下载:
下载:
-
药用植物中的次生代谢物是中药药效物质的主要来源，已知的植物次生代谢物生物合成途径有乙酸-丙二酸途径、异戊二烯途径、莽草酸途径等[1]，探究植物生物合成的调控因素不仅能提升药材的品质，也为中药有效成分体外合成的工业化提供可能。
植物昼夜节律钟是植物体内应对光照、温度等外界因素随昼夜节律性改变而进化出的一套适应机制[2]，对植物生长发育具有不可或缺的作用。大量研究表明，如黄酮类化合物合成的相关结构基因表达，也具有明显的昼夜节律性特点，受昼夜节律钟调控[3-4]。昼夜节律钟的核心部分中央振荡器是MYB蛋白LHY（late elongated hypocotyl）、CCA1（circadian clock associated 1）和伪应答调控蛋白家族（PRRs，pseudo-response regulators）组成，对维持植物昼夜节律的稳定至关重要[5-6]。
PRRs基因都带有2个保守的结构域，氨基端的响应接受结构域（receiver-like domain，RLD），其结构上与磷酸接受域相似，羧基端带有的CCT（Constans/Constans-like/TOC1）结构域，这2个结构域被一个保守程度不高的“可变域”所分隔[7-9]。目前研究发现在CO、CO-like以及TOC1基因中也有带此类结构域，对于植物开花进程有着重要作用[10-11]。
研究表明PRRs家族基因具有增加植物抗逆性，影响植物生物量的积累[12-14]，以及调控花发育及衰老等作用[15]。目前对模式植物中PRRs基因的研究较多，如在拟南芥以及水稻中的PRRs基因证明具有调控开花周期的作用[17]，但药用植物中PRRs基因的研究则罕见报道。
中药红花（Carthami flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，有活血化瘀的功效。研究表明，红花主要药效物质为黄酮类化合物，如羟基红花黄色素A(HSYA)、红花素、槲皮素、山奈酚、野黄芩苷[18]等，目前已有对红花黄酮类化合物生物合成的关键基因查尔酮合酶、查尔酮异构酶、糖基转移酶等多种研究[19-20]，但调控红花中黄酮类化合物生物合成途径的基因未完全明确。验证昼夜节律钟调控红花中黄酮类化合物的生物合成对提升红花品质意义重大。
本研究依据前期红花转录组数据库基因注释筛选昼夜节律相关基因，并与红花黄酮类化合物的积累量进行相关分析，得到具有调控红花黄酮类化合物生物合成功能的昼夜节律基因，通过qPCR、液质联用(UHPLC-MS)等方法以期阐释PRRs基因的特征与功能，为进一步研究昼夜节律钟调控红花黄酮类化合物的生物合成积累资料。
-
植物材料：云南巍山红花品系（编号ZHH0119），种植于海军军医大学药学院温室，温室条件：恒温25 ℃，昼夜节律为16 h光照/8 h黑暗。仪器与试剂：荧光qPCR仪：ABI7500；Phanta Max Master Mix高保真酶，Trans Top green qPCR super mix，Trans one-step cDNA synthesis super mix逆转录试剂盒(北京全式金公司)；Meitler Toledo电子天平（十万分之一量程）；高效液相色谱仪：Agilent1290 Infinty LC system; 质谱仪：Agilent 6538 Accurate Mass。
-
取用新鲜红花的花冠，根、茎、叶约100 mg研磨成粉。依据Plant Zol说明书提取总RNA，并用紫外分光光度计测定总RNA浓度与质量，样品的A260/A280在1.9～2.1之内可认为符合后续实验要求。将其作为模板逆转录合成cDNA第一链，−20 ℃保存备用。
-
基于红花转录组数据库，结合基因注释筛选出昼夜节律相关基因，通过红花花冠表达谱获取表达量，与红花代谢组数据库中不同花期黄酮类化合物的积累量进行Pearson分析，获取与黄酮类化合物积累量相关系数r≥0.7的昼夜节律基因进行生物信息学分析，设计引物（表1）进行克隆。PCR产物进行凝胶电泳，回收含有目的条带的凝胶，连接载体后转化大肠杆菌感受态细胞，LBA平板培养，挑取阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司测序。
表 1 全长克隆引物
引物名称 引物序列 PRR1-F ACCTCAAGGGCCACTGGTTC PRR1-R GTAACAAAAGACTTTCTGAA -
在NCBI网站用BLAST在线分析红花PRR1全长序列以及编码蛋白的氨基酸序列进行比对以及同源性分析；在ExPASy在线工具SOMPA得出所编码蛋白的二级结构特征；通过Swiss-Model同源建模预测蛋白三级结构；在ClustalX 2.1软件对其编码蛋白的氨基酸序列与同源蛋白的氨基酸序列进行多重比对分析；使用相邻节点算法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，自展分析法（Bootstrap analysis）进行1 000次重复验证进化树可靠性。
-
以红花根、茎、叶、花4个部位；花冠开花前3 d（Ⅰ期）、开花1 d（Ⅱ期）、开花3 d（Ⅲ期）、开花5 d（Ⅳ期）4个时期[12]以及1 d中8个时间点（6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00、0:00、3:00）的花冠第一链cDNA为模板，设计RT-qPCR引物，以Ct60s（KJ634810）作为内参基因，进行qPCR实验，每个样品设3个复孔。
-
取红花Ⅲ期单日内4个时间点（9:00、12:00、15:00、21:00）的花冠烘干至恒重，精密称取5.00 mg置1.5 ml离心管，再加入精密量取的1 ml 60%甲醇，室温放置12 h后超声处理40 min，12 000 r/min，10 min离心取上清液，UHPLC-MS在正、负离子模式下进行检测（表2），参比离子：正离子模式为121.050 9，922.009 8；负离子模式为119.036 3，966.000 7，数据采集与分析使用Agilent MassHunter Analysis4.0软件。以柚皮素、芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、红花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黄芩素为对照品。
表 2 UHPLC-MS分析方法
色谱条件 质谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX C18（3.5 μm，2.1 mm ×100 mm） 毛细管电压：3.5 kV 流动相：A:0.1%甲酸-水,B:乙腈 锥孔电压：60 V 流速：0.4 ml/min 离子源温度：350 ℃ 柱温：40 ℃ 碎裂电压：120 V 进样量：0.4 ml 采集范围：50～1 100 m/z 梯度洗脱：0 min,5%B; 4 min,20%B；
6 min, 21% B; 9 min, 26% B; 11 min, 40% B; 15 min, 80% B; 17 min, 95% B -
使用STRING数据库对CtPRR1基因进行蛋白互作网络分析，可信区间设置为0.4。利用Python下的networkX将互作基因进行可视化。
-
将红花cDNA均一化处理得到红花酵母双杂cDNA文库，与载体PGADT7进行同源克隆，产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布LBA平板，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行菌液PCR验证
-
根据PRR1 ORF设计同源引物引入BamHI、XhoI酶切位点。PCR产物经电泳后回收，连接酶切载体pGBKT7转入大肠杆菌，测序验证后完成pGBKT7-PRR1 bait载体的构建。
将pGBKT7-PRR1bait质粒通过PEG/LiAc法转化酵母感受态细胞，涂布SD平板，28 ℃培养，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定。将阳性单克隆酵母菌液划线涂布含有X-α-gal和Aba的平板。
-
将酵母感受态细胞、载体DNA、红花酵母双杂cDNA文库质粒按共转法混合处理后均匀涂布于SD/-His/-Trp/-Ura三缺平板培养，挑取单克隆转移至含有X-α-gal的SD/-His/-Trp/-Ura培养基，扩增阳性质粒用于测序以及酵母双杂验证。
-
实验结果经SPSS19.0软件处理，计量资料统一表示为（
${{\bar x}} \pm {{s}}$ ），组间比较采用ANOVA分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。 -
基于红花花冠转录组数据库的基因注释，检索出PRR1、PRR2、ELF3、FT、PHYB、GI、ZTL7个昼夜节律基因，将其在花冠不同时期的表达量与红花代谢组数据库中柚皮素、HYSA、苯丙氨酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素、槲皮苷、野黄芩素、槲皮素-3-葡萄糖苷7个化合物含量进行PEARSON相关性分析，如图1所示，PRR1与红花中主要黄酮类成分的积累量具有良好的相关性（r≥0.7）。
图 1 红花昼夜节律基因与黄酮类物质相关性热图
-
在红花全长转录组数据库中得到的PRR1基因全长序列3 201 bp，ORF FINDER结果显示开放阅读框1 549～2 814 bp，编码421个氨基酸，命名为CtPRR1（GenBank登录号：MW492035），将全长序列进行BLAST，系统发育进化树分析如图2A，CtPRR1氨基酸序列与水稻（Oryza sativa L.）OsPRR73氨基酸序列（A2XFB7.2）同源性最高。Prot-param分析PRR1基因所编码的蛋白质分子式C1900H3039N611O653S15，分子量为45 300，理论pI=8.52，对PRR蛋白质三维结构预测如图2B，Prot Scale分析表明预测PRR1蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白；蛋白跨膜性分析预测PRR不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。
图 2 CtPRR1生物信息学分析
-
qPCR结果表明（图3A）在红花不同部位中，CtPRR1基因在花中的表达量最高，且与根、茎、叶都有显著性差异(P<0.05)，对红花花冠Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的CtPRR1基因的表达情况进行分析，CtPRR1在Ⅰ期花冠中表达含量最低；Ⅱ期表达水平略有上升，与Ⅰ期无显著性差异；Ⅲ期花冠中表达量明显上升，相比Ⅰ，Ⅱ期具有显著性差异，Ⅳ期花冠中的CtPRR1基因表达水平略微下降（图3B），表明CtPRR1基因在Ⅲ期花冠中转录水平最高，CtPRR1在不同时间表达量的变化与红花黄酮类化合物积累量的变化相符[22]。对红花8个时间点的花冠CtPRR1表达量分析发现CtPRR1表达量在日间6:00至18:00逐渐升高，18:00达峰值，晚间21:00至2:00逐渐下降，3:00最低，表达水平在白天与夜晚两个连续的时间周期内呈现昼夜节律性(图3C)。
图 3 CtPRR1不同部位及不同时间的相对表达量
-
UHPLC-MS检测黄酮类化合物在单日内不同时间的含量变化（图4），除柚皮素外的7个化合物在白天含量逐渐降低，而在晚间含量又升至较高的水平，柚皮素则相反在白天升高，晚间下降，但8个化合物含量变化也呈现昼夜节律性，与同时间点CtPRR1的表达量进行PEARSON分析得到红花素（r＝−0.9485）、山奈酚（r＝−0.9423）、野黄芩苷（r＝−0.9504）、HSYA（r＝−0.8372）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（r＝−0.8792）、柚皮素（r＝0.7415）、芹菜素（r＝−0.6652）、槲皮素（r＝−0.4876），目前研究认为柚皮素在红花黄酮类化合物生物合成途径的上游[20]，而CtPRR1与柚皮素呈正相关，与其他化合物呈负相关，说明CtPRR1对整体黄酮类化合物生物合成具有负调控作用而导致柚皮素的积累量增多，进一步说明CtPRR1参与调控红花黄酮类化合物的合成。
图 4 单日内不同时间红花花冠黄酮类物质含量
-
STRING数据库预测红花转录组数据库中CtPRR1的互作蛋白，获得互作蛋白TOC1、PIF3、COP1、ZTL、LHY、ELF4、ELF3、CCA1、GI、PRR5、GRP7、TIC、FKF1、RVE114个，互作关系网络如图5。与PRRs基因共同参与调控植物生长发育，调控植物次生代谢途径。由此获得了较为完善的红花昼夜节律核心元件系统，为进一步探索昼夜节律调控红花次生代谢的分子机制提供了依据。
图 5 CtPRR1互作蛋白网络预测
通过酵母双杂实验发现，转入pGBKT7-PRR bait质粒的酵母细胞在28 ℃生长4 d后情况正常。带有pGBKT7-PRR bait载体的酵母细胞与构建的红花cDNA文库质粒共转后，28 ℃培养2 d后可以观察到蓝色菌斑出现，4 d后出现直径约2 mm的蓝色单克隆菌斑（图6），菌液PCR鉴定为阳性克隆。结果如表3所示，有2个热休克蛋白，3个AP2转录因子，热休克蛋白具有增强植物抗逆性的功能，AP2转录因子广泛参与植物生长发育，调控体内次生代谢。
图 6 酵母双杂结果
表 3 酵母双杂筛选互作蛋白
序号 蛋白家族名称 预测功能 1 热休克蛋白 广泛参与植物响应外界环境胁迫，生物合成以及生长发育相关的转录调控 2 热休克蛋白 3 AP2转录因子 4 AP2转录因子 5 AP2转录因子 -
红花作为常用的活血化瘀中药，对其主要药效物质黄酮类化合物的生物合成途径及调控机制的研究越来越多[20]，但目前红花黄酮类化合物生物合成途径及调控机制仍未阐明。
本研究首次克隆了一个PRRs家族基因CtPRR1，生物信息学分析表明其与水稻、拟南芥等其他物种中的PRRs家族基因序列高度相关，说明红花中的PRRs基因具有高度保守性。CtPRR1基因主要在花中表达且开花后第3天时表达量最高，与红花不同花期黄酮类化合物的累积规律一致，存在显著相关。我们认为，CtPRR1调控了红花黄酮类化合物的生物合成。进一步的研究发现，CtPRR1的单日表达量在日间逐渐升高，晚间逐渐下降；随着CtPRR1在单日表达量的升高，芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、红花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黄芩素积累量为白天逐渐降低，晚间逐渐升高。CtPRR1对红花这些黄酮类成分的昼夜节律性积累积起负调节作用；唯CtPRR1与柚皮素的积累量呈正相关，可能与柚皮素处于黄酮生物合成途径的较上游以及参与其他代谢过程并受到其他调控基因的影响有关。
PRRs与CCA1、LHY基因作为昼夜节律系统中的核心元件，对多种植物的昼夜节律钟输出途径中与黄酮合成结构酶基因具有相互作用[22-23]，本研究发现红花CtPRR1可能受2个热休克蛋白，3个AP2转录因子的影响对黄酮化合物的积累起负调节作用，丰富了昼夜节律基因调控黄酮类化合物机制的研究资料。
本研究结果为深入研究红花昼夜节律基因对黄酮生物合成途径的调控机制提供了资料。下一步的工作，我们将采用基因过表达以及基因敲除技术结合代谢物分析，进一步验证CtPRR1调控红花黄酮类化合物生物合成的功能及调控网络，为阐明CtPRR1的功能提供重要依据。
Characterization and function study of circadian rhythm gene CtPRR1 in Carthamus tinctorius L.
-
摘要:
目的 探究昼夜节律基因对红花黄酮类物质生物合成的影响及机制。 方法 基于红花花冠转录组及代谢组数据库筛选潜在调控红花黄酮类化合物生物合成的昼夜节律基因；用qPCR测定红花各部位以及花冠单日不同时间点昼夜节律基因的表达量，液质联用测定黄酮类化合物的积累量，并分析二者的相关性；酵母双杂交实验验证昼夜节律基因的互作蛋白。 结果 获得7个昼夜节律基因PRR1、PRR2、ELF3、FT、PHYB、GI、ZTL，其中PRR1基因与黄酮类化合物积累量呈正相关（r≥0.7）。PRR1全长3 201 bp，编码421个氨基酸，与水稻OsPRR73基因高度同源，将其命名为CtPRR1（GenBank登录号：MW492035）。CtPRR1主要在花中表达，表达量在日间逐渐升高，晚间逐渐下降；黄酮类化合物芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、Carthamin、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黄芩素的含量为白天逐渐降低，晚间逐渐升高，二者都有昼夜节律性且呈负相关（r≥−0.7）。酵母双杂实验得到2个热休克蛋白、3个AP2转录因子。 结论 CtPRR1对红花黄酮类成分的昼夜节律性积累起负调节作用；CtPRR1可能受这些互作蛋白的影响调控红花黄酮类成分的昼夜节律性积累。 Abstract:Objective To explore the effect of circadian rhythm genes on flavonoids biosynthesis in safflower and its molecular mechanism. Methods Based on the transcriptome and metabolomic database of safflower corolla, we screened the circadian rhythm genes that correlate with biosynthesis of flavonoids in safflower. qPCR was used to quantify the expressions of circadian rhythm genes in different flowering stages at different time points in a single day. LC-MS was performed to determine the accumulation of flavonoids. The correlation between them was analyzed as well. Yeast Two-Hybrid experiment was used to verify the interactive proteins of these genes. Results Seven circadian rhythm genes PRR1, PRR2, ELF3, FT, PHYB, GI and ZTL were obtained. PRR1 gene was positively correlated with flavonoids accumulation (r≥0.7). The full length of PRR1 is 3 201 bp, encoding 421 amino acids, which is highly homologous with rice OsPRR73 gene and named as CtPRR1 (GenBank accession number: MW492035). CtPRR1 was mainly expressed in flowers, and the expression level increased in the daytime and declined in the evening gradually. Correspondingly, the content of flavonoids showed an opposite variation. Both of them displayed a circadian rhythm with a negative correlation (r≥−0.7). In addition, 2 heat shock proteins along with 3 AP2 transcription factors interacting with CtPRR1 protein were obtained via Yeast Two-Hybrid experiment. Conclusion CtPRR1 negatively regulated the safflower flavonoids accumulation in a circadian rhythm way, which may be affected by these interacting proteins. -
Key words:
- Carthami flos /
- circadian gene /
- flavonoids /
- interaction protein
-
中药挥发性成分（VOCs）是指中药中一类具有芳香气并易挥发的成分，其化学组成复杂，主要包括挥发油类以及其他分子量较小、易挥发的化合物，例如萜类、脂肪族、芳香族化合物等。VOCs具有发汗解表、芳香开窍、镇咳祛痰、理气、驱风、抑菌、镇痛、杀虫等多种功效。作为中药学研究的热点之一，高效率、高标准的检测药材中VOCs十分关键。因此，利用现代化方法来实现对中草药挥发性成分的细致分析，意义巨大。
VOCs常用气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法进行分析，虽分离能力强，但样品需要预处理且分析时间长。气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）法结合了GC突出的分离能力和IMS快速响应、高灵敏度的特点，具有样品准备简便、高灵敏度、高分辨率等显著优势，结合化学计量学分析中药材VOCs所呈现图谱，可实现对药材VOCs无损、快速区分[1]。
1. 气相色谱–离子迁移谱联用技术原理
GC-IMS 技术的基本原理[2]是通过将样品混合物引进气相色谱仪进行分离，样品分子和载气分子在离子源放射性物质的作用下发生一系列反应形成产物离子，这些产物离子在不同的电场驱动下通过离子门进入迁移区，与逆向而来的中性迁移气体分子发生碰撞而损失能量。产物离子在电场中的迁移速率不同，到达检测器上的时间不同，从而使样品差异化分离（如图1），最后可得到一个包含有离子迁移时间（X轴），气相色谱保留时间（Y轴），离子强度（Z轴）的三维谱图（如图2）。
顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）是应用于检测药材中VOCs最为广泛的方式之一 [3]。其原理是首先将样品中的VOCs通过热孵育和振摇使之从药材中逸出，随后抽取顶空气体进行分析，避免复杂基质干扰，再使之进入气相色谱（GC）、离子迁移谱（IMS）中，得到相应谱图。HS-GC-IMS无需样品预处理，在分析复杂样品或需要快速检测场景方面更具优势。
自从1972年第一张经过GC分离的IMS谱图出现[2]，早期主要用于军事领域（如化学战剂检测）和毒品筛查的先进技术逐渐面向市场，应用于研究（如图3），引进国内后广泛使用于中药研究。现阶段，通过GC-IMS捕捉到中药材中的微量VOCs，将其应用于区分中药的不同种类和产地、监控中药炮制过程以及中药复方组分分析等[4]，为中药材的产地及真伪鉴别提供可靠的依据，同时也为质量控制和药效研究等方面提供数据支持。
2. 在中药鉴定中的应用
2.1 同属不同种的中药鉴别
同属不同种之间的中药材亲缘关系比较接近，在VOCs种类差异上不显著，利用GC-IMS技术善于捕捉挥发性化合物种类微小差异的特点，可对样品进行品种鉴别。
陈皮中主要含有三萜类、挥发油类等几百种成分，有平喘止咳、调节血管等药理作用[5-6]，刘主洁等[7]和Lv等[8]采用HS-GC-IMS对陈皮和广陈皮样品中VOCs进行研究，分析二者的特征信号，以邻氨基苯甲酸二甲酯为广陈皮最明显的特征标记物，柠檬烯、癸醛等也可作为广陈皮的特征信号，利用这些特征信号可对陈皮和广陈皮进行区分。山莓是覆盆子的混淆品之一，为保证用药安全有效，有必要对两者进行区分[9]，严爱娟等[10]采用GC-IMS技术检测山莓和覆盆子VOCs，明确鉴定出覆盆子特征成分较山莓多，其中癸醛、1-辛烯-3-醇等在覆盆子样品中的含量更高，苯甲醛、2-丁酮等在山莓样品中的含量更高，以此来实现山莓和覆盆子的区分。彭旭阳等[11]采用GC-IMS分析新疆和田地区“梭梭”和“红柳”肉苁蓉这两种不同寄主肉苁蓉挥发性物质之间的不同，找到了二者主要差异物质为苯甲醛、庚醛等。
2.2 中药不同产地鉴别
道地药材是指生长在特定的自然生态环境中，经过一系列技术培育和加工而成，且被公认为比其他地方生产的同种药材的质量和治疗效果好的药材[12]。但随着产地的迁移、品种的引入，在外观性状上对道地药材和其他产地的中药进行简单鉴别已经不能满足需求。
王振洲等[13]采用GC-IMS对来自不同产区的人参VOCs进行检测，发现2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪等VOCs在吉林集安四年生人参中含量较高，而吉林敦化四年生人参中含量相对较低，由此鉴别四年生吉林集安和敦化的人参。西洋参同属于五加科人参属，成功引种进入我国后，辽宁、吉林和山东是其主产区[14],王燕等[15]使用GC-IMS技术对美国、加拿大、山东等五个不同产地的西洋参进行研究，共鉴定出53种VOCs，其中美国西洋参中2-庚酮等成分的含量较高，而加拿大产α-蒎烯等成分的含量显著高于其它产区，中国产芳樟醇等成分的含量较高，其中吉林产地的含量是辽宁、山东产地的2.60和3.60倍，通过这些显著差异可对西洋参进行产地溯源和鉴别。
李曼祎等[16]使用GC-IMS技术对新疆、宁夏、内蒙古、青海四个主要产区的枸杞进行化学成分测定，分析出了四个地区含量差异较大的16种物质，发现内蒙古枸杞区别于另外三个产地特有的物质为正丁醇，同时筛选出了叶醇等五种标记性物质对枸杞产地进行区分。Li[17]等分别采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS检测河北、河南、江苏、浙江、安徽以及山东6个不同地区的五味子，结果显示安徽的五味子萜类物质含量较高，同时该研究也证明了HS-GC-IMS对样品的分类效果优于HS-SPME-GC-MS。山东为瓜萎的道地产区[18]，河北也是瓜萎的重要产区，不同产地的瓜萎可能在品质及所含成分上有所差别，从而对药效也会产生一定的影响[19-20]。张敏敏等[19]采用GC-IMS在瓜萎皮样品中共鉴定出醛类和醇类等88种VOCs，分析发现山东瓜蒌皮中2-庚酮、正壬醛等物质的含量低于河北瓜蒌皮，但1-己醇、糠醇等含量更高的结论，通过这些差异基本实现了两地区瓜萎皮的区分。Li等[21]采用HS-GC-IMS联合PCA建立松茸特征图谱，对分别来自云南和四川的松茸样品以及它们的菌盖和菌柄进行研究，发现虽然指纹图谱相似度较高，但各自也有其特征性挥发物：苯乙醛和糠醇等仅在云南产松茸的菌柄中被发现，戊烷仅在四川产松茸的菌柄中被发现，戊醛仅在云南产松茸的菌盖中检出，甲基吡嗪仅在四川产松茸的菌盖中检出，通过特征性挥发物的不同，可对分别产自云南和四川的松茸进行区分。
2.3 中药复方中主成分的鉴别
中药复方成分众多且复杂，确保其质量符合标准、疗效可靠、使用安全是关键，采用HPLC特征图谱进行分析是目前公认的良好方法之一[22]。GC-IMS检测灵敏度高、分离效果好，是对HPLC表征中药复方质量分析的有益补充。
Yuan等[23]设置了对照组、慢性不可预测轻度应激（CUMS）组和CUMS＋百合鸡子黄汤组，采用HS-GC-IMS等方法对百合鸡子黄汤治疗CUMS大鼠粪便中挥发性化合物含量进行研究，鉴定出了11个生物标志物，找出了对照组大鼠粪便样品中甲硫醚含量较高，而CUMS组则较低，同时百合子鸡汤组抑郁表现出保护性干预作用；Yin等[24]采用HS-GC-IMS对开心散中的挥发性化合物进行分析，鉴别出β-细辛酮等十种VOCs可作为开心散的质量标记物，进一步为开心散质量控制及药效机制等的相关研究奠定基础；李巍等[25]利用HS-GC-IMS对清感秋饮中的VOCs进行定性定量分析，共鉴定出120种VOCs，其中，紫苏属酮、β-石竹烯等可能为其主要药效成分。
3. 在中药加工炮制中的应用
中药的加工炮制是提高临床疗效的重要手段，也是保证临床用药安全的重要措施[26]。应用不同的炮制方法可能会引起中药中的化学成分发生含量加减、成分转化与破坏等变化，采用GC-IMS技术对中药加工炮制过程中的VOCs进行动态监控，对于炮制工艺的规范、制定更优炮制方案等具有指导意义。
干燥是中药材和饮片加工制备过程中的重要且关键的环节之一，而中药中的VOCs易受干燥工艺的影响,对于富含VOCs的中药，准确控制干燥工艺有利于减少有效成分的损失。陈树鹏等[27]采用GC-IMS等技术确定烘干样品的整体香气属性优于晒干样品，这可能是由于烘干工艺对环境温度的调整使得烘干过程更有利于果香、柑橘香以及甜香香气保留。其中苯乙酸乙酯、乙酸乙酯等 12 种物质为晒干主要成分，2-甲基-1-丁醇、（E）-2-己烯-1-醇等为烘干主要成分；Wang等[24]在8S-GC-IMS技术的辅助下，了解了柑橘皮干燥以及不同条件下挥发性成分情况，研究柑橘皮各成分在不同干燥温度下的缺失，其中，70 ℃下干燥会导致2,2-苯基-1-苦基肼基和铁还原抗氧化能力显著降低。Yu等[29]通过GC-MS比较总离子色谱图中的峰面积与苯乙酸乙酯的峰面积，将VOCs的含量进行半定量再通过GC-IMS呈现图谱对结果进行比较，确定VOCs的身份，从而证实晒干有利于两个品种的网纹柑橘中萜醇类化合物的保存，热风干燥有利于脂肪族醛和倍半萜的保存，而冷冻干燥是保存酯类和酚类物质的最佳方法；Zhou等[30]对肉苁蓉进行酒制增效后粉碎、超微粉碎、醇提、水提等处理，采用HS-GC-IMS方法检测其VOCs并建立指纹图谱，发现增效处理的肉苁蓉VOCs的种类和含量有所减少，分析原因可能为各种化学物质之间在处理过程中会发生化学变化，而新鲜肉苁蓉则保存了更多种类的VOCs，超微粉碎处理和水提处理后的肉苁蓉挥发性化合物主要以醛类为主。除此之外，将其它中药基于GC-IMS技术在不同炮制方法中的应用汇总于表1。
表 1 GC-IMS技术在炮制研究方面的应用作者 药材及炮制方法 采用方式 实例 高以丹等 [31] 柴达木枸杞
冷冻干燥、自然阴干、热风烘干GC-IMS 从枸杞样品中鉴定出反-2-壬烯醛、2,4-庚二烯醛等52种VOCs，表明冷冻干燥法比自然阴干、热风烘干以及微波干燥更好，能够有效保留枸杞中的VOCs，使枸杞保持较高的品质。 时海燕等 [32] 六神曲
生品、炒品、焦品HS-GC-IMS 从六神曲生品、炒品和焦品中鉴别出60种化合物通过比较种类和差异，得出炒神曲比焦神曲健胃消食的效果更好。 林秀敏等 [33] 当归
酒洗、酒炙、酒浸GC-IMS 2-十一烯醛、丙酮等为酒洗与酒浸当归的主要差异性物质，2-十一烯醛、丙酮等为酒洗与酒炙当归的主要差异性物质，2-十一烯醛、辛酸乙酯等为酒浸与酒炙当归的主要差异性物质。 武旭等 [34] 胆南星
发酵炮制GC-IMS 发酵炮制有助于胆南星矫味矫臭 王雨晨等 [35] 太子参
常温晾干、晒干、热风干燥、
真空冷冻干燥GC-IMS 40 ℃热风干燥可以有效保留太子参样品中的VOCs，与晒干、晾干样品无差异，但真空冷冻干燥对太子参挥发性成分的影响较大，会造成挥发性成分以及风味的损失 焦焕然等 [36] 侧柏叶
常温晾干、晒干，热风干燥、
变温干燥GC-IMS 40 ℃和60 ℃热风干燥能够较好地保留瓜蒌样品中的核苷类和黄酮类成分 4. 与电子鼻联用
国内外也有许多采用GC-IMS与电子鼻联用对中药挥发性成分进行研究。电子鼻是一种通过模拟人嗅觉系统对检测物质进行品质评价的感官仪器，其原理是通过传感器阵列对气味分子进行检测和响应，将产生的信号经过预处理后送入模式识别系统，通过指纹图谱对挥发性成分或是气体进行定量或定性分析[37]。两种技术的联用为实验的结果研究提供了更高的准确度。
Feng等 [38]采用GC-IMS、GC-MS对不同地理标志的八种花椒的VOCs进行测定，证明了两种方法均可用于对不同花椒的分类，但相较之下GC-IMS操作时间更短，且有能够检测到含量很低物质，结果表明红花椒比青花椒能够释放出更多的萜烯、酯类和更少的醇类，同时该研究还与电子鼻联用表征花椒中的香气物质，W1W、W2W和W5S传感器对花椒样品VOCs的响应更强，说明花椒产品中可能含有更高丰度的萜烯、有机硫化物和氮氧化物。陈小爱等 [39]利用GC-MS、GC-IMS和电子鼻技术联用，分析老香黄在发酵期间的VOCs变化，GC-MS共鉴别出包括醇类等八个种类的46种VOCs，GC-IMS则检测出包括杂环类等九个类别的38种VOCs，同时电子鼻PCA有效区分了不同发酵时间的样品，发现发酵6个月后老香黄挥发性组分开始发生较大的变化，其中柠檬烯等14种是发酵期间含量较高且相对稳定的成分，发酵过程中产生的庚醛、糠醛等是构成老香黄特有气味的特征性成分。王世丽等 [40]通过电子鼻辨识南北柴胡气味特征物质与GC-IMS检测其挥发性成分，发现南北柴胡中短链烷烃、醛类等物质差异较大，癸醛、异戊烯醛等可作为南柴胡的特征物质，2-甲基丙酸、3-甲基丁醇可作为北柴胡的特征物质，此外乙酸、乙酸甲酯等成分在北柴胡中显著高于南柴胡。
5. 总结和展望
GC-IMS在中药研究中的应用前景非常广阔，不仅可以对同属不同种、不同产地来源、不同采收期以及不同贮存时间的中药VOCs进行分析鉴别，还可以帮助分析炮制前后中药VOCs含量变化以及在复方中寻找质量标志物，为药物质量控制与药效研究提供帮助。另外，随着技术的不断进步和中药现代化需求的增加，GC-IMS可以与特征图谱相结合，构建特征指纹图谱；也可以与电子鼻等其他分析手段融合，发挥出新的效果，让其所能提供的信息更加全面。但该项技术作为新兴科技仍需解决许多问题，比如应探索融合数据库的体系架构[41]。目前，GC-IMS通常使用的数据库为NIST出版的标准质谱图，对于中药VOCs的专业数据库搭建还不全面，部分VOCs需要自行判断建立文档保存入库，对实验进程造成不便。由于中药挥发性成分复杂，GC-IMS可能因峰重叠导致部分成分无法准确定性，例如分析复方丹参片时，GC-IMS仅能明确鉴定其中60%的化合物，需GC-MS辅助验证。而且GC-IMS对象单一，无法检测多糖、生物碱等非挥发性成分，难以全面评价中药质量。
总的来说，GC-IMS技术为中药研究提供了一种新的科学工具，有利于推动中药科学研究深入，也为中药产业的发展走向国际化和标准化提供支持。
-
图 3 CtPRR1不同部位及不同时间的相对表达量
A.CtPRR1各部位相对表达量; B.CtPRR1不同花期相对表达量; C.CtPRR1红花Ⅲ期单日不同时间点相对表达量。
表 2 UHPLC-MS分析方法
色谱条件 质谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX C18（3.5 μm，2.1 mm ×100 mm） 毛细管电压：3.5 kV 流动相：A:0.1%甲酸-水,B:乙腈 锥孔电压：60 V 流速：0.4 ml/min 离子源温度：350 ℃ 柱温：40 ℃ 碎裂电压：120 V 进样量：0.4 ml 采集范围：50～1 100 m/z 梯度洗脱：0 min,5%B; 4 min,20%B；
6 min, 21% B; 9 min, 26% B; 11 min, 40% B; 15 min, 80% B; 17 min, 95% B
下载: 导出CSV
表 3 酵母双杂筛选互作蛋白
序号 蛋白家族名称 预测功能 1 热休克蛋白 广泛参与植物响应外界环境胁迫，生物合成以及生长发育相关的转录调控 2 热休克蛋白 3 AP2转录因子 4 AP2转录因子 5 AP2转录因子
下载: 导出CSV
-
[1] 王升, 蒋待泉, 康传志, 等. 药用植物次生代谢在中药材生态种植中的作用及利用[J]. 中国中药杂志, 2020, 45(9):2002-2008. [2] DUNLAP J C. Molecular bases for circadian clocks[J]. Cell,1999,96(2):271-290. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80566-8 [3] BENDIX C, MARSHALL C M, HARMON F G. Circadian clock genes universally control key agricultural traits[J]. Mol Plant,2015,8(8):1135-1152. doi: 10.1016/j.molp.2015.03.003 [4] 徐小冬, 谢启光. 植物生物钟研究的历史回顾与最新进展[J]. 自然杂志, 2013, 35(2):118-126. [5] BECKWITH E J, YANOVSKY M J. Circadian regulation of gene expression: at the crossroads of transcriptional and post-transcriptional regulatory networks[J]. Curr Opin Genet Dev,2014,27:35-42. doi: 10.1016/j.gde.2014.03.007 [6] ITO S, MATSUSHIKA A, YAMADA H, et al. Characterization of the APRR9 pseudo-response regulator belonging to the APRR1/TOC1 quintet in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Physiol,2003,44(11):1237-1245. doi: 10.1093/pcp/pcg136 [7] COCKRAM J, THIEL T, STEUERNAGEL B, et al. Genome dynamics explain the evolution of flowering time CCT domain gene families in the Poaceae[J]. PLoS One,2012,7(9):e45307. doi: 10.1371/journal.pone.0045307 [8] 陈华夏, 申国境, 王磊, 等. 4个物种CCT结构域基因家族的序列进化分析[J]. 华中农业大学学报, 2010, 29(6):669-676. [9] MATSUSHIKA A, MAKINO S, KOJIMA M, et al. Circadian waves of expression of the APRR1/TOC1 family of pseudo-response regulators in Arabidopsis thaliana: insight into the plant circadian clock[J]. Plant Cell Physiol,2000,41(9):1002-1012. doi: 10.1093/pcp/pcd043 [10] KURUP S, JONES H D, HOLDSWORTH M J. Interactions of the developmental regulator ABI3 with proteins identified from developing Arabidopsis seeds[J]. Plant J,2000,21(2):143-155. doi: 10.1046/j.1365-313x.2000.00663.x [11] LEGNAIOLI T, CUEVAS J, MAS P. TOC1 functions as a molecular switch connecting the circadian clock with plant responses to drought[J]. EMBO J,2009,28(23):3745-3757. doi: 10.1038/emboj.2009.297 [12] GRUNDY J, STOKER C, CARRÉ I A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants[J]. Front Plant Sci,2015,6:648. [13] SEO P J, MAS P. STRESSing the role of the plant circadian clock[J]. Trends Plant Sci,2015,20(4):230-237. doi: 10.1016/j.tplants.2015.01.001 [14] SALOMÉ P A, WEIGEL D, MCCLUNG C R. The role of the Arabidopsis morning loop components CCA1, LHY, PRR7, and PRR9 in temperature compensation[J]. Plant Cell,2010,22(11):3650-3661. doi: 10.1105/tpc.110.079087 [15] NAKAMICHI N, KIBA T, HENRIQUES R, et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock[J]. Plant Cell,2010,22(3):594-605. doi: 10.1105/tpc.109.072892 [16] MIZUNO T. Two-component phosphorelay signal transduction systems in plants: from hormone responses to circadian rhythms[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(12):2263-2276. doi: 10.1271/bbb.69.2263 [17] 王晗. 生物钟生物学及其研究进展[J]. 生命科学, 2015, 27(11):1313-1319. [18] 杨志福, 梅其炳, 蒋永培. 红花有效成分及药理作用[J]. 西北药学杂志, 2001, 16(3):131-133. doi: 10.3969/j.issn.1004-2407.2001.03.025 [19] 刘飞. 红花黄酮类化合物生物合成途径关键酶基因的克隆与功能验证[D]. 上海: 第二军医大学, 2014. [20] GUO D D, GAO Y, LIU F, et al. Integrating molecular characterization and metabolites profile revealed CtCHI1& apos; s significant role in Carthamus tinctorius L[J]. BMC Plant Biol,2019,19(1):1-13. doi: 10.1186/s12870-018-1600-2 [21] BROWN B A, JENKINS G I. UV-B signaling pathways with different fluence-rate response profiles are distinguished in mature Arabidopsis leaf tissue by requirement for UVR8, HY5, and HYH[J]. Plant Physiol,2008,146(2):576-588. [22] FARRÉ E M, WEISE S E. The interactions between the circadian clock and primary metabolism[J]. Curr Opin Plant Biol,2012,15(3):293-300. doi: 10.1016/j.pbi.2012.01.013 [23] 何贝轩, 郭丹丹, 贾鑫磊, 等. 昼夜节律钟调控花青素类成分的生物合成[J]. 药学学报, 2018, 53(3):345-355. -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 8198
- HTML全文浏览量: 2373
- PDF下载量: 48
- 被引次数: 0
