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冻伤是由寒冷、潮湿或大风引起的，会导致周围组织的损伤、丧失和残疾，尤其是手、脚、鼻子、脸颊和耳朵[1]。冻伤可引起微血管收缩，红细胞聚集，小动脉口径减小，硬度增大，毛细血管通透性升高，从而增加血液黏度，增大血流阻力，引起局部组织血流量减少，最终导致微循环障碍，使组织细胞由于缺血缺氧而坏死[2-3]，临床早期主要通过血管阻塞症状和软组织缺血边界来判断冻伤程度[4-5]。因此，课题组着手研发一种由肌醇烟酸酯（IN）和肝素钠组成的冻伤膏，直接涂在易冻伤的四肢上，用于预防和治疗冻伤，降低冻伤程度。该冻疮膏对早期冻伤、皲裂、湿疹及软组织损伤均有很好的治疗效果[6]。其中，IN是一种外周血管扩张剂，温和持久，能选择性扩张病变部位及冷刺激敏感部位的血管，具有溶栓抗凝、缓解血管痉挛、改善小血管循环、降低毛细血管脆性的作用[7]。此外，它还具有止痒、止痛、消肿的作用。在此处方中，肌醇烟酸酯还可缓解长期使用肝素钠引起的局部血肿血栓和皮肤过敏，有效减少全身凝血功能障碍的副作用。
分析药物在体内血药浓度随时间变化的动态过程，是传统药动学的研究方法。然而，对于经皮给药，药物入血浓度往往很低，难以定量。故本研究采用活体分时采样法，直接在大鼠皮肤上涂药，在不同时间点测定皮肤组织匀浆中的药物浓度。目前，已有研究对人或大鼠血浆中肌醇烟酸酯进行药代动力学研究[8-9]，但是，没有可用于定量分析大鼠皮肤组织匀浆样品中肌醇烟酸酯的含量。因此，本研究旨在建立一种快速、灵敏、重现性好、经济简便的HPLC法，定量分析大鼠皮肤中肌醇烟酸酯，用于大鼠经皮给药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏后肌醇烟酸酯的药动学研究。
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W501型高效液相色谱仪（Waters）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；FLUKO MODE组织匀浆器（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；XW-80A微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；离心机（ABBOTT LABORATORIES Germany）；剃须刀（上海飞科电器有限公司）；AUW120D型电子分析天平（SHIMADZU公司）。
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肌醇烟酸酯（天津中瑞药业有限公司，纯度：99.5%）；甲苯咪唑对照品（中国食品药品检定研究院；纯度：99.9%）；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（北部战区总医院药剂科自制，批号：
20150108 ）；盐酸（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Sigma公司）；四氢呋喃（色谱纯，Sigma公司）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。 -
SD清洁级雄性大鼠（体重230~250 g）：由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。
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Kromasil ODS C18 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-四氢呋喃（35∶55∶10，V/V/V）；检测波长为262 nm；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量20 μl。
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精密称取肌醇烟酸酯对照品12.5 mg（现用现配），置于10 ml量瓶中，加入适量0.5 mol/L盐酸水溶液，超声溶解，0.5 mol/L盐酸水稀释至刻度，即得浓度为1 250 μg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，置于10 ml量瓶中，分别用0.5 mol/L盐酸水稀释成系列溶液，即得到浓度为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和400.00 μg/ml的系列对照品溶液。同法配制浓度分别为10.00、50.00、300.00 μg/ml的低、中、高对照品溶液。
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精密吸取低、中、高对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到浓度为0.50、2.50和15.00 μg/ml的质控样品（QC）。
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取甲苯咪唑对照品适量，精密称定，加2%盐酸甲醇溶液超声溶解并定量稀释制成浓度为12 μg/ml的内标溶液。
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根据非临床药动学研究技术指导原则及《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则的有关要求[10-11]，对定量研究方法进行方法学验证。
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取72只健康SD大鼠，雄性，体重（230～250）g，于实验条件下饲养5 d（22±2） ℃，相对湿度（50±10）%。试验开始前1 d，用电动理发器对腹部皮肤进行脱毛（4 cm×4 cm，不要损伤皮肤），禁食不禁水。其中6只大鼠作为空白组，涂抹空白乳膏基质。其余大鼠将临床3倍用量的肝素钠肌醇烟酸酯乳膏均匀涂抹于腹部脱毛处皮肤，剂量为0.2 g/只，于给药后0.25、0.5、l、2、3、4、6、8、10、12、24 h各时间点分别取6只大鼠，给药皮肤表面用生理盐水反复擦拭，以棉签擦干，剥离剪取固定面积的皮肤，去除附着的肌肉，备用。皮肤样品的处理：精密称取皮肤样品0.07 g，加入1 ml 甲醇-0.5mol/L盐酸（50:50，V/V），组织匀浆机研磨后超声处理20 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取300 μl上清液，加入50 μl内标溶液，再加入1 ml乙腈，涡旋混匀1 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取上清液，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心5 min（转速为10 000 r/min），取上清液，20 μl进样。
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采用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。
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取涂抹空白乳膏基质的大鼠皮肤和给药后大鼠皮肤经处理后，分别进样20 μl，记录色谱图，考察是否有内源性物质干扰肌醇烟酸酯的测定。结果见图1。由实验结果可知，在此色谱条件下，皮肤中内源性物质和空白乳膏基质不干扰肌醇烟酸酯和内标的定量测定。
图 1 专属性HPLC图谱
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精密吸取系列对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到待测物浓度为0.25、0.50、1.00，2.50，5.00，10.00和20.00 μg/ml的系列溶液，按“2.4”项下操作后进样分析，记录峰面积，以肌醇烟酸酯的浓度（X）为横坐标，以肌醇烟酸酯（A）与内标物（B）的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程为Y=0.172X+0.002（r=0.999 9），线性范围0.25~20.00 μg/ml，定量下限为0.25 μg/ml（S/N≥10）。
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取低、中、高不同浓度的QC样品及定量下限，按“2.4”项下方法操作。每个浓度配制6份样品，配制3个分析批，连续测定3 d。计算定量下限和QC样品的日间和日内的准确度RE%和精密度RSD%，见表1，该方法的精密度和准确度均符合生物样品分析要求。
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 -
取低、中、高不同浓度的QC样品，按“2.4”项下方法操作，记录峰面积（A1）。另外，将1 ml空白皮肤匀浆液按“2.4”项下方法操作，提取后，加入3种不同浓度的QC样品各50 μl，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，20 μl进样，记录峰面积（A2）。将两者相比，即得QC样品的提取回收率。结果见表2。肌醇烟酸酯的平均提取回收率为96.18%，甲苯咪唑的平均提取回收率为90.65%，RSD均<15%，表明该提取方法具有较好的稳定性和重现性。
表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 -
取低、高不同浓度的QC样品，按照“2.4”项下皮肤样品的处理方法操作，分别考察低、高2个浓度的QC样品在室温下放置12 h、−4 ℃放置12 h、反复冻融3次（−20 ℃）和冷冻贮存2周（−80 ℃）的稳定性。数据结果见表3。结果表明，各生物样品在上述条件下稳定性均良好。
表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 -
采用DAS 2.0软件，以非房室模型分析待测物的药动学数据。皮肤中药物浓度数据以（mean±SD）表示，绘制了平均药物浓度时间曲线，各时间点含药浓度的计算分别伴随行标曲及QC。将给药后不同时间血药浓度和时间数据用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。详见图2和表4。
图 2 单次经皮给药后大鼠皮肤中肌醇烟酸酯药物浓度-时间曲线图（mean±SD, n=6）
表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437 -
本实验采用在体给药分时取样法，在不同时间点取皮制备成匀浆测定皮肤中药物浓度。该方法线性关系良好、所测匀浆样品的精密度、准确度等方法学均符合生物样品定量分析要求，其专属性强、灵敏度高、简便、快速高效，可以用于大鼠皮肤中IN的含量测定，对IN在体皮肤浓度测定以及相关药理研究有一定的参考价值。由上述结果可知，IN能迅速渗透进入皮肤，并能长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。HPLC分析方法快速、准确、回收率高、重现性好，可成功的用于测定GJR中IN在皮肤中的含量，表明在体给药分时取样法能较好地反映药物在大鼠体内的经皮代谢过程，适用于临床前外用药物的皮肤药动学筛选与评价，为临床用药方案的确定提供参考。
Skin pharmacokinetics of inositol nicotinate in heparin sodium inositol nicotinate cream
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摘要:
目的 建立HPLC法测定大鼠皮肤中肌醇烟酸酯（IN）的浓度，并研究肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学特征。 方法 采用HPLC法建立简便快速的测定给药后不同时间点大鼠皮肤中IN浓度的分析方法，并用建立的方法开展肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学研究，采用DAS软件拟合药物动力学参数。 结果 该分析方法在0.25 ~ 20 μg/ml浓度范围内线性良好，定量限为0.25 μg/ml，平均加样回收率为96.18%。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏皮肤给药后IN的药动学参数t1/2 为（4.555±2.054） h、Tmax为（6±0） h、Cmax为（16.929±2.153） mg/L、AUC0−t为（150.665±16.568） mg·h /L、AUC0−∞为（161.074±23.917） mg·h /L、MRT（0−t）为（9.044±0.618） h、MRT（0−∞）为（10.444±1.91） h、CLz/F 为（0.19±0.03） L/（h·kg）、Vz/F 为（1.190±0.437） L/（h·kg）。 结论 IN能迅速渗透进入皮肤，并能够长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。该方法简便、快速、专属性强、重复性好，可应用于大鼠腹部皮肤给药后IN的药动学研究。 -
关键词:
- 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏 /
- 皮肤药动学 /
- 肌醇烟酸酯
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of inositol nicotinate（IN） in rat skin, and study the pharmacokinetic characteristics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats. Methods HPLC method was used to establish a simple and rapid analytical method for the determination of IN concentration in the skin of rats at different time points after administration. The established method was used to study the pharmacokinetics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats, and the pharmacokinetic parameters were fitted with DAS software. Results The linearity of the analytical method was good in the concentration range of 0.25-20 μg/ml, the quantitative limit was 0.25 μg/ml, and the average recovery rate was 96.18%. The pharmacokinetic parameters of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats were as follows: t1/2 was （4.555±2.054） h, Tmax was （6±0）h, Cmax was （16.929±2.153）mg/L, AUC0−t was （150.665±16.568） mg·h /L ,AUC0−∞ was （161.074±23.917） mg·h /L, MRT（0−t） was （9.044±0.618）h, MRT（0−∞） was （10.444±1.91） h, CLz/F was （0.19±0.03） L/（h·kg）, and Vz/F was （1.19±0.437） L/（h·kg）. Conclusion IN could quickly penetrate the skin and accumulate in the skin for a long time, which was beneficial to the pharmacological action of drugs on the lesion site for a long time. The method is simple, rapid, specific and reproducible, which could be successfully applied to the pharmacokinetic study of IN after transdermal administration in rats. -
阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人，随着人口老龄化的进展，这一数字还将持续增加，给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止，临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限，FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议，且治疗费用昂贵[2] 。因此，开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势，近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久，葛根解肌退热、生津止渴，知母清热泻火、滋阴润燥，二者配伍可清热生津、滋阴润燥，改善代谢紊乱，对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用，主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病，AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联，也被称为脑型糖尿病（3型糖尿病）[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此，本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果，同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制，为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪（美国安捷伦公司）；HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；ANALOG 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Integral超纯水机（美国Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）。1.2 药物与试剂
葛根（批号：A220901）与知母药材饮片（批号：
20220201 ）购自上海市白鹿堂中药店，经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate（Willd.）Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙醇（分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司）； 乙腈、甲酸（均为LC-MS级，赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乌拉坦（批号：P2091859）、D-gal（批号：P1616089）和AlCl3（批号：P2391168）购自上海泰坦科技股份有限公司；生理氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司）；L-2-氯苯丙氨酸（98%，上海麦克林生化有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，笼饲条件为：温度恒定为（22±2）℃，湿度区间为40%～60%，昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对（15∶12）粉末适量，以10倍体积70%乙醇浸泡，在85 ℃下加热回流提取90 min，滤过，滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液，60 ℃减压浓缩至无乙醇味，制备得到用于灌胃的提取液，密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组（n=8）。除对照组外，其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃，连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水（灌胃+腹腔注射）。自第14周起，3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃（相当于生药量：葛根6.25 g/（kg·d），知母5 g/（kg·d），药对11.25 g/（kg·d）。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d，其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数，供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后，大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，静置后，在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min，取上清液分装冻存于−80 ℃，供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量，加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液，随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中，加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液，涡旋2 min后，在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl，混合得到质控（QC）样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件：反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；进样量：2 μl；柱温：40 ℃；流动相为0.1%甲酸-水（A ）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；T3柱梯度洗脱模式：0~2 min，2%B；2~17 min，2%~98% B；17~19 min，98%B。HILIC柱梯度洗脱模式：0~2 min，95%B；2~4 min，95%~89% B；4~10 min， 89% B；10~12 min， 89%~66% B；12~15 min， 66% B。流速：0.4 ml/min；色谱柱平衡时间：5 min。
质谱条件：采用 ESI 离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度，350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；毛细管电压：正离子模式为
4 000 V，负离子模式为3 500 V；碎裂电压：120 V；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理，按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1（Umetrics公司，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）并进行模型验证，结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值（VIP）>1、P<0.05且差异倍数（fold change，FC）>1.2或<0.8作为筛选标准，获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库（https://hmdb.ca/）等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM公司，美国）和GraphPad Prism 8（Graphpad软件公司，美国）进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标，考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示，定位航行训练期间，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势，其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓，对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著，对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异（P<0.01）。同样，空间探索实验中，模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加，其中，葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降，给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力，以葛根-知母药对最为显著，效果优于单药。
图 1 不同组别大鼠水迷宫实验结果A.逃避潜伏期；B.目标象限停留时间百分比；C.各组大鼠水迷宫代表轨迹图；D.穿越站台次数 *P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 与对照组比较。3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比，模型组大鼠血清NO水平相对升高，MDA水平显著升高（P<0.05），SOD含量极显著降低（P<0.01）。中药干预后，各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低，其中葛根-知母药对组降低效果最为明显，与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调，组间差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图 2 不同组别大鼠血清SOD（A）、MDA（B）和NO（C）水平*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较； #P<0.05, ##P<0.01，与对照组比较。3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱，不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明（图3），在PLS-DA多组分析模型中，空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好，组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示，Q2回归线与Y轴截距小于0，R2和Q2曲线斜率始终为正值，且Q2<R2，表明模型未出现过拟合，具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中，不同分析条件下，AD模型组与空白对照组间完全分离，表明模型组与对照组间具有显著组间差异，CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合，具备解释和预测能力。
图 3 UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA与OPLS-DA得分图A-D. UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA得分图；E-H. 模型组与对照组间OPLS-DA得分图3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析，以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准，对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选，并以火山图形式呈现（图4）。图中橙色标记点为显著上调代谢物，蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定，在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物，其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物，T3柱鉴定得到45个代谢物，T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个，具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量（m/z） 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15（S）-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC（15:0/0:0） T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC（18:1（9Z）e/2:0） T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16（17）-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer（d18:1/12:0） HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC（14:0/0:0） HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-（14,15-环氧二十碳三烯酰基）甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-（11Z二十二碳烯酰基）-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注：↑表示模型组较对照组相对升高趋势，↓表示模型组较对照组相对下降趋势，P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果；
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势（共47个），*表示代谢物（共20个）经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析，P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示，葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个，其中，显著回调代谢物20个（表1和图5）。
图 5 20个显著回调代谢物在不同组间的相对信号强度*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较; #P<0.05, ##P<0.01，###P<0.001，与对照组比较。对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现（图6），AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
图 6 血清差异代谢物KEGG通路富集分析A.模型组与对照组；B.葛根-知母药对干预后回调通路（1.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2.苯丙氨酸代谢；3.亚油酸代谢；4.不饱和脂肪酸的生物合成；5.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；6.精氨酸生物合成；7.烟酸和烟酰胺代谢；8.嘧啶代谢；9.酪氨酸代谢；10.初级胆汁酸生物合成）4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病，具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ，啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性，影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性，过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明，D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此，本研究选取D-gal与AlCl3联合造模，通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化，力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明，D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降，体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化，表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力，并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标，改善和回调效果优于单药，表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用，具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明，葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现，AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调，表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高，葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸，参与氧化还原调控和细胞凋亡，既是活性氧（ROS）清除剂，也是ROS生产者，因此，平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现，脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似，葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外，本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物，广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平，与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联，这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质，溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物，与磷脂代谢密切相关，磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调，表现为细胞凋亡及信号转导异常，是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明，葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激，氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种，也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化，导致MDA等高反应性化合物的产生，因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成，并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示，葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明，葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平，回调NO和MDA至生理水平，提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化，维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上，本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果，药对药效优于单药；运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径，其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关，为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
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图 1 专属性HPLC图谱
A. 空白皮肤（涂抹空白基质乳膏）溶液；B. 空白皮肤溶液+肌醇烟酸酯+甲苯咪唑对照品溶液； C.含药皮肤样品溶液（涂抹6 h后）；1. 肌醇烟酸酯；2. 甲苯咪唑
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 
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表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35
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表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69
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表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437
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[1] 陶冶, 顾伟杰, 晋亮, 等. 高原高寒地区官兵冻伤发生情况调查及相关因素分析[J]. 临床军医杂志, 2023, 51(3):243-245. [2] 张莉, 蔺兴遥, 尚芸, 等. 冻伤的病理机制及治疗研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2023, 28(3):347-354. [3] 焦明克, 楼林, 胡劼, 等. 普通冻伤与高原冻伤血液微循环恢复的差异[J]. 解放军医学杂志, 2017, 42(1):66-69. doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2017.01.13 [4] 毕婷, 冯晓东, 张巍, 等. 寒区军人冻伤发病现状及预测模型研究进展[J]. 创伤与急危重病医学, 2020, 8(2):134-136. [5] 刘清宇, 刘松春, 程治铭, 等. 寒区冻伤预防及诊疗研究进展[J]. 人民军医, 2021, 64(2):147-150. doi: 10.3969/j.issn.1000-9736.2021.02.014 [6] 马宏达, 吴琼, 崔亚玲, 等. 不同促透剂对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏透皮吸收影响[J]. 临床军医杂志, 2017, 45(8):771-775. [7] 崔亚玲, 刘小虎, 许子华, 等. 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对兔皮肤冻伤的治疗作用及刺激性研究[J]. 东南国防医药, 2021, 23(05):449-454. doi: 10.3969/j.issn.1672-271X.2021.05.001 [8] LIANG D, MA J, WEI B, et al. Determination of inositol hexanicotinate in rat plasma by high performance liquid chromatography with UV detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2008, 863(1):172-176. doi: 10.1016/j.jchromb.2007.12.024 [9] MILTON S G, ROBINSON K, MA J, et al. Biotransformation and pharmacokinetics of inositol hexanicotinate in rats[J]. Xenobiotica, 2013, 43(9):817-822. doi: 10.3109/00498254.2012.762591 [10] CDE. 药物非临床药代动力学研究技术指导原则. [DB/OL].(2014-05-13). https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ypggtg/ypqtggtg/20140513120001448.html. [11] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 四部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. 期刊类型引用(1)
1. 熊亚娟，冯思雨，郭泽磾. 肺炎患儿雾化吸入结合大环内酯类抗生素的治疗效果分析. 中国医学工程. 2024(11): 104-106 . 
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