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非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常见的组织学类型，发病率逐年增高，无论是在我国还是全球，都已成为致死率最高的癌症之一[1]。因此，对于NSCLC的防治，特别是探索新的化学预防策略显得尤为重要。目前新兴出现的以靶向和免疫疗法为手段治疗NSCLC越来越引人关注，尽管如此，对于肺癌的治疗同样也面临着研发新型抗癌药物的挑战，包括研发过程中所需巨额费用和时间，而重新使用具有潜在癌症治疗的非抗癌药物用于癌症治疗，不仅可以节省研发新药所需的人、财、物力，甚至还可能提高治疗效果。临床前研究和数据证实许多非抗癌药物具有潜在的预防和治疗癌症的作用，譬如对NSCLC的预防和治疗，这些药物就有阿司匹林、他汀类药物等[2]。
阿司匹林和阿托伐他汀是广泛用于心血管疾病的一线防治用药。近年来，它们已经被证实可能成为新兴的、可用于不同类型肿瘤（包括NSCLC）的化学预防药物[3-5]。尽管它们抗NSCLC的确切分子机制尚需要进一步研究，但文献报道其抗肿瘤作用机制存在重叠，即均可靶向作用于mTOR和NFκB通路。据此我们假设：阿司匹林和阿托伐他汀联合使用可通过共同抑制mTOR和NFκB通路而发挥协同抗NSCLC效应。为验证假设，本实验选取了非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，在体外研究阿司匹林联合阿托伐他汀对它们细胞增殖的影响及其相关作用机制，期望在应用阿司匹林和阿托伐他汀防治心血管疾病的同时可以降低NSCLC的患病风险，以及为设计新型控制NSCLC的干预策略提供理论依据。
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人非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞（美国Manassas公司），培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（美国Sigma-Aldrich公司），置37 ℃饱和湿度、5% CO2培养箱孵育。阿司匹林和阿托伐他汀标准品化合物（美国Sigma-Aldrich公司），用DMSO溶解后−20 ℃保存。RNA提取试剂盒购自上海博彩生物科技公司，BCA法蛋白定量试剂盒和TNF-α和IL-1β反转录试剂盒购自美国Thermo scientific公司，SYBR qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。mTOR、p-mTOR、NFκB、p-NFκB、Bcl-2、Mcl-1、β-Actin抗体以及鼠、兔二抗购自美国CellSignal公司。其他试剂以及仪器设备由本实验室提供。
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分别取对数生长期非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，用胰酶-EDTA消化并计数，将100 μl的细胞混悬液接种于96孔培养板使每孔的细胞数约为5×103个/100 μl。待24 h后细胞贴壁，加入阿司匹林或/和阿托伐他汀（先用DMSO溶解再用DMEM培养液稀释成不同浓度）。使与细胞作用的阿司匹林浓度分别为0、5、50、100、150、200 μmol/L，阿托伐他汀浓度分别为0、1、2、5、10、20 μmol/L。每个浓度设3个复孔，对照组加入DMEM培养液。置于37 ℃、5% CO2培养箱72 h后，加入10 μl MTS溶液（临用前用PBS溶解，pH7.4,质量浓度为5 g/L），再置培养箱继续培养1 h，于酶标仪490 nm处检测吸光度值（A值）。
细胞增殖存活率（%）=（实验孔A值/对照孔A值）×100。
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分别将A549和NCI-H460细胞悬液接种于两个6孔培养板中，保证每孔细胞数约为1×105个/孔，次日待细胞贴壁铺满后进行划痕，PBS清洗一遍后更换无血清培养液。根据MTS实验结果选取了浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组进行实验，24 h后观察划痕距离变化并在显微镜下拍照，与给药前进行比较。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中，同样设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组，并给予对应浓度的药物处理细胞，对照组不作处理。继续培养72 h后收集细胞，PBS洗细胞3次，加入细胞裂解液（含20 mmol/L Tris-Hcl/pH 7.5、1% Triton、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、2.5 mmol/L 无水焦硫酸钠、1 mmol/L β-甘油磷酸盐、1 µg/ml亮肽素和1 mmol/LPMSF），用细胞刮刀将细胞刮下，4 ℃冰浴中超声破碎细胞，待细胞膜破碎反复涡旋后，于4 ℃、12 000 r/min离心，取上清，BCA法蛋白定量后样品经SDS-PAGE分离，蛋白电转至PVDF膜，将PVDF膜在5%牛奶中封闭1 h，加入1∶1 000的一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加入酶标二抗室温1 h，PVDF膜经ECL化学发光底物检测蛋白。
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以1×105个/孔接种NCI-H460细胞于6孔板中，设置有浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合的3个药物处理组和1个对照组。次日待细胞贴壁换培养液给予对应浓度的药物处理细胞，对照组不作处理，继续培养72 h后收集细胞。采用RNA提取试剂盒（上海博彩）提取细胞总RNA，按照TNF-α和IL-1β反转录试剂盒说明书（美国Thermo scientific公司）操作进行反转录。得到的cDNA按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书进行实时定量PCR检测。每个PCR反应体系包括：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、cDNA模板2 μl、10 μmol/L上下引物（表1）各0.4 μl以及7.2 μl去离子水，总反应体积为20 μl，经7300 qRT-PCR系统（Applied Biosystems）检测，反应循环参数为95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s共40个循环。基因的表达用ΔΔCt法计算，以β-actin作为内参。
表 1 qRT-PCR引物序列
引物名称 引物序列（5’-3’） TNF-α 上游：ACCCTCACACTCAGATCATTCTTCTC 下游：CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTC IL-1β 上游：CCAGCAGGTTATCATCATCATCC 下游：CTCGCAGCAGCACATCAA β-actin 上游：TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 下游：CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG -
使用SPSS 16.0软件进行数据处理，所有数据以（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，采用t检验进行两组间差异比较，P<0.05为显著差异。 -
我们选取了浓度分别为0、5、50、100、150、200 μmol/L的阿司匹林和0、1、2、5、10、20 μmol/L的阿托伐他汀处理A549和NCI-H460细胞，72 h后采用MTS法测定两种细胞的增殖活性，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制曲线（图1）。结果显示：阿司匹林和阿托伐他汀单用（浓度分别≥100和5 μmol/L）或二者联用均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖，且二者联用抑制作用大于单用。例如，100 μmol/L阿司匹林和5 μmol/L阿托伐他汀，以及二者联用处理A549细胞，72 h后存活率（与对照孔比较）分别为(69.64±5.95)%、(59.31±5.66)%和(39.51±13.22)%，联合与单用比较，差异有统计学意义（P<0.05）。同样相同浓度的阿司匹林和阿托伐他汀以及二者联用处理NCI-H460细胞，72 h后与存活率（与对照孔比较）分别为(76.73±11.30)%、(59.13±6.61)%和(36.82±8.15)%，且联合与单用比较，差异亦有统计学意义（P<0.05）。
图 1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响
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根据MTS实验结果，选取了浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组进行实验，24 h后观察划痕距离变化并在显微镜下拍照（图2）。结果显示：与给药前比较，阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合均较明显抑制了两种细胞的迁移与侵袭，且二者联合的抑制作用显著增强。
图 2 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞迁移与侵袭的影响
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选取浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组处理NCI-H460细胞，72 h后收集细胞。细胞裂解提取蛋白并采用BCA法测定总蛋白，采用Western blotting法检测相关蛋白的表达，结果如图3。
图 3 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对NCI-H460细胞信号调控因子蛋白表达的影响
结果显示：100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合均可以抑制p-NFκB、p-mTOR以及抗凋亡因子Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达，且与单药相比，二者联合抑制效应增强，表明阿司匹林和阿托伐他汀联合可以产生协同抑制作用。但与对照组比较，给药组对总NFκB和总mTOR的蛋白表达均无明显影响。
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同样，选取浓度为100 μmol/L阿司匹林、5 μmol/L阿托伐他汀以及二者联合作为处理药物，共设3个给药组和1个对照组处理NCI-H460细胞，72 h后收集细胞。提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作对TNF-α和IL-1β进行实时定量PCR检测，结果如图4。
图 4 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对NCI-H460细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响
结果显示：与对照组比较，阿司匹林组、阿托伐他汀组以及二者联合处理组NCI-H460细胞中TNF-α表达量分别是对照组的（1.13±0.25）、（0.89±0.06）和（0.79±0.23）倍，IL-1β表达量分别是对照组的（0.94±0.20）、（0.81±0.36）和（0.52±0.24）倍。其中，阿托伐他汀组TNF-α和联合处理组IL-1β的表达，与对照组比较差异存在统计学意义（P<0.05），尤其是联合处理组IL-1β的表达差异最为明显，与对照组比较下降了近50%。
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流行病学数据显示，服用阿司匹林或者阿托伐他汀的人群出现了肺癌患病率降低或者肿瘤发生发展的延缓。譬如，Van Dyke等[6]发现成人加强剂量的阿司匹林可以降低55～64岁妇女罹患NSCLC的概率；Jiang等[7]报道，标准剂量阿司匹林（>325 mg）服用5年以上降低了肺癌事件的发生。Lin等[8]在采用倾向评分法对5 118名65岁以上的Ⅳ期NSCLC患者的临床研究发现，服用了阿托伐他汀平均生存时间提高了3个月，并且得出结论阿托伐他汀提高了Ⅳ期NSCLC患者的存活率。这些报道均提示阿司匹林和阿托伐他汀对肺癌具有直接的抑制效应，然而两药联合使用时是否可以表现出协同抗癌活性，目前报道较少，He等[9]研究显示阿司匹林和阿托伐他汀对前列腺癌细胞的增殖有联合抑制作用，但对肺癌细胞的作用未见报道。据此，我们选取了非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞，在体外研究阿司匹林联合阿托伐他汀对它们的抑制效应及其相关作用机制。
首先，我们采用MTS法检测了阿司匹林和阿托伐他汀单用及联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响，结果显示（图1）：当阿司匹林和阿托伐他汀的浓度分别大于100和5 μmol/L时均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖，且二者联用抑制作用明显大于各自单用。他汀类药物在体内外可以抑制癌细胞（包括NSCLC）的增殖已有文献报道[10-12]，该结果与之相符。但阿司匹林在体外抑制NSCLC细胞的增殖，以及联合阿托伐他汀发挥协同抑制作用，文献未见报道。所以，本实验结果提示阿司匹林联合阿托伐他汀可以发挥协同抑制NSCLC细胞增殖效应。其次，我们在细胞划痕实验中观察到100 μmol/L阿司匹林和5 μmol/L阿托伐他汀均能抑制A549和NCI-H460细胞的迁移与侵袭，且二者联合抑制作用显著增强（图2），该结果也进一步说明阿司匹林联合阿托伐他汀发挥协同抑制NSCLC细胞效应。
阿司匹林和他汀类药物在临床上广泛应用于预防和治疗心血管疾病，但近年来由于其抗炎作用、抗肿瘤活性的研究发现，且其分子机制研究已经比较成熟，已经无可争议的成为癌症预防的候选药物。通过文献综述我们发现，阿司匹林和他汀类药物发挥抗肿瘤的分子机制有重叠，即均可以直接或间接作用于mTOR和NFκB信号靶点[4,13]，影响它们通路下游一些基因和蛋白的表达，进而发挥抑制癌细胞增殖、诱导凋亡、抗血管生成以及转移等一系列抗肿瘤活性。本研究我们在NCI-H460细胞中验证了阿司匹林和阿托伐他汀靶向作用于mTOR和NFκB信号靶点，抑制它们的磷酸化过程（即抑制活化），且能够抑制它们信号转导下游抗凋亡基因Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达。同时还发现当阿司匹林和阿托伐他汀联合应用时，对这些信号通路中这些蛋白的表达下调作用更加明显，提示二者联合发挥了协同作用（图3）。另外，文献报道他汀类药物可以通过作用炎症调控因子NFκB影响细胞内一些重要炎症因子（如TNF-α、IL-8等）的生成[14-15]，同样，我们在研究中也发现阿托伐他汀降低了NCI-H460细胞中炎症因子TNF-α的mRNA表达，对IL-1β的mRNA表达也有抑制作用但差异没有统计学意义（与对照组比较P>0.05，图4），阿司匹林未发现有相同的作用，但二者联合显著降低了IL-1β的mRNA水平，与对照组比较下降近50%。此结果提示阿司匹林和阿托伐他汀联合应用可能对某些促炎因子（如IL-1β）的影响有协同作用。
综上所述，阿司匹林联合阿托伐他汀可以协同抑制非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖，其机制为共同作用于mTOR和NFκB信号靶点并且影响该靶点信号转导下游调控基因的表达，如抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-2以及炎症因子TNF-α和IL-1β（图5），但这种协同作用是如何通过作用mTOR和NFκB并调控其下游目的基因来实现的，以及是否还通过作用于新的信号靶点或者其他信号通路（图5路线③）发挥协同抑制作用有待于进一步研究求证。
图 5 阿司匹林联合阿托伐他汀抑制NSCLC分子机制
Study on the synergistic effects of aspirin and atorvastatin on cell proliferation of non-small cell lung cancer cells
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摘要:
目的 研究阿司匹林联合阿托伐他汀对非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H460细胞增殖的影响及其作用机制。 方法 采用MTS法检测阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞抗增殖活性，细胞划痕实验检测A549和NCI-H460细胞的迁移和侵袭活性，Western blotting法检测NCI-H460细胞中mTOR和NFκB信号通路相关蛋白的表达，采用实时定量PCR检测NCI-H460细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA的表达。 结果 阿司匹林、阿托伐他汀单用（浓度分别≥100、5 μmol/L）以及二者联用均能明显抑制A549和NCI-H460细胞增殖和侵袭，且二者联用抑制作用大于单用。阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合均可以抑制NCI-H460细胞中p-NFκB、p-mTOR以及抗凋亡因子Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达，且与单药相比，二者联合抑制作用增强。阿托伐他汀可以降低NCI-H460细胞TNF-α mRNA的表达，联合阿司匹林可以显著降低IL-1β mRNA的表达（与对照组比较下降了近50%，P<0.05）。 结论 阿司匹林联合阿托伐他汀可以协同抑制非小细胞肺癌细胞A549和NCI-H460的细胞增殖，其作用机制是协同抑制了mTOR和NFκB信号通路。 -
关键词:
- 阿司匹林 /
- 阿托伐他汀 /
- 协同作用 /
- 非小细胞肺癌 /
- mTOR和NFκB信号通路
Abstract:Objective To study the synergistic effects of aspirin and atorvastatin on cell proliferation of non-small cell lung cancer cell A549 and NCI-H460 and the mechanism of these actions. Methods The proliferation of A549 and NCI-H460 cells treated by aspirin or/and atorvastatin were determined by MTS assay. The migration of A549 and NCI-H460 cells were conducted by wound-healing assay. The expression of relevant protein in mTOR and NFκB signaling pathway were detected by western blotting. The mRNA expression of TNF-α and IL-1β were detected by quantitative real-time PCR. Results Aspirin or/and atorvastatin inhibited the proliferation and migration of A549 and NCI-H460 at concentration of 100 and 5 μmol/L or greater. The effect was enhanced by the combination of aspirin and atorvastatin. Aspirin or/and atorvastatin inhibited the protein expression of the phosphorylation of mTOR and NFκB, and down-regulated anti-apoptotic regulators Bcl-2 and Mcl-1 in NCI-H460 cells. The combination treatment of aspirin and atorvastatin was more efficacious than the single treatment. Atorvastatin decreased the mRNA expression of TNF-α. The combination of atorvastatin with aspirin decreased the mRNA expression of IL-1β by nearly 50 percent compared to the control (P<0.05). Conclusion Aspirin and atorvastatin have synergistic inhibitory effects on cell growth of non-small cell lung cancer cell A549 and NCI-H460 by suppressing mTOR and NFκB signaling pathway. -
近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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图 1 阿司匹林、阿托伐他汀以及二者联合对A549和NCI-H460细胞增殖的影响
A.A549细胞；B.NCI-H460细胞*P<0.05，与阿司匹林或阿托伐他汀单独组比较。
表 1 qRT-PCR引物序列
引物名称 引物序列（5’-3’） TNF-α 上游：ACCCTCACACTCAGATCATTCTTCTC 下游：CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTC IL-1β 上游：CCAGCAGGTTATCATCATCATCC 下游：CTCGCAGCAGCACATCAA β-actin 上游：TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA 下游：CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG 
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