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番红花（Crocus sativus L.）因其柱头的药用与商业价值被称为"红色金子"，其药理活性涉及抗肿瘤、神经保护等多重机制[1]。然而，其无性繁殖导致的病毒积累、化肥依赖性生产引发的土壤退化[2]，以及高昂的种植成本制约了产业发展。根际微生物通过固氮、激素合成及养分活化等途径促进植物生长，其中植物根际促生菌（plant growth promotion rhizosphere microorganisms，PGPR）已在多种作物中展现出替代化肥的潜力，但关于其在番红花中的应用尚未系统研究。
本研究基于PGPR作用机制，通过16S rRNA鉴定番红花根际促生菌，系统评估其产吲哚-3-乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA）、溶解磷钾、合成铁载体等促生功能。结合田间试验，解析菌株接种对球茎生物量、抗氧化酶系统及土壤微生物的影响，为开发绿色种植技术提供理论支撑。研究结果可为解决番红花连作障碍、降低化肥依赖提供新策略，助力产业可持续发展。
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供试菌株来源于前期从番红花根际分离，与拟南芥共培养筛选得到的根际促生菌SR383，田间实验使用的番红花购自上海市崇明区番红花基地。
葡萄糖、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（l-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）活性测定培养基（上海源叶生物科技有限公司）；琼脂（北京康倍斯科技有限公司）；蛋白胨（杭州茉钡特生物科技有限公司）；氯化钠（天津市永大化学试剂有限公司）；酵母浸膏（杭州百思生物技术有限公司）；高氯酸、次氯酸钠（Greagent）；氯化铁、氯化钡、苯酚钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无机磷培养基、硅酸盐培养基、阿须贝氏培养基、铬天青培养基（青岛海博生物技术有限公司）；总超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性检测试剂盒、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒（杭州碧云天生物技术股份有限公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性检测试剂盒、3，5-二硝基水杨酸（北京博奥森生物技术有限公司）；氢氧化钠、氯化钡、盐酸、甲苯、过氧化氢、高锰酸钾（国药集团化学试剂有限公司）；色氨酸、三苯基四氮唑（Adamas）。
溶菌肉汤（Lysogeny broth，LB）培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，氯化钠 10.0 g，琼脂15.0 g。液体培养基配制不加入琼脂。上述培养基溶于1 L纯水中，在121℃下高压灭菌15 min。固体培养基分装至90 mm培养皿中，冷却后备用。马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，纯水1 L，自然pH。配置方法同上。Salkowski试剂：35% HClO4 50 ml，0.5 mol/L FeCl3 1 ml。
万分之一电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；细菌培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；立式恒温摇床（上海牟测仪器科技有限公司）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf）；去离子纯水机（上海和泰仪器有限公司）；pH计（梅特勒-托利多国际贸易）。
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菌株SR383的促生特性测定如下：IAA合成采用色氨酸-LB液体培养法，离心取上清加Salkowski试剂显色，540 nm比色定量[3]；赤霉素（gibberellin，GA）检测通过浓硫酸显色反应结合412 nm吸光度测定。溶磷、溶钾能力分别通过无机磷/硅酸盐培养基透明圈法观测[4]，固氮能力依据阿须贝氏培养基生长情况评估[5]。ACC活性测试参照关永贺等方法[6]，通过OD600值比较菌株在ACC为唯一氮源时的生长差异。
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采用细菌基因组DNA提取试剂盒 [天根生化科技（北京）有限公司] 提取细菌DNA[7]。采用16S rDNA的通用引物27F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和149R（5'-TAC GGC ATC CTT GTT ACG ACT T-3'）进行特异性扩增[8]。PCR反应体系为50 μl，包括2 μl模板DNA、上下游引物各2 μl、25 μl 2×Taq Mix和21 μl去离子水。PCR反应条件：95 °C 5 min，94 °C 40 s，52 °C 50 s，72 °C 1 min，35 个循环，72 °C 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶（150 V，20 min），检测合格后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。所得序列数据应用NCBI BLAST工具进行同源性分析，并使用MEGA 11软件和邻接法进行系统发育分析。
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实验在上海市海军军医大学实验农场（31°3′N，121°5′E）开展，年均温14～21℃，年均降水量1 275 mm，无霜期230～250天。试验地自2019年休耕，土壤初始pH 5.23，有机质20.16 g/kg，碱解氮208.65 mg/kg，有效磷23.57 mg/kg，有效钾868.36 mg/kg。设置SR383接种组（50个消毒球茎浸菌12 h，菌液浓度为1×108 CFU/ml）与无菌水对照组。2021年11月定植于15个地块（1 m×1.5 m，行距0.2 m，株距0.1 m，深度0.08 m），常规管理越冬。2022年3月采集根际土及植株样品：根际土过2 mm筛后4°C保存；植株分器官测定鲜重和长度，部分组织-80 °C冻存用于生理分析。子球茎于3～4月形成，同步记录生长参数。
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除去番红花球茎膜质包被并洗净，称取约 0.1 g 新鲜番红花球茎组织，加入 1 ml 磷酸缓冲液进行冰浴匀浆；8 000 r/min, 4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。按照试剂盒说明书进行MDA含量和SOD、POD、CAT活性的测定[9]。
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土壤细菌数量（Total bacterial count，TBC）和真菌数量（Total fungal count，TFC）采用稀释涂布平板法。称取相当于5.0 g干重土的新鲜土壤，加入含有45 ml无菌水和玻璃珠的三角瓶内，30℃，4 150 r/min震荡30 min。取土壤悬液10倍梯度稀释至10−6，吸取100 μl涂布相应的平板。置30℃培养箱中培养，观察计数。结果以每克干土所含菌数量（CFU/g）表示。细菌培养采用LB培养基培养，真菌培养采用PDA培养基培养。
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土壤微生物生物量碳（Microbial biomass carbon, MBC）、氮（Microbial biomass nitrogen, MBN）采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定[10]。具体流程：取25.0 g土样经氯仿熏蒸24 h（25℃），抽气去除残留氯仿。熏蒸组与未熏蒸组分别加入10 mg新鲜土壤，调节含水量至田间持水量55%，于25℃黑暗培养10 d。培养后，NaOH吸收液经盐酸滴定法测定CO2释放量，计算MBC；土样经100 ml 0.5 mol/L KCl浸提，滤液通过靛酚蓝比色法（NH4+）和代氏合金还原蒸馏法（NO3−）测定氮含量，结合熏蒸与未熏蒸组差值计算MBN。空白对照同步处理以校正背景值。
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土壤脲酶（SUE）活性采用靛酚蓝比色法活性测定[11]。土壤蔗糖酶（Soil sucrase，SSC）活性测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定[12]。土壤脱氢酶（Soil dehydrogenase，SDHA）活性采用氯化三苯基四氮唑比色法测定[13]。土壤过氧化氢酶（Soil catalase，SCAT）活性测定采用高锰酸钾滴定法[14]。土壤酸性磷酸酶（Soil acid phosphatase，SACP）[15]和土壤碱性磷酸酶（Soil alkaline phosphatase，SALP）[16]按照试剂盒说明书上的步骤进行。
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如表1所示，菌株SR383具有产生IAA和GA的能力，IAA的产率为6.18 μg/ mg，GA的产率为2.01 μg/mg。菌株SR383同时表现出固氮、溶磷、解钾和分解ACC的能力，但并未表现出产生铁载体的能力。
表 1 细菌SR383的促生长潜力
菌株 溶磷 解钾 固氮 产铁载体 ACC脱氨酶 吲哚乙酸IAA（mg/L） 赤霉素GA（mg/L） SR383 + + + - + 6.18±0.37 2.01±0.53 注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。 -
基于16S rDNA序列的BLAST比对显示，SR383与嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia McS10（KY078806）相似度达99.7%，系统发育树显示Stenotrophomonas maltophilia McS10（KY078806）形成支持率93%的进化枝。因此，将菌株 SR383 鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophili）（图1）。
图 1 基于16S rRNA序列构建的系统发育树
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与未接种处理相比（图2A B），接种根际细菌SR383促进了番红花球茎鲜重的增加，鲜重相对增幅为40.53%。另外，接种SR383分离株的叶片长度有增加，叶长相对增幅为70.57%。番红花的抗氧化活性和MDA含量如图2 C-F所示，根际细菌SR383的MDA含量显著降低，降幅达到21.00%。但菌株的CAT活性显著提高，增幅为104.85%。值得注意的是，SR383处理时CAT活性最高。分离株SR383的POD活性提高了34.15%。此外，SR383分离株的SOD活性升高幅度在66.40%。
图 2 田间条件下不同菌株对番红花各指标的影响
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如图3所示，SR383接种的番红花根际土壤的TBC显著升高，增幅为846.07%,然而TFC却显著降低了84.64%。SR383接种的番红花根际土壤的MBC同样也有着明显的升高，增幅为11.54%。SR383接种的土壤的MBN亦有增加，增幅为178.42%。
图 3 根际细菌对根际土壤MBC、MBN、TBC和TFC的影响
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如图4所示，菌株SR383显著影响了土壤酶活性。其中，其对土壤碳、氮循环相关酶的提升作用最为突出：SR383处理的SSC和SUE活性较对照组分别提高了55.62%和55.72%，表明其能有效促进土壤碳源和氮素的转化。在反映微生物活性和氧化应激的指标上，SR383对SDHA活性的提升有限（6.98%），但使SCAT活性大幅提高了115.41%，显示出其对缓解土壤过氧化胁迫的潜在作用。此外，SR383对土壤磷酸酶也有一定促进效果，使SACP和SALP活性分别提高10.72%和12.48%，有助于土壤有机磷的矿化。
图 4 根际细菌对SSC、SUE、SDHA、SCAT、SACP和SALP根际土壤活性的影响。
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PGPR是与植物协同进化的共生微生物，通过拮抗或协同作用调节土壤微环境，其促生机制包括直接作用（如养分活化、激素合成）和间接作用（如抗逆诱导、病害抑制）[17]。番红花作为三倍体不育植物，依赖球茎无性繁殖，其生长发育与土壤环境密切相关[18]。前人研究从番红花根际分离了多种PGPR（如产IAA、铁载体及溶磷菌株），并验证了其田间促生效果，但关于PGPR改善土壤条件的作用机制尚未深入解析[19-21]。
PGPR通过分泌IAA、GA等植物激素及ACC脱氨酶调控植物生长，同时通过固氮、溶磷、产铁载体等提高养分有效性[22-23]。Ambardar等分离的6株菌中，6株产IAA，3株产铁载体，2株溶磷；Kour等鉴定的17株菌均具IAA和铁载体合成能力；Magotra等获得的13株菌中，8株产IAA，12株产铁载体，6株溶磷[19-21]。本研究发现SR383菌株具有独特促生特性，表明植物与PGPR互作受生物因素（如微生物群落、发育阶段）和非生物因素（如土壤组成、气候）共同调控。
田间试验显示，SR383显著增加番红花球茎鲜重及叶片长度，与文献报道的PGPR提升生物量趋势一致[24]。环境胁迫诱导植物活性氧（ROS）积累，造成膜脂过氧化（MDA含量升高），而PGPR可通过上调抗氧化酶（POD、CAT、SOD）活性缓解氧化损伤。例如，Serratia odorifera增强干旱胁迫下抗氧化酶活性[25]，Pantoea agglomerans和Pseudomonas fragi提升盐胁迫下的CAT和POD活性[26]。本研究中，SR383处理降低MDA含量并激活抗氧化酶系统，证实PGPR通过调节氧化平衡增强植物抗逆性。
PGPR定殖效率受土著微生物竞争抑制[27]，但其仍可通过调控土壤微生物群落与酶活性改善土壤功能。本研究发现，SR383接种显著提高土壤细菌总数、微生物生物量碳/氮及酶活性水平。微生物生物量碳增加可能促进碳矿化，而土壤酶（如脲酶、磷酸酶）活性增强直接反映土壤肥力提升[14,28]，SR383可能通过“植物-微生物-土壤”协同机制实现促生效应。
综上，本研究揭示了SR383菌株通过多重促生途径（激素调控、养分活化、抗逆诱导）及土壤改良功能促进番红花生长，为其作为生物肥料替代化学投入品提供理论依据。
Isolation of Rhizobacteria from Crocus Sativus L.Rhizosphere and Their Effects on Host-Growth Promotion
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摘要:
目的 本研究旨在探索根际微生物在促进番红花生长中的应用潜力，以及它们在提高土壤质量和减少环境压力方面的作用。 方法 从番红花根际土壤中鉴定了一株根际促生细菌SR383，并研究其促生长特性。通过田间试验，评估接种SR383对番红花球茎生长的影响，并分析了其对根际土壤微生物数量、微生物生物量以及土壤酶活性的影响。 结果 菌株SR383能有效产生植物激素，并在固氮、溶磷、解钾等方面显示出潜力。田间应用SR383后，番红花球茎的鲜重和叶长均有所增加，土壤中的微生物总量及酶活性也得到提升。 结论 SR383作为一种潜在的植物生长促进剂，能显著促进番红花生长，并改善土壤质量，为其作为化肥替代品在番红花生产中的应用提供了科学依据。 Abstract:Objective To explore the potential application of rhizosphere microbes in promoting the growth of saffron crocus and their roles in improving soil quality and reducing environmental stress. Methods Rhizosphere bacteria were identified from the rhizosphere soil of Crocus Sativus L. and their growth-promoting characteristics were studied. Field trials were conducted to assess the impact of inoculating rhizosphere bacteria on the growth of C. Sativus corms, and their effects on the number of rhizosphere soil microbes, microbial biomass, and soil enzyme activity were analyzed. Results The strain SR383 effectively produced plant hormones and demonstrated potential in nitrogen fixation, phosphorus solubilization, and potassium release. The field application of SR383 led to increasement of fresh weight and leaf length of C. Sativus, as well as enhanced levels of microbial populations and enzyme activity in the soil. Conclusion As a potential plant growth promoter, SR383 can significantly stimulate the growth of saffron crocus and ameliorate soil quality, providing a scientific basis for its application as an alternative to chemical fertilizers in saffron crocus production. -
图 2 田间条件下不同菌株对番红花各指标的影响
A. 对番红花球茎鲜重的影响；B. 对番红花叶长的影响；C. 对番红花球茎MDA含量的影响；D. 对番红花球茎CAT活性的影响；E. 对番红花球茎POD活性的影响；F. 对番红花球茎SOD活性的影响注：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与对照组比较。
图 3 根际细菌对根际土壤MBC、MBN、TBC和TFC的影响
A. 对根际土壤MBC的影响；B. 对根际土壤MBN的影响；C. 对根际土壤TBC的影响；D. 对根际土壤TFC的影响注：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与对照组比较。
图 4 根际细菌对SSC、SUE、SDHA、SCAT、SACP和SALP根际土壤活性的影响。
A. 对SSC根际土壤活性的影响；B. 对SUE根际土壤活性的影响；C. 对SDHA根际土壤活性的影响；D. 对SCAT根际土壤活性的影响；E. 对SACP根际土壤活性的影响；F. 对SALP根际土壤活性的影响注：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与对照组比较。
表 1 细菌SR383的促生长潜力
菌株 溶磷 解钾 固氮 产铁载体 ACC脱氨酶 吲哚乙酸IAA（mg/L） 赤霉素GA（mg/L） SR383 + + + - + 6.18±0.37 2.01±0.53 注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。 
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图(4) / 表(1)
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