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非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常见的组织学类型，发病率逐年增高，无论是在我国还是全球，都已成为致死率最高的癌症之一[1]。因此，对于NSCLC的防治，特别是探索新的化学预防策略显得尤为重要。目前新兴出现的以靶向和免疫疗法为手段治疗NSCLC越来越引人关注，尽管如此，对于肺癌的治疗同样也面临着研发新型抗癌药物的挑战，包括研发过程中所需巨额费用和时间，而重新使用具有潜在癌症治疗的非抗癌药物用于癌症治疗，不仅可以节省研发新药所需的人、财、物力，甚至还可能提高治疗效果。临床前研究和数据证实许多非抗癌药物具有潜在的预防和治疗癌症的作用，譬如对NSCLC的预防和治疗，这些药物就有阿司匹林、他汀类药物等[2]。
阿司匹林和阿托伐他汀是广泛用于心血管疾病的一线防治用药。近年来，它们已经被证实可能成为新兴的、可用于不同类型肿瘤（包括NSCLC）的化学预防药物[3-5]。尽管它们抗NSCLC的确切分子机制尚需要进一步研究，但文献报道其抗肿瘤作用机制存在重叠，即均可靶向作用于mTOR和NFκB通路。据此我们假设：阿司匹林和阿托伐他汀联合使用可通过共同抑制mTOR和NFκB通路而发挥协同抗NSCLC效应。为验证假设，本实验选取了非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，在体外研究阿司匹林联合阿托伐他汀对它们细胞增殖的影响及其相关作用机制，期望在应用阿司匹林和阿托伐他汀防治心血管疾病的同时可以降低NSCLC的患病风险，以及为设计新型控制NSCLC的干预策略提供理论依据。
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人非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞（美国Manassas公司），培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（美国Sigma-Aldrich公司），置37 ℃饱和湿度、5% CO2培养箱孵育。阿司匹林和阿托伐他汀标准品化合物（美国Sigma-Aldrich公司），用DMSO溶解后−20 ℃保存。RNA提取试剂盒购自上海博彩生物科技公司，BCA法蛋白定量试剂盒和TNF-α和IL-1β反转录试剂盒购自美国Thermo scientific公司，SYBR qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。mTOR、p-mTOR、NFκB、p-NFκB、Bcl-2、Mcl-1、β-Actin抗体以及鼠、兔二抗购自美国CellSignal公司。其他试剂以及仪器设备由本实验室提供。
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分别取对数生长期非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，用胰酶-EDTA消化并计数，将100 μl的细胞混悬液接种于96孔培养板使每孔的细胞数约为5×103个/100 μl。待24 h后细胞贴壁，加入阿司匹林或/和阿托伐他汀（先用DMSO溶解再用DMEM培养液稀释成不同浓度）。使与细胞作用的阿司匹林浓度分别为0、5、50、100、150、200 μmol/L，阿托伐他汀浓度分别为0、1、2、5、10、20 μmol/L。每个浓度设3个复孔，对照组加入DMEM培养液。置于37 ℃、5% CO2培养箱72 h后，加入10 μl MTS溶液（临用前用PBS溶解，pH7.4,质量浓度为5 g/L），再置培养箱继续培养1 h，于酶标仪490 nm处检测吸光度值（A值）。
细胞增殖存活率（%）=（实验孔A值/对照孔A值）×100。
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分别将A549和NCI-H460细胞悬液接种于两个6孔培养板中，保证每孔细胞数约为1×105个/孔，次日待细胞贴壁铺满后进行划痕，PBS清洗一遍后更换无血清培养液。根据MTS实验结果选取了浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组进行实验，24 h后观察划痕距离变化并在显微镜下拍照，与给药前进行比较。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中，同样设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组，并给予对应浓度的药物处理细胞，对照组不作处理。继续培养72 h后收集细胞，PBS洗细胞3次，加入细胞裂解液（含20 mmol/L Tris-Hcl/pH 7.5、1% Triton、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L 无水焦硫酸钠、1 mmol/L β-甘油磷酸盐、1 µg/ml亮肽素和1 mmol/LPMSF），用细胞刮刀将细胞刮下，4 ℃冰浴中超声破碎细胞，待细胞膜破碎反复涡旋后，于4 ℃、12 000 r/min离心，取上清，BCA法蛋白定量后样品经SDS-PAGE分离，蛋白电转至PVDF膜，将PVDF膜在5%牛奶中封闭1 h，加入1∶1 000的一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加入酶标二抗室温1 h，PVDF膜经ECL化学发光底物检测蛋白。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中，设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组。次日待细胞贴壁换培养液给予对应浓度的药物处理细胞，对照组不作处理，继续培养72 h后收集细胞。采用RNA提取试剂盒（上海博彩）提取细胞总RNA，按照TNF-α和IL-1β反转录试剂盒说明书（美国Thermo scientific公司）操作进行反转录。得到的cDNA按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书进行实时定量PCR检测。每个PCR反应体系包括：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、cDNA模板2 μl、10 μmol/L上下引物（表1）各0.4 μl以及7.2 μl去离子水，总反应体积为20 μl，经7300 qRT-PCR系统（Applied Biosystems）检测，反应循环参数为95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s共40个循环。基因的表达用ΔΔCt法计算，以β-actin作为内参。
表 1 qRT-PCR引物序列
引物名称 引物序列（5’-3’） TNF-α 上游：ACCCTCACACTCAGATCATTCTTCTC 下游：CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTC IL-1β 上游：CCAGCAGGTTATCATCATCATCC 下游：CTCGCAGCAGCACATCAA β-actin 上游：TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 下游：CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG -
使用SPSS 16.0软件进行数据处理，所有数据以（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，采用t检验进行两组间差异比较，P<0.05为显著差异。 -
我们选取了浓度分别为0、5、50、100、150、200 μmol/L的阿司匹林和0、1、2、5、10、20 μmol/L的阿托伐他汀处理A549和NCI-H460细胞，72 h后采用MTS法测定两种细胞的增殖活性，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制曲线（图1）。结果显示：阿司匹林和阿托伐他汀单用（浓度分别≥100和5 μmol/L）或二者联用均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖，且二者联用抑制作用大于单用。例如，100 μmol/L阿司匹林和5 μmol/L阿托伐他汀，以及二者联用处理A549细胞，72 h后存活率（与对照孔比较）分别为(69.64±5.95)%、(59.31±5.66)%和(39.51±13.22)%，联合与单用比较，差异有统计学意义（P<0.05）。同样相同浓度的阿司匹林和阿托伐他汀以及二者联用处理NCI-H460细胞，72 h后与存活率（与对照孔比较）分别为(76.73±11.30)%、(59.13±6.61)%和(36.82±8.15)%，且联合与单用比较，差异亦有统计学意义（P<0.05）。
图 1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响
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根据MTS实验结果，选取了浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组进行实验，24 h后观察划痕距离变化并在显微镜下拍照（图2）。结果显示：与给药前比较，阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合均较明显抑制了两种细胞的迁移与侵袭，且二者联合的抑制作用显著增强。
图 2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞迁移与侵袭的影响
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选取浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组处理NCI-H460细胞，72 h后收集细胞。细胞裂解提取蛋白并采用BCA法测定总蛋白，采用Western blotting法检测相关蛋白的表达，结果如图3。
图 3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对NCI-H460细胞信号调控因子蛋白表达的影响
结果显示：100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合均可以抑制p-NFκB、p-mTOR以及抗凋亡因子Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达，且与单药相比，二者联合抑制效应增强，表明阿司匹林和阿托伐他汀联合可以产生协同抑制作用。但与对照组比较，给药组对总NFκB和总mTOR的蛋白表达均无明显影响。
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同样，选取浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组处理NCI-H460细胞，72 h后收集细胞。提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作对TNF-α和IL-1β进行实时定量PCR检测，结果如图4。
图 4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对NCI-H460细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响
结果显示：与对照组比较，阿司匹林组、阿托伐他汀组以及二者联合处理组NCI-H460细胞中TNF-α表达量分别是对照组的（1.13±0.25）、（0.89±0.06）和（0.79±0.23）倍，IL-1β表达量分别是对照组的（0.94±0.20）、（0.81±0.36）和（0.52±0.24）倍。其中，阿托伐他汀组TNF-α和联合处理组IL-1β的表达，与对照组比较差异存在统计学意义（P<0.05），尤其是联合处理组IL-1β的表达差异最为明显，与对照组比较下降了近50%。
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流行病学数据显示，服用阿司匹林或者阿托伐他汀的人群出现了肺癌患病率降低或者肿瘤发生发展的延缓。譬如，Van Dyke等[6]发现成人加强剂量的阿司匹林可以降低55～64岁妇女罹患NSCLC的概率；Jiang等[7]报道，标准剂量阿司匹林（>325 mg）服用5年以上降低了肺癌事件的发生。Lin等[8]在采用倾向评分法对5 118名65岁以上的Ⅳ期NSCLC患者的临床研究发现，服用了阿托伐他汀平均生存时间提高了3个月，并且得出结论阿托伐他汀提高了Ⅳ期NSCLC患者的存活率。这些报道均提示阿司匹林和阿托伐他汀对肺癌具有直接的抑制效应，然而两药联合使用时是否可以表现出协同抗癌活性，目前报道较少，He等[9]研究显示阿司匹林和阿托伐他汀对前列腺癌细胞的增殖有联合抑制作用，但对肺癌细胞的作用未见报道。据此，我们选取了非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，在体外研究阿司匹林联合阿托伐他汀对它们的抑制效应及其相关作用机制。
首先，我们采用MTS法检测了阿司匹林和阿托伐他汀单用及联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响，结果显示（图1）：当阿司匹林和阿托伐他汀的浓度分别大于100和5 μmol/L时均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖，且二者联用抑制作用明显大于各自单用。他汀类药物在体内外可以抑制癌细胞（包括NSCLC）的增殖已有文献报道[10-12]，该结果与之相符。但阿司匹林在体外抑制NSCLC细胞的增殖，以及联合阿托伐他汀发挥协同抑制作用，文献未见报道。所以，本实验结果提示阿司匹林联合阿托伐他汀可以发挥协同抑制NSCLC细胞增殖效应。其次，我们在细胞划痕实验中观察到100 μmol/L阿司匹林和5 μmol/L阿托伐他汀均能抑制A549和NCI-H460细胞的迁移与侵袭，且二者联合抑制作用显著增强（图2），该结果也进一步说明阿司匹林联合阿托伐他汀发挥协同抑制NSCLC细胞效应。
阿司匹林和他汀类药物在临床上广泛应用于预防和治疗心血管疾病，但近年来由于其抗炎作用、抗肿瘤活性的研究发现，且其分子机制研究已经比较成熟，已经无可争议的成为癌症预防的候选药物。通过文献综述我们发现，阿司匹林和他汀类药物发挥抗肿瘤的分子机制有重叠，即均可以直接或间接作用于mTOR和NFκB信号靶点[4,13]，影响它们通路下游一些基因和蛋白的表达，进而发挥抑制癌细胞增殖、诱导凋亡、抗血管生成以及转移等一系列抗肿瘤活性。本研究我们在NCI-H460细胞中验证了阿司匹林和阿托伐他汀靶向作用于mTOR和NFκB信号靶点，抑制它们的磷酸化过程（即抑制活化），且能够抑制它们信号转导下游抗凋亡基因Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达。同时还发现当阿司匹林和阿托伐他汀联合应用时，对这些信号通路中这些蛋白的表达下调作用更加明显，提示二者联合发挥了协同作用（图3）。另外，文献报道他汀类药物可以通过作用炎症调控因子NFκB影响细胞内一些重要炎症因子（如TNF-α、IL-8等）的生成[14-15]，同样，我们在研究中也发现阿托伐他汀降低了NCI-H460细胞中炎症因子TNF-α的mRNA表达，对IL-1β的mRNA表达也有抑制作用但差异没有统计学意义（与对照组比较P>0.05，图4），阿司匹林未发现有相同的作用，但二者联合显著降低了IL-1β的mRNA水平，与对照组比较下降近50%。此结果提示阿司匹林和阿托伐他汀联合应用可能对某些促炎因子（如IL-1β）的影响有协同作用。
综上所述，阿司匹林联合阿托伐他汀可以协同抑制非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖，其机制为共同作用于mTOR和NFκB信号靶点并且影响该靶点信号转导下游调控基因的表达，如抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-2以及炎症因子TNF-α和IL-1β（图5），但这种协同作用是如何通过作用mTOR和NFκB并调控其下游目的基因来实现的，以及是否还通过作用于新的信号靶点或者其他信号通路（图5路线③）发挥协同抑制作用有待于进一步研究求证。
图 5 阿司匹林联合阿托伐他汀抑制NSCLC分子机制
Study on the synergistic effects of aspirin and atorvastatin on cell proliferation of non-small cell lung cancer cells
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摘要:
目的 研究阿司匹林联合阿托伐他汀对非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H460细胞增殖的影响及其作用机制。 方法 采用MTS法检测阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞抗增殖活性，细胞划痕实验检测A549和NCI-H460细胞的迁移和侵袭活性，Western blotting法检测NCI-H460细胞中mTOR和NFκB信号通路相关蛋白的表达，采用实时定量PCR检测NCI-H460细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA的表达。 结果 阿司匹林、阿托伐他汀单用（浓度分别≥100、5 μmol/L）以及二者联用均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖和侵袭，且二者联用抑制作用大于单用。阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合均可以抑制NCI-H460细胞中p-NFκB、p-mTOR以及抗凋亡因子Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达，且与单药相比，二者联合抑制作用增强。阿托伐他汀可以降低NCI-H460细胞TNF-α mRNA的表达，联合阿司匹林可以显著降低IL-1β mRNA的表达（与对照组比较下降了近50%，P<0.05）。 结论 阿司匹林联合阿托伐他汀可以协同抑制非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H460的细胞增殖，其作用机制是协同抑制了mTOR和NFκB信号通路。 -
关键词:
- 阿司匹林 /
- 阿托伐他汀 /
- 协同作用 /
- 非小细胞肺癌 /
- mTOR和NFκB信号通路
Abstract:Objective To study the synergistic effects of aspirin and atorvastatin on cell proliferation of non-small cell lung cancer cell A549 and NCI-H460 and the mechanism of these actions. Methods The proliferation of A549 and NCI-H460 cells treated by aspirin or/and atorvastatin were determined by MTS assay. The migration of A549 and NCI-H460 cells were conducted by wound-healing assay. The expression of relevant protein in mTOR and NFκB signaling pathway were detected by western blotting. The mRNA expression of TNF-α and IL-1β were detected by quantitative real-time PCR. Results Aspirin or/and atorvastatin inhibited the proliferation and migration of A549 and NCI-H460 at concentration of 100 and 5 μmol/L or greater. The effect was enhanced by the combination of aspirin and atorvastatin. Aspirin or/and atorvastatin inhibited the protein expression of the phosphorylation of mTOR and NFκB, and down-regulated anti-apoptotic regulators Bcl-2 and Mcl-1 in NCI-H460 cells. The combination treatment of aspirin and atorvastatin was more efficacious than the single treatment. Atorvastatin decreased the mRNA expression of TNF-α. The combination of atorvastatin with aspirin decreased the mRNA expression of IL-1β by nearly 50 percent compared to the control (P<0.05). Conclusion Aspirin and atorvastatin have synergistic inhibitory effects on cell growth of non-small cell lung cancer cell A549 and NCI-H460 by suppressing mTOR and NFκB signaling pathway. -
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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图 1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响
A.A549细胞；B.NCI-H460细胞*P<0.05，与阿司匹林或阿托伐他汀单独组比较。
表 1 qRT-PCR引物序列
引物名称 引物序列（5’-3’） TNF-α 上游：ACCCTCACACTCAGATCATTCTTCTC 下游：CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTC IL-1β 上游：CCAGCAGGTTATCATCATCATCC 下游：CTCGCAGCAGCACATCAA β-actin 上游：TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 下游：CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG 
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