物来源的空白血浆样品色谱图、空白血浆样品加入MHD对照品和内标的色谱图，以及临床实际用药后的患者血浆样品色谱图，以此反映方法的专属性。由图1可见，在本实验条件下，被测物MHD与内标的色谱峰分离良好，且血浆中的内源性物质不干扰测定。MHD和内标的保留时间分别为9.5 min和6.1 min。
3.2 标准曲线与线性范围
取上述浓度为2、5、10、20、30、40、50 μg/ml的血浆标准曲线样品按“2.3”项下方法处理。经HPLC法分析，以测得OXC的峰面积与内标峰面积之比（Y）作为纵坐标，以血浆MHD浓度（X）为横坐标，得到回归方程为：Y=0.047 1X+0.022 2（r=0.998 6）。线性范围：根据标准曲线，MHD血药浓度在2～50 μg/ml范围内线性关系良好，其定量下限浓度为2 μg/ml。
3.3 日内、日间精密度和准确度
配制定量下限、低、中、高（2、5、15、40 μg/ml）4种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理后测定，连续测定3 d，以当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，计算日内、日间精密度以及准确度。经测定，MHD的日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，均符合生物样品的测定要求，结果见表1。
表 1 单羟基卡马西平日内、日间精密度和准确度（n=6）理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）RSD（%） RE（%） 日内精密度 日间精密度 2 1.85±0.16 8.64 12.21 −3.63 5 4.93±0.24 4.86 7.68 −4.43 15 14.32±0.37 6.86 6.16 −3.11 40 41.80±1.26 3.03 5.33 0.59 3.4 提取回收率
配制低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各6个，按“2.3”项下方法处理。同时另取18份空白血浆，除了不加系列对照品溶液和内标外，按“2.3”项下方法处理，在获得的上清液中加入MHD和内标溶液至相应浓度。进样分析，以每一浓度中2种不同处理方法的峰面积比值计算提取回收率。经测定，本法中MHD的平均提取回收率在89.62%～95.32%之间；内标的平均提取回收率为98.76%，符合生物学样品的分析要求，结果见表2。
表 2 单羟基卡马西平、MHD和内标提取回收率试验结果（n=6）化合物 浓度（μg/ml） 提取回收率（%） MHD 5 89.62±4.82 15 94.67±6.76 40 95.32±4.90 内标 140 98.76±5.92 3.5 稳定性试验
3.5.1 室温稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并在室温条件下放置4 h和10 h后测定样品血药浓度，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在室温下放置10 h后仍稳定，RSD均小于4.47%，RE值在1.50%～2.98%之间，结果见表3。
表 3 奥卡西平代谢产物单羟基卡马西平稳定性试验结果 (n=5)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD（%） RE（%） 室温10 h 5 5.15±0.19 3.60 2.98 15 15.39±0.69 4.47 2.62 40 40.60±0.40 0.98 1.50 冻融3次 5 5.47±0.15 2.83 9.41 15 15.79±0.32 2.06 5.24 40 40.75±1.10 2.71 1.86 处理后36 h 5 5.39±0.27 5.09 7.74 15 15.66±0.58 3.70 4.39 40 39.46±1.80 4.57 −1.34 −20 ℃，30 d 5 5.16±0.23 4.39 3.19 15 14.62±0.39 2.64 −2.53 40 40.37±0.58 1.44 0.93 3.5.2 冻融稳定性试验
取低、中、高（5、15、40 μg/ml）3种浓度的QC样品各5份，测定即时血药浓度，并于−20 ℃冰箱中冷冻保存24 h后室温下解冻1 h后测定，反复冻融3次，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品反复冻融3次后仍能保持稳定，RSD均小于2.83%，RE值在1.86%～9.41%之间，结果见表3。
3.5.3 处理后的血浆样品在自动进样器中储存的稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆QC样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，然后放置在自动进样器内12 h、36 h后再次测定，求得RSD和RE值。经测定处理后的MHD血浆样品在进样器内放置36 h仍能保持稳定，RSD均小于5.09%，RE值在−1.34%～7.74%之间，结果见表3。
3.5.4 长期稳定性试验
取低、中、高3个浓度水平的血浆质控样品（5、15、40 μg/ml）各5份，测定即时血药浓度，并置于−20 ℃冰箱中冻存30 d后取出解冻后测定，求得RSD和RE值。经测定MHD血浆样品在−20 ℃冰箱中冻存30 d后仍能保持稳定，RSD均小于4.39%，RE值在−2.53%～3.19%之间，结果见表3。
4. 讨论
目前，有关MHD的检测方法的文献很多，其中,高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法都有报道，后者虽有灵敏度高、专属性强的特点，但其仪器昂贵，且需专业人员进行操作，很难在大部分的医疗机构普及[13-15]。另外，国内外文献报道中多使用固液萃取法或液液萃取法进行血样的前处理，但这种处理过程相对复杂、耗时，且经济成本较高[11, 16]。本方法采用甲醇沉淀蛋白进行血样的前处理，建立了HPLC法测定人血浆中MHD血药浓度的方法，整个过程操作简单、快速，样品分析时间较短，适用于临床大量样品的连续检测。
文献报道的流动相有乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液（33∶67，V/V）[12]、水-乙腈（65∶35，V/V）[17]、水-甲醇-乙腈（64∶30∶6，V/V/V）[18]等。本方法采用了水-乙腈，按不同的配比进行试验，发现当水-乙腈的比例为80∶20时，色谱峰的峰形、出峰时间及分离度最佳。文献采用卡马西平[17]、苯巴比妥[19]和奥硝唑[20]等作为内标，本研究通过筛选发现奥硝唑的保留时间为6.1 min，不仅与MHD的保留时间相近，又能与其有很好的分离，且其性质稳定，满足内标的要求。
本实验建立的测定人血浆中OXC活性代谢产物MHD的HPLC法，MHD线性回归方程中的r=0.998 6，说明血药浓度在2～50 μg/ml范围内具有良好的线性关系，日内、日间精密度RSD均小于15%，准确度在95.57%～100.59%之间，MHD及内标的平均提取回收率在89.62%～98.76%之间。血浆样品的稳定性试验证明，在室温放置10 h、反复冻融、处理后放置进样器36 h以及低温保存30 d的情况下，样品未见明显降解，仍能保持稳定。本研究建立的HPLC法操作快速简单，精密度、回收率高，稳定性好，专属性强，不受血浆中内源性物质的干扰，结果准确可靠，且灵敏度高，适用于奥卡西平临床血药浓度的监测。
目前癫痫治疗主要以药物治疗为主，奥卡西平是第二代抗癫痫药物，我国诸多癫痫病专家也建议将其作为癫痫部分性发作和全面强直阵挛发作的首选药物[21]。但奥卡西平使用过程中可能出现瘙痒、荨麻疹、血管性水肿等超敏反应，包括Stevens Johnson综合征中毒性表皮坏死松解症[22]等，还可引起低钠血症、头晕、胃肠道不适等不良反应，有文献报道，其疗效及不良反应可能与血药浓度密切相关[23]，因此开展奥卡西平血药浓度的测定，能提高药物治疗的疗效，同时可以有效避免或减少可能产生的药物不良反应，提高癫痫患者服药的依从性。本研究建立了测定人血浆中MHD血药浓度的方法，应用于临床，为临床个体化给药提供依据，值得临床推广使用。
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图 1 MK4对H2O2损伤成骨细胞骨结节的影响(×200)
A. 对照组; B. H2O2组; C−E. H2O2+10、1、0.1 μmol/L MK4组; F. 骨结节面积
图 2 MK4对H2O2损伤成骨细胞凋亡的影响
A.对照组单个细胞选择范围; B.对照组; C. H2O2组; D−F. H2O2+10、1、0.1 μmol/L MK4组
表 1 小鼠引物序列
基因 上游引物 下游引物 SOD2 TCCCAGACCTGCCTTACGA TCGGTGGCGTTGAGATTG FoxO1 GTACGCCGACCTCATCACCAAG GCACGCTCTTCACCATCCACTC FoxO3 TGCTAAGCAGGCCTCATCTCAA AAGCTGTAAACGGATCACTGTC Bcl-2 AGGAGCAGGTGCCTACAAGA GCATTTTCCCACCACTGTCG bax CATCCAGGATCGAGCAGA GCCTTGAGCACCAGTTTG GAPDH TGAACGGGAAGCTAAGG TCCACCACCCTGTTGCTGGA 
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表 2 H2O2处理的时间与浓度对成骨细胞活力的影响
处理时间(t/h) 对照组 H2O2浓度(μmol/L) 10 20 50 100 4 0.22±0.04 0.23±0.03 0.22±0.04 0.21±0.05 0.20±0.04 12 0.31±0.05 0.33±0.04 0.30±0.04 0.27±0.02* 0.22±0.03* 24 0.38±0.03 0.39±0.03 0.34±0.02* 0.20±0.03** 0.16±0.04** *P<0.05，**P<0.01，与对照组比较。
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表 3 MK4对H2O2损伤成骨细胞的影响
组别 MTT(%对照) ALP(%对照) MPP(%对照) 活性氧(%对照) MDA(μmol/g) 细胞凋亡率(%) 对照组 1.00±0.01* 1.00±0.02* 1.00±0.02* 1.00±0.01* 27.2±4.3** 2.3±0.3* H2O2组 0.87±0.02 0.84±0.03 0.78±0.05 1.13±0.02 51.0±3.7 7.3±0.3 H2O2+MK4(10 μmol/L)组 1.03±0.04* 0.99±0.03* 1.05±0.07* 1.02±0.02* 27.3±3.1** 1.8±0.2* H2O2+MK4(1 μmol/L)组 0.96±0.03 0.87±0.04 0.88±0.21 1.06±0.05 44.8±2.0 2.9±0.3* H2O2+MK4(0.1 μmol/L)组 0.85±0.03 0.80±0.03 0.82±0.09 1.09±0.05 51.6±0.3 5.7±0.4 *P<0.05，**P<0.01，与H2O2组比较。
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