Agilent HP 1100型高效液相色谱仪（Agilent Technologies），JA3003型电子天平（上海恒平科学仪器有限公司），XS205DU型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），水浴锅（东南仪诚仪器有限公司）。

柴胡对照药材（批号：120992-201109，中国食品药品检定研究院）、远志对照药材（批号：120989-201107，中国食品药品检定研究院）、石菖蒲对照药材（批号：121098-201406，中国食品药品检定研究院）、柴胡皂苷a对照品（纯度：92.0%，批号：110777-201309，中国食品药品检定研究院），疏肝通络胶囊（批号：151210、151211和151212，由空军特色医学中心药剂科制剂室生产，规格为每粒0.25 g，每盒40粒），乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

取疏肝通络胶囊内容物2.0 g，加水30 ml，制成混悬液，用三氯甲烷50 ml萃取，取水层再用正丁醇50 ml萃取，正丁醇液减压浓缩至干，用甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材1 g，加水20 ml煎煮1 h，滤过，滤液用正丁醇40 ml萃取，正丁醇液减压浓缩至干，加甲醇1 ml溶解，作为对照药材溶液。按处方制备缺柴胡的阴性样品，按供试品溶液的制备方法操作，制备阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验^[5]，取上述三种溶液，分别点于同一块用CMC-Na为粘合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶1∶0.1）为展开剂，展开、晾干，喷洒2%香草醛浓硫酸溶液，80℃加热显色，供试品色谱中与对照药材色谱相应位置上，显相同的蓝色斑点^[6-7]，且阴性无干扰，结果见图1。

图  1  柴胡的TLC鉴别图谱

取疏肝通络胶囊内容物10.0 g，加水30 ml，制成混悬液，用乙酸乙酯50 ml萃取，弃去上层乙酸乙酯，水层加盐酸3 ml，加热回流3 h，取出放凉，用乙酸乙酯50 ml萃取，回收乙酸乙酯至干，加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取远志对照药材1 g，用70%乙醇20 ml浸泡24 h，滤过，滤液减压回收乙醇，残渣加水20 ml，盐酸2 ml，加热回流水解3 h，取出放凉，用乙酸乙酯40 ml萃取，回收乙酸乙酯至干，残渣用1 ml甲醇溶解，作为对照药材溶液。按处方制备缺远志的阴性样品，按供试品溶液的制备方法操作，制备阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国要药典2020年版四部通则0502）试验，取上述三种溶液，分别点于同一块用CMC-Na为粘合剂的硅胶GF₂₅₄板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶2∶0.5）为展开剂展开，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点^[8-9]，结果见图2。

图  2  远志的TLC鉴别图谱

取疏肝通络胶囊内容物1.0 g，加石油醚（60～90℃）20 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加石油醚（60～90℃）1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取石菖蒲对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。按处方制备缺石菖蒲的阴性样品，按供试品溶液的制备方法操作，制备阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液，分别点于同一CMC-Na为粘合剂的硅胶GF₂₅₄板上，以环己烷：乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，在供试品色谱中，与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的主斑点^[10]，结果见图3。

图  3  石菖蒲的TLC鉴别图谱

色谱柱为Venusil XBP C18（L）（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈-水（40:60，V /V），流速：1.0 ml/min，柱温：30℃，检测波长：210 nm，进样量：20 μl^[11-12]。

取柴胡皂苷a对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释制成浓度为500 μg/ml的对照品储备液。

取本品5粒内容物研磨均匀，取粉末0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 ml，密塞，超声处理30 min，滤过，用甲醇20 ml分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，定容至刻度，摇匀滤过，取续滤液，即得。

按疏肝通络胶囊处方及制剂工艺，制备缺少柴胡药材的阴性样品，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。实验结果表明，该方法专属性良好，阴性对照溶液相应位置没有吸收峰，表明其他成分对测定无干扰，结果见图4。

图  4  疏肝通络胶囊HPLC色谱图

分别精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液适量，分别配制成不同浓度（μg/ml）的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分析，计算峰面积，以柴胡皂苷a峰面积值（Y）为纵坐标，柴胡皂苷a浓度（X，μg/ml）为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，柴胡皂苷a在25.00～500.0 μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y = 305.02X+ 2 189.4，r=0.999 9。

精密吸取250 μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果显示，柴胡皂苷a峰面积的RSD值为0.32 %，说明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

取同一批号疏肝通络胶囊样品6份（批号：151211），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，滤过，取续滤液按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算含量，结果显示：柴胡皂苷a的平均含量为3.068 mg/g，RSD为2.67%，表明该方法的重复性良好。

取“2.2.3”项下方法制备的供试品溶液（批号：151211），分别于0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，结果柴胡皂苷a峰面积的RSD为1.28%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一批次已知含量的样品9份（批号：151211），分别精密加入柴胡皂苷a对照品溶液，按“2.2.3”项下方法，配制低、中、高3种不同浓度的溶液，每个浓度平行配制3份。滤过，取续滤液按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，柴胡皂苷a的平均加样回收率为97.00%，RSD值为2.60%，说明该方法回收率符合要求，结果见表1。

取疏肝通络胶囊三批（批号分别为：151210、151211和151212），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算含量，结果见表2。

皂苷类成分大多没有紫外吸收，且样品处理较复杂。而柴胡皂苷a和d仅在紫外末端有吸收，检测结果更容易受试剂干扰，故不易进行定量。目前，柴胡皂苷的测定方法主要为HPLC法，流动相多为甲醇-水，乙腈-水进行梯度洗脱。本研究参照2020年版《中国药典（一部）》柴胡项下柴胡皂苷a和d含量测定的流动相条件：乙腈-水75%→10%（0~50 min）10%（50~55 min）^[13-14]，并结合其他相关文献^[15]，最终采用“2.2.1”项下的洗脱条件。同时按照药典规定的波长，选择210 nm为测定波长。结果显示，柴胡皂苷a在210 nm处无杂质峰干扰，峰形对称，分离度良好。

参考2020版《中国药典（一部）》中柴胡的含量测定方法，本实验首选浓氨试液作为基础提取溶剂。同时，以成分个数和含量为依据，分别采用5%浓氨试液的甲醇溶液和5%浓氨试液的乙醇溶液对疏肝通络胶囊进行提取，结果表明5%浓氨试液的甲醇溶液提取成分多，峰分离度好，相对含量高。超声时间选择20、30、40 min进行考察，结果发现超声30、40 min效果优于20 min。最终，本试验选择5%浓氨试液的甲醇溶液作为提取溶剂，超声提取30 min。

在对疏肝通络胶囊中各中药进行鉴别时，笔者进行了蒺藜、菟丝子的TLC鉴别，结果显示供试品色谱与对照药材色谱相应的位置上无相同特征斑点或者斑点不明显，故未纳入标准。药典所收载成方制剂中柴胡的薄层鉴别多采用正丁醇振摇萃取，本实验将样品经三氯甲烷脱脂处理后同法进行萃取处理，能够有效减少杂质成分的干扰。柴胡、远志、石菖蒲对照药材色谱图与供试品色谱图在相同位置上显示相同颜色的斑点，后续可增加标准对照品以进一步鉴别。

疏肝通络胶囊处方中蒺藜、柴胡为君药，菟丝子为臣药，配伍石菖蒲、远志、水蛭等佐药。以柴胡为君药的复方，以抗抑郁、抗炎、抗肿瘤、治疗肝、肺病等为其主要作用^[16]，且柴胡皂苷a和d是其发挥药效的主要成分^[17-19]。，研究发现，柴胡皂苷a和d在胃酸条件和肠道菌群作用下代谢成不同的皂苷/皂苷元^[20]，其中柴胡皂苷a的原型药物在血浆、尿液、粪便等样本中均有检出，而柴胡皂苷d在胃液环境中孵育30 min即可完全转化为柴胡皂苷b₂^[21]，有关其原型药物的研究未见报道。同时，柴胡皂苷会引起不同程度的肝、神经、心脏损伤以及溶血毒性，以柴胡皂苷d的毒性最强^[22]。综合考虑药效、药动及毒性作用，本试验采用柴胡皂苷a作为含量测定项。

不论是单体提取物、复方制剂还是中药汤剂，蒺藜均被大量应用于勃起功能障碍。蒺藜总皂苷是其主要活性成分。经体内代谢研究发现，蒺藜总皂苷大多被水解代谢为极性较小的苷元类成分。基于蒺藜总皂苷复杂的体内代谢过程，本文未对其具体的单体成分进行定量分析。

本文就本院制剂疏肝通络胶囊中柴胡皂苷a的含量进行测定，方法简单快速，准确可靠，稳定性和重现性好，可行性强。同时完善了疏肝通络胶囊中主要药材的薄层色谱鉴别，为评价和控制疏肝通络胶囊的质量提供了科学依据。