下载:
下载:
-
RRx-001化学名称为2-溴-1-（3, 3-二硝基氮杂环丁烷-1-基）乙烷-1-酮，结构如图1所示。RRx-001是由EpicentRx公司研发、具有首创潜质的小分子药物，经过美国食品药品监督管理局（FDA）批准，RRx-001作为孤儿药进入临床试验用于治疗小细胞癌、神经内分泌癌和胶质母细胞瘤的患者。另外，RRx-001作为放疗增敏剂也已进入临床试验。RRx-001不仅可作为单药用于临床，还可与化疗、放疗、靶向药物及其他免疫疗法联合使用[1, 2]。RRx-001具有较短的半衰期，体内代谢较快[3]，临床试验采用口服给药或静脉给药[4]。作为一种新型抗肿瘤药物，RRx-001因其结构中包含的α-溴乙酰基片段，可通过双分子亲核取代反应机制与游离的巯基如还原性谷胱甘肽和血红蛋白β链上Cys93等发生选择性化学反应[5]。 RRx-001最常见的副作用是静脉输液相关疼痛，因此临床试验研究时将RRx-001与患者血液混合后给药，并且控制较慢的输注速度 [6, 7]。本文综述了RRx-001的作用机制研究最新进展，总结了近年来RRx-001临床试验的研究结果，为RRx-001进一步结构优化和临床应用研究提供了事实依据和指导方向。
图 1 RRx-001的化学结构
-
早期研究表明，RRx-001是一种NO拮抗剂，不仅可作为NO供体，而且能作为“红细胞吞噬免疫治疗剂”，可增加红细胞对肿瘤血管的依附性[8]。血红蛋白β链上的Cys93与RRx-001结合位后，释放出NO并入血。在缺氧条件下，RRx-001能增强脱氧血红蛋白亚硝酸盐还原酶的活性，使NO的生成大大增加[9]。RRx-001能选择性并不可逆地与血红蛋白β链上的Cys93结合[10]，增加红细胞对内皮的黏附能力，提高红细胞膜磷脂酰丝氨酸表达量，并且可使红细胞优先定位到实体瘤 [11]。与RRx-001结合后的红细胞优先粘附在肿瘤血管内皮后，肿瘤便以“特洛伊木马”的方式内化和分解代谢，释放具有氧化还原活性的RRx-001和红细胞代谢物（图2）[12]。
图 2 RRx-001可作为NO供体发挥抗肿瘤作用
此外，RRx-001是一种Myc蛋白抑制剂，通过抑制Myc可下调PD-L1的表达从而抑制免疫逃逸。研究表明，RRx-001还可作为Nrf2诱导剂发挥放化疗保护作用，Nrf2是bZip转录因子，属于调控蛋白，Nrf2能通过细胞氧化还原状态的改变而被激活，并通过上调抗氧化剂、异种生物代谢和其他细胞保护酶来恢复细胞内稳态[13]。RRx-001能促进Nrf2在人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2细胞）核内的积累，导致血清HO-1的表达显著增加[14]。但RRx-001对Nrf2的调控具有“双刃剑”作用，Nrf2长期激活亦有促癌作用，可以诱导氧化应激，使老年人或慢性病患者OS水平升高[15]。抑制G6PD活性可能是RRx-001发挥抗肿瘤作用的另一个重要机制，研究发现，RRx-001能以浓度依赖的方式抑制G6PD [16]。作为一种有效的G6PD抑制剂，RRx-001已处于临床试验用于小细胞肺癌患者的治疗。并且，RRx-001与JQ1的联合治疗显著降低了皮下肿瘤组织中KEAP1的表达水平，通过调控KEAP1-Nrf2-G6PD轴，抑制小细胞肺癌细胞的氧化还原代谢[17]。
迄今为止，RRx-001的作用机制尚未明确。近年来研究表明，RRx-001除可能通过以上作用机制发挥抗肿瘤活性以外，还可能作为CD47小分子调节剂发挥抗肿瘤免疫活性。并且也可作为NLRP3抑制剂起到抗炎作用，进一步拓展其在抗肿瘤和抗炎药物开发的应用。
-
CD47是肿瘤细胞上一种广泛表达的细胞表面蛋白，能传递抗吞噬的信号从而阻止巨噬细胞介导的对肿瘤细胞的吞噬[18]。通过下调CD47的表达，可恢复巨噬细胞的作用，使巨噬细胞向M1巨噬细胞分化，刺激颗粒细胞瘤（GCT）的吞噬作用从而可达到杀灭肿瘤细胞的作用[19]。RRx-001是首个进入临床的CD47小分子调节剂，降低了肿瘤细胞和单核/巨噬细胞上CD47的表达水平，恢复了CD47-SIRPα相互作用导致的吞噬抑制功能（图3）。体内研究证实，肿瘤微环境中浸润巨噬细胞的存在是RRx-001具有抗肿瘤活性的必要条件[20]。研究表明，作为CD47小分子调节剂，RRx-001还可以与pH响应型纳米药物以及T型钙通道抑制剂联用，将药物输送到肺肿瘤中对肿瘤细胞起到杀伤作用[21]。
图 3 RRx-001能下调CD47表达，使肿瘤相关巨噬细胞复极化
-
NLRP3炎症小体是固有免疫的主要组成成分之一，在机体免疫反应和炎症性疾病发生发展过程中起到了非常重要的作用，炎症小体激活的失调导致一些自身炎症性疾病如代谢综合征、2型糖尿病、阿尔兹海默病、心血管疾病、癌症等，这些疾病与较高水平的IL-1β和IL-18分泌有关[20]。RRx-001是NLRP3炎症小体的双重抑制剂，能选择性与NLRP3中心结构域的半胱氨酸结合[15]，并且与NLRP3的结合能以级联的方式抑制巨噬细胞的极化，减少IL-1β的释放，阻滞增强的免疫反应和自身免疫的发生（图4）[14]。RRx-001还能剂量依赖性抑制ASC的聚合，直接抑制NEK7、NLRP3和ASC间的相互作用以及NEK7和NLRP3之间的相互作用，进而抑制NLRP3炎症小体的组装过程。[22]
图 4 RRx-001能双重抑制NLRP3炎症小体
-
RRx-001的临床研究主要是以肿瘤为适应症，进展最快的已进入Ⅲ期临床试验，研究较多的为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其他如结直肠癌、脑转移癌等研究亦有所涉及。除肿瘤外，因发现RRx-001可作为NLRP3抑制剂，一些炎症相关和神经保护的临床试验研究也正在开展，在今年热点COVID-9领域中的研究也证明了RRx-001对于新冠肺炎导致的急性呼吸道症状可能具有治疗作用[23-25]。综述[26]总结了RRx-001的3个主要临床试验：ROCKET、G-FORCE和QUADRUPLE THREAT，本文在此基础上，对RRx-001的临床试验进行了深入系统总结（表1）。
表 1 RRx-001部分临床试验
序号 名称 临床试验 临床阶段 试验时间 给药剂量 适应证 1 剂量依赖性试验 NCT01359982 Ⅰ期 2011.10至2013.03 推荐剂量16.7 mg/m2 肿瘤 2 PRIMETIME NCT02518958 Ⅰ期 2015.01至2015.11 剂量递增，最大剂量16 mg 晚期转移性癌症 3 G-FORCE-1 NCT02871843 Ⅰ期 2016.07至2018.05 推荐剂量4 mg 高级别胶质母细胞瘤 4 BRAINSTORM NCT02215512 Ⅰ/Ⅱ期 2015.02至2017.02 推荐剂量10 mg/m2 脑转移瘤全颅放疗 5 ROCKET NCT02096354 Ⅱ期 2014.06起 4 mg 三/四线转移性结直肠癌 6 QUADRUPLE THREAT NCT02489903 Ⅱ期 2015.06起 4 mg+自体静脉血12 ml 小细胞肺癌，EFGR突变的非小细胞肺癌，
高级别神经内分泌肿瘤，卵巢肿瘤7 PREVLAR NCT03515538 Ⅱ期 2018.07至2019.08 4 mg 口腔黏膜炎 8 REPLATINUM NCT03699956 Ⅲ期 2019.03起 4 mg 三线小细胞肺癌 -
剂量依赖性临床试验是一项较早开展，首次进入人体的开放式I期临床试验。研究评估了RRx-001的安全性、耐受性、剂量推荐和毒性反应情况。研究于2011-2013年共招募25例患者，给药剂量递增前有两周观察期，3名患者的起始剂量为10 mg/m2，剂量递增依次为 16.7、24.6、33、55 mg/m2和 83 mg/m2，每个剂量组中至少入组3名患者。治疗持续到病情进展或出现剂量依赖毒性反应或其他不良事件出现，每个治疗日都进行标准的血液检查和化学检查，同时观测治疗效果。从研究结果可以看出，RRx-001总体具有良好的耐受性，不良反应多为1~2级，主要不良反应为输液相关手臂疼痛，因而推荐每周16.7 mg/m²的剂量为Ⅱ期临床试验剂量[27]。
-
PRIMETIME是一项针对于晚期转移性癌症的I期先导性研究，研究采用了3+3的形式确定每个剂量水平的联合用药安全性。研究选用的给药方法是对于入选的晚期癌症患者每周使用一次递增剂量的RRx-001，同时与每隔一周3 mg/kg的纳武利尤单抗联合使用，RRx-001的最高剂量为16 mg，每6周评估一次治疗效果。由于样本量较小，研究结果暂无统计学意义，现有数据表明RRx-001参与的治疗总体耐受性良好，肿瘤相关巨噬细胞密度可能与RRx-001相关联。但是，RRx-001给药期间观察到假性进展即肿瘤先随着免疫细胞的渗透而增大，后因肿瘤细胞的清除退化趋于稳定。此项临床试验研究初步提供了RRx-001有效性的证据，以及进一步的临床研究方案依据[28]。
-
G-FORCE-1是一项非随机、开放式，分为两部分的I期临床试验，研究放疗时RRx-001和替莫唑胺剂量递增或固定剂量带来的临床治疗效果。临床试验包括6组患者，所有患者均接受了总剂量60 G，30次照射。前4组患者照射期间接受每日75 mg/m2剂量的替莫唑胺和每周递增剂量的RRx-001，依次为0.5、1、2、4 mg，最多治疗6次。替莫唑胺的剂量由放疗结束6周后开始，起始剂量变为150 mg/m2，28 d为一个周期，连续治疗5个周期，如无2级以上不良反应则增加到200 mg/m2，连续治疗6个周期。第5和第6组患者则是在照射期间接受每日75 mg/m2剂量的替莫唑胺和每周固定剂量的RRx-001（4 mg），放疗结束6周后，第5组患者开始接受100 mg/m2替莫唑胺和0.5 mg RRx-001，第6组患者接受100 mg/m2替莫唑胺和4 mg RRx-001，治疗结束的标准均为病情进展或完成6个周期的治疗。结果表明，在放疗和替莫唑胺治疗方案中添加RRx-001可以增加其治疗耐受性，提高受试者生活质量。并且，降低了毒性如血液学毒性的减少、部分骨髓保护作用[29]。
-
BRAINSTORM是一项单臂、多机构、开放式I/Ⅱ期临床试验，旨在研究RRx-001对于脑转移瘤患者全颅放疗的安全性和有效性。在此研究中，患者在全颅放疗前两周，每周两次，以及放疗前的第2天和第4天静脉给药RRx-001，并且在放疗疗程进行的第1、4、8、11天接受RRx-001治疗，剂量升级梯度为10、17、33、55 mg/m²。治疗期间使用磁共振对患者炉内病灶进行评估，对最佳颅内总反应率和总生存期进行计算评估。研究表明，RRx-001和全颅放疗之间具有潜在协同作用，RRx-001治疗总体耐受良好。尽管接受RRx-001治疗的患者颅内疾病控制率和仅接受全颅放疗的患者相比无统计学改善，并且总生存期也没有明显改变。但是，没有出现患者死于神经系统疾病，这一定程度上肯定了RRx-001对于脑的保护作用[30]。
-
ROCKET是一项旨在比较RRx-001 和伊立替康联合使用与瑞格菲尼单药在既往接受伊立替康治疗的三、四线结肠直肠癌患者中的安全性和有效性。34例患者以2∶1的比例接受RRx-001治疗，即RRx-001治疗组的患者先用4 mg的RRx-001作为“入门药”治疗两个月，若被认为临床适用则给予180 mg/m2的伊立替康。另一组则是患者接受160 mg瑞格菲尼，若被认为临床适用则再给予180 mg/m2的伊立替康。治疗后每周观察患者病情进展情况并计算患者的无进展生存期和总生存期。研究表明，在三、四线晚期结直肠癌的治疗中，先使用RRx-001，然后再给予伊立替康治疗可能是一种有效的治疗方案，这种方法比瑞格菲尼单药带来更好的疗效，显著改善无进展生存期和总生存期，并且毒性更低。但此研究规模较小，需要进一步扩大样本量确认RRx-001的有效性[31]。ROCKET实验后，动物实验又验证了RRx-001与瑞格菲尼联用的可能性，实验结果证明联合用药可以提升抗肿瘤活性并且减小副作用[32]。
-
QUADRUPLE THREAT是一项探索性、开放式Ⅱ期临床试验，评估了既往治疗过的小细胞肺癌、EGFR突变的非小细胞肺癌、恶性程度较高神经内分泌肿瘤和卵巢癌患者使用RRx-001后再进行铂类化疗的安全性和可行性。此项研究中患者接受每周一次4 mg的RRx-001混合自身12 ml自体静脉血共同输注，这是为了减少剂量增加后导致的凝血和溶血风险。在RRx-001治疗的过程中通过影像检查评估患者的肿瘤进展状况，若出现肿瘤进展或临床恶化则使用6个周期化疗药物治疗，如给予100 mg/m2的依托泊苷或60 mg/m2的顺铂。研究结果证明，RRx-001的耐受性良好并与既往治疗过的小细胞肺癌患者中对依托泊苷和其他铂类药物的后续反应相关。临床目前的标准治疗并不有效，对于接受临床三线及以上治疗的患者，RRx-001给此类患者的后续治疗提供了可能性[33]。动物实验将RRx-001的疗效和安全性与铂类药物进行对比，结果证明RRx-001的疗效明显高于其他铂类药物略低于顺铂，但毒性明显低于顺铂，与临床结果一致[3]。
-
PREVLAR是一项随机、无盲、开放式Ⅱa期临床试验，旨在研究RRx-001对头颈部癌症患者化放疗导致口腔黏膜炎的治疗方案安全性和有效性。在此研究中53名患者被分为4组，在以顺铂为基础的化放疗外，1~3组在开始化放疗两周前地塞米松处理后接受每周两次4 mg的RRx-001，第4组则不接受RRx-001的干预。1~3组在开始化放疗后进行不同处理，第2组在疗程的第2和第5周再接受两次4 mg的RRx-001，第3组则在疗程的前6周每周接受一次4 mg的RRx-001，第1组疗程内不接受RRx-001的干预。化放疗开始后每周对口腔黏膜炎进行两次评估，直至溃疡性口腔黏膜炎消除，此为观察结束终点。研究结果表明，接受RRx-001治疗后溃疡性口腔黏膜炎的病程缩短，严重程度和症状有明显减轻，因而体现出放疗保护作用。研究还指出RRx-001似乎不能降低放疗期间罹患溃疡性口腔黏膜炎的绝对风险，但可显著缩短其持续时间。并且，RRx-001治疗方案未见明显不良反应，耐受性良好。此研究使RRx-001获得FDA快速通道资格，可作为放疗保护剂预防或改善严重的口腔黏膜炎[15, 34]。
-
REPLATINUM是一项随机、开放式Ⅲ期临床试验，旨在分析RRx-001和铂类药物联合治疗与仅用铂类药物治疗三线小细胞肺癌的疗效差异。研究将患者1∶1随机分配到两组中，一组接受3周为一个周期、每周一次4 mg的RRx-001和第1~3天的依托泊苷100 mg/m2以及另一种铂类药物如顺铂60 mg/m2或卡铂治疗，若病情好转则交替使用连续两周每周一次4 mg的RRx-001和减量单药铂类药物维持治疗。另一组则仅接受21天为周期的第1~3天的依托泊苷100 mg/m2以及另一种铂类药物如顺铂60 mg/m2或卡铂治疗。治疗一个周期后通过CT评估，此后每两个治疗周期评估一次，安全性评估则贯穿整个治疗过程。目前此研究正在进行中，研究结果将揭示RRx-001对于铂类药物化疗的敏感性，以及和铂类药物交替使用的可行性和安全性[35]。
-
RRx-001作为一种首创小分子药物，主要作用机制除了NO拮抗剂、Myc抑制剂、G6PD抑制剂以及对于红细胞的作用以外，作用机制研究的热点是作为NLRP3抑制剂、Nrf2诱导剂、CD47抑制剂。目前，RRx-001已经进入了III期临床试验阶段，在此之前，I和Ⅱ期临床试验已经证实其在小细胞肺癌、结直肠癌、头颈部癌、脑转移和神经胶质瘤以及肺部炎症等的治疗效果以及放化疗的增敏和保护作用。尽管RRx-001还没有获批上市，现有临床试验一定程度上证实了RRx-001作为单药使用时以及与其他药物联用时的有效性和安全性，但仍需进一步扩大临床样本开展更大规模的临床试验证实。但是，基于现有临床数据，RRx-001有望成为治疗晚期癌症患者或是恶性程度较高癌症患者的治疗药物。
Clinical research progress on RRx-001
-
摘要: 恶性肿瘤、神经退行性疾病、血管性疾病等一直是临床治疗的难点，由于这些疾病的发病机制复杂性，找寻疗效高且副作用小的药物是治疗药物研究的热点。RRx-001作为潜在首创的小分子药物，有望成为肿瘤免疫治疗、放化疗增敏和保护的重要临床一线药物。目前，RRx-001已进入Ⅲ期临床研究阶段，Ⅱ期临床试验数据证实了RRx-001临床安全性和有效性，并且发现与临床肿瘤治疗一线药物联合用药的优越性。本文总结了RRx-001的作用机制研究新进展和主要临床试验研究结果，对后续针对RRx-001的优化设计和临床应用具有一定的指导意义。Abstract: It is difficult to treat malignant tumors, neurodegenerative diseases, and vascular diseases. For pathogenesis complexity of these diseases, researchers have focused on finding more drugs with high efficacy and low side effects. As a potential first-in-class drug, RRx-001 is expected to be an important first-line drug in tumor immunology, radiosensitizer and radio protecter. Currently, RRx-001 entered phase III clinical trials. The data of the phase II clinical trials demonstrated its safety and effectivity as a single agent and in combination with first-line clinical drugs. The novel mechanisms of RRx-001 and the result of main clinical trials were summarized, which could be valuable to further optimization and clinical application.
-
Key words:
- RRx-001 /
- tumor immunology /
- review /
- clinical trials
-
多剂量滴眼液须使用抑菌剂，以防止使用过程中和货架期内微生物污染和繁殖，但是抑菌剂对眼的伤害不容忽视，多国药典及抑菌剂管理规范[1]均要求处方中抑菌剂的浓度必须在有效性和安全性方面得到合理性支持，保证抑菌剂浓度最低但又能发挥抑菌作用，并规定滴眼液标签必须注明抑菌剂种类和标示量，且实际含量应在标示量的±20%以内。《中国药典》2020版收载了45个滴眼剂品种，只有12个列入抑菌剂检查项，仅占26.7%[2-4]。目前市售滴眼液标签多数未按照《中国药典》2020版四部通则0105眼用制剂[5]要求标明抑菌剂种类和标示量，滴眼液中抑菌剂的使用和质量安全控制缺乏有效监管。
目前滴眼液允许使用的抑菌剂主要有六大类：羟苯酯类、季铵盐类、有机酸类、醇类、酚类和有机汞类,如硫柳汞。硫柳汞在滴眼剂、滴鼻剂、疫苗、化妆品中广泛使用，然而，汞对人体具有潜在的危害，摄入过量的汞可造成神经系统、肾脏、皮肤的损伤。滴眼剂中抑菌剂浓度过高会对眼上皮细胞产生损伤，有研究者在对药源性角膜上皮病变病例研究时发现，有患者使用防腐剂为硫柳汞的滴眼剂后引起了明显的点状角膜上皮损害[6-8]。《中国药典》2020年版三部通则
3115 “含量测定法”中收载硫柳汞测定方法[4]，采用滴定法和原子吸收分光光度法，二部[3]各论阿昔洛韦滴眼剂项下采用高效液相色谱方法，另外文献资料收载的测定法主要有:原子荧光光谱分析法、冷原子吸收光谱法、硫氰酸铵滴定法、二硫腙滴定法、二硫腙比色法等[9-12]，这些方法的共同点是有机汞首先被消解成无机汞，然后测定无机汞的含量。上述方法操作步骤繁琐，专属性不强，不适用于复杂药物制剂中痕量加入的有机汞防腐剂快速准确检测。为此，本研究建立了一种通用型HPLC法用于测定滴眼液中抑菌剂硫枊汞的含量。1. 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪；美国赛多利斯MSE225S型电子天平。硫柳汞（含量97.0%，批号T1605112，Aladdin公司）；醋酸苯汞（纯度:97.0%，批号P27127，Sigma公司）。甲醇、三乙胺为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。
以收集到的4个制药企业（A、B、C|、D）生产的6批滴眼液为供试品，处方中硫柳汞含量均不同（企业A双氯芬酸钠滴眼液批号150301、150802、160801；企业B阿昔洛韦滴眼液批号16090401；企业C盐酸林可霉素滴眼液批号160501；企业D苄达赖氨酸滴眼液批号3160703）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱资生堂MGII-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以1%三乙胺溶液（磷酸调节pH值至3.0）为流动相A，以甲醇为流动相B；按表1进行梯度洗脱；柱温为40 ℃；检测波长为222 nm；流速为1 ml/min；进样体积20 µl。
表 1 梯度洗脱程序时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 50 50 2 50 50 17 10 90 20 10 90 20.1 50 50 27 50 50 2.2 溶液制备
2.2.1 系统适用性考察溶液配制
精密称取硫柳汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；另取硝酸苯汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；取上述两种液体等量混合，即得。
2.2.2 对照品溶液制备
取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释成0.2 mg/ml的溶液作为对照品储备液；精密量取储备液适量，加水分别稀释制成20 μg/ml溶液（或根据供试品硫柳汞含量不同制备成其他相同浓度的对照品），作为对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液制备
取滴眼液直接进样。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验
精密量取“2.2.1”项下系统适用性考察溶液、对照品溶液、供试品溶液（含硫柳汞）、滴眼液（不含硫柳汞）各20 μl，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，见图1。硫柳汞对照品溶液和硝酸苯汞对照品溶液混合后生成1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐，以及其他产物，色谱图应存在4个色谱峰分别为：主峰硫柳汞、1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐、硝酸苯汞以及一个杂质或其他反应产物，配制该溶液主要是考察专属性，筛选色谱柱和考察色谱系统的改变对分离的影响。图1A表明系统适用性考察用混合溶液各色谱峰之间均完全分离，系统适用性良好。图1D表明不含硫柳汞的滴眼液在硫柳汞峰处无色谱峰，不影响测定，可对未知抑菌剂的滴眼剂是否含有硫柳汞进行筛查。
图 1 专属性试验HPLC色谱图A．系统适用性色谱图；B.对照品色谱图；C.含硫柳汞供试品色谱图；D.不含硫柳汞的滴眼液色谱图；1．硫柳汞；2. 1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐；3.杂质或其他反应产物；4.硝酸苯汞2.3.2 线性关系考察
取硫柳汞对照品适量，精密称定，用水稀释成每1 ml约含硫柳汞4、10、20、60、80和200 μg的溶液，按“2.1”项下色谱条件试验。以对照品的质量浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。硫柳汞回归方程为Y=
54413 X–77901 ，r=1.0，结果表明：硫柳汞在4.3～216.7 µg/ml范围内有良好的线性关系。精密量取线性对照品最低浓度约4.3 μg/ml的溶液，测得信噪比接近10∶1，将其作为定量限溶液，即定量限为4.3 μg/ml。2.3.3 精密度试验
精密量取“2.2.2”项下20 μg/ml硫柳汞对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果硫柳汞峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
由于供试品溶液取原液没有制备过程，因此稳定性试验取对照品溶液进行，按“2.2.2”方法制备对照品溶液（23.2 μg/ml），取对照品溶液避光室温放置10 h，分别于1、3、5、7、9、10 h，取样分析，记录色谱图，比较硫柳汞峰面积变化情况，峰面积RSD为0.7%，显示稳定性较好。对照品溶液放置过夜后再次测定，峰面积有较明显降低，显示硫柳汞水溶液配制10小时内使用较好。
2.3.5 重复性试验
取三个企业A、B、C三批样品（批号分别为160801、16090401、160501）原液做为供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件直接进样分析，平行测定6份，按外标法以峰面积计算硫柳汞的含量，考察方法重复性。结果RSD分别为0.7%、0.2%和3.4%，表明重复性良好。
2.3.6 中间精密度试验
在不同的日期换用不同的液相色谱仪和实验操作者，重复“2.3.5重复性试验”的操作，按“2.1”项下色谱条件连续进样，平行测定6份，作为中间精密度，合并重复性试验的6份测定结果考察方法中间精密度，12份结果硫柳汞含量RSD分别为0.5%、0.7%和2.7%。参考《中国药典》2020年版四部[5]指导原则9101“分析方法验证指导原则”，重复性试验精密度要求，含量为0.01%，RSD应小于4%，上述含量最大为0.015%，RSD均小于3%，表明中间精密度良好。
2.3.7 加样回收率试验
2.3.7.1 空白辅料溶液制备
按B企业阿昔洛韦滴眼液处方（抑菌剂为硫柳汞，标示量为20 μg.ml−1）制备，取甲基纤维素、氯化钠、无水磷酸氢二钠适量，加水稀释至
1000 ml，放置过夜，即得。2.3.7.2 对照品溶液制备
精密称取硫柳汞对照品（纯度97.0%）21.77 mg，置100 ml量瓶中，加水适量，振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.3.7.3 供试品溶液（自制滴眼液）配制
精密量取对照品储备液2、5、3、5 ml，分别置25、50、25、25 ml量瓶中，加空白辅料溶液稀释至刻度，摇匀，即得80%、100%、120%、200%回收率供试品溶液（每浓度平行配制3份）。按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，按外标法计算回收率，硫柳汞的回收率为98.3%～106.2%，平均回收率为102.1%，RSD为2.7%，结果见表3。
表 2 硫柳汞回收率试验结果阿昔洛韦
滴眼液投入量
（μg/ml）测得量
（μg/ml）回收率
（%）平均回
收率（%）RSD% 80%供试品 16.89 16.84 99.69% 102.1 2.7 16.73 99.08% 16.60 98.27% 100%供试品 21.12 21.41 101.39% 21.26 100.68% 21.08 99.81% 120%供试品 25.34 25.98 102.54% 25.99 102.56% 26.09 102.97% 200%供试品 42.23 44.74 105.94% 44.86 106.22% 44.59 105.58% 2.3.8 耐用性试验
取“2.2.1”项系统适用性考察溶液和批号为
150301 滴眼液样品，考察方法耐用性。结果表明，在不同的柱温（30、35、40 ℃）、流速（0.9、1.0、1.1 ml·ml−1）、流动相A的pH值（2.8、3.0、3.2、3.5）、流动相组成（初始有机相B比例40%、45%、50%、55%、60%）和不同色谱柱（资生堂公司MGII、Waters Sunfire、Phenomenex Luna）条件下测定系统适用性考察溶液，硫柳汞与各峰分离度好，样品150301 批硫柳汞含量测定结果RSD为2.8%，所建立的方法耐用性良好。2.4 样品测定
取4个制药企业6批含抑菌剂为硫柳汞的样品，以样品原液做为供试品溶液（n=2）。
对照品溶液制备：针对已知抑菌剂为硫柳汞且已知浓度的样品，取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成与供试品溶液中硫柳汞浓度相当的溶液；针对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂筛查硫柳汞的含量，对照品溶液浓度可采用20 μg/ml或40 μg/ml（避光保存，10 h内使用）。
按“2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算硫柳汞的含量（n=2），结果见表4。
表 3 样品测定结果序号 生产
企业品种名称 样品批号 标示量
（μg/ml）含量
（μg/ml）1 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 150301 40 36.11 2 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 150802 40 37.87 3 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 160801 40 38.41 4 企业B 阿昔洛韦滴眼液 16090401 20 18.19 5 企业C 盐酸林可霉素滴眼液 160501 200 151.74 6 企业D 苄达赖氨酸滴眼液 3160703 30 26.30 3. 结果与讨论
3.1 检测波长的选择
USP收载的硫柳汞钠测定方法中，测定波长为222 nm[12]，《中国药典》2020年版二部[3]各论阿昔洛韦滴眼液项下硫柳汞钠测定波长为262 nm。本文采用PDA检测器扫描，显示222 nm吸收强度大于262 nm，并且这两个波长处峰对称性以及与相邻杂质的分离情况一致，因此，测定波长选择为222 nm。
3.2 方法的适用性
本课题研究方法作为可以检测多种滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量的通用方法，需要具备普遍适用性。本课题专属性研究工作还包括将收集到的42种滴眼剂（不含抑菌剂硫柳汞，分别含羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯扎溴铵、苯扎氯铵、三氯叔丁醇等）进样分析，考察是否在硫柳汞保留时间有出峰情况，同时回收试验将企业提供的十四种未加抑菌剂滴眼液进样分析，包含滴眼液常用的附加剂，均无干扰，方法专属性较好。
本课题研究方法拟用于各种不同活性成分的滴眼液中硫柳汞的测定，为了考察色谱条件变化对目标峰特性、分离度的影响，采用硫柳汞与硝酸苯汞混合液作为系统适用性考察溶液，硫柳汞与硝酸苯汞均在pH3.0～pH3.5、甲醇比例50%以上出峰较好，色谱峰对称性优于乙腈，因此采用pH3.0的甲醇系统作为流动相。。
3.3 样品测定结果的讨论
本次收集的6批样品，硫柳汞含量测定结果经药检机构复核基本一致。其中只有B企业1批阿昔洛韦滴眼液（批号16090401）在《中国药典》2020年版二部有硫柳汞含量测定方法，其他5批样品质量标准中均无抑菌剂含量测定方法，对批号为16090401的样品用所建立的方法与药典方法进行了比较，结果一致。根据样品测定结果，滴眼液中硫柳汞含量普遍低于处方标示量，并且测定结果显示随储存时间长含量下降多，尤其是企业C批号为160501的滴眼剂，硫柳汞标示量为200 μg/ml，实际测定结果低于标示量的80%，为151.74 μg/ml。经分析可能是由于硫柳汞不稳定，易在贮存过程中降解或见光分解[13]，另外有文献报道“硫柳汞作防腐剂时易与塑料瓶有反应，故用塑料瓶包装的滴眼剂不宜添加该防腐剂”[14]，这也可能是硫枊汞实测量低于标示量的原因之一。本文样品测定中6批样品均采用低密度聚乙烯瓶包装，贮存时间过长，硫柳汞可能与药包材反应造成含量下降。故建议生产企业注意滴眼液的贮存条件，另外对产品的包装材料进行相容性研究，从而避免不适用药品包装材料对产品质量的影响。
3.4 方法评价
本文建立的滴眼剂中抑菌剂硫柳汞的HPLC含量测定方法既可以对已知抑菌剂为硫柳汞和已知浓度的样品进行定量分析，亦可对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂进行硫柳汞添加监督筛查及含量测定，具有准确性好、线性范围广、耐用性强、普适性高的特点，所建立方法可作为滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量测定通用检测方法，为抑菌剂合理使用、质量控制和安全评价提供参考。
-
表 1 RRx-001部分临床试验
序号 名称 临床试验 临床阶段 试验时间 给药剂量 适应证 1 剂量依赖性试验 NCT01359982 Ⅰ期 2011.10至2013.03 推荐剂量16.7 mg/m2 肿瘤 2 PRIMETIME NCT02518958 Ⅰ期 2015.01至2015.11 剂量递增，最大剂量16 mg 晚期转移性癌症 3 G-FORCE-1 NCT02871843 Ⅰ期 2016.07至2018.05 推荐剂量4 mg 高级别胶质母细胞瘤 4 BRAINSTORM NCT02215512 Ⅰ/Ⅱ期 2015.02至2017.02 推荐剂量10 mg/m2 脑转移瘤全颅放疗 5 ROCKET NCT02096354 Ⅱ期 2014.06起 4 mg 三/四线转移性结直肠癌 6 QUADRUPLE THREAT NCT02489903 Ⅱ期 2015.06起 4 mg+自体静脉血12 ml 小细胞肺癌，EFGR突变的非小细胞肺癌，
高级别神经内分泌肿瘤，卵巢肿瘤7 PREVLAR NCT03515538 Ⅱ期 2018.07至2019.08 4 mg 口腔黏膜炎 8 REPLATINUM NCT03699956 Ⅲ期 2019.03起 4 mg 三线小细胞肺癌 
下载: 导出CSV
-
[1] NICHOLAS A S , LOUIS F C , PING L , MICHAEL P K, DAVID M R, et al. Methods of synthesizing and isolating N -(Bromoacetyl)-3, 3-Dinitroazetidine and a composition including the same[P]. Patent Application Publication, US 2011/0195947 A1. [2] NICHOLAS A S, LOUIS F C. , PING L, MICHAEL P K., DAVID M R, et al. Methods of synthesizing and isolating N-(Bromoacetyl)-3, 3-Dinitroazetidine and a composition including the same[P]. W. I. P. Organization, WO 2011/100090 A1. [3] ORONSKY B, GUO X N, WANG X H, et al. Discovery of RRx-001, a myc and CD47 downregulating small molecule with tumor targeted cytotoxicity and healthy tissue cytoprotective properties in clinical development[J]. J Med Chem, 2021, 64(11):7261-7271. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00599 [4] BEDNARSKI M D, OEHLER L R L M, KNOX S, et al. Cyclic nitro compounds, pharmaceutical compositions thereof and uses thereof: US8299053[P]. 2012-10-30. [5] ORONSKY B T, REID T, KNOX S J, et al. The scarlet letter of alkylation: a mini review of selective alkylating agents[J]. Transl Oncol, 2012, 5(4):226-229. doi: 10.1593/tlo.12187 [6] CAROEN S, ORONSKY B, REID T, et al. Superficial venous-associated inflammation from direct IV administration of RRx-001 in rats[J]. Int J Med Sci, 2022, 19(11):1628-1630. doi: 10.7150/ijms.76615 [7] CAROEN S, ORONSKY B, CARTER C, et al. Rationale and necessity for delivery of RRx-001, a Myc and CD47 antagonist, by intravenous blood mix[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2020, 17(6):741-742. doi: 10.1080/17425247.2020.1761787 [8] SCICINSKI J, ORONSKY B, TAYLOR M, et al. Preclinical evaluation of the metabolism and disposition of RRx-001, a novel investigative anticancer agent[J]. Drug Metab Dispos, 2012, 40(9):1810-1816. doi: 10.1124/dmd.112.046755 [9] SCICINSKI J, ORONSKY B, NING S C, et al. NO to cancer: the complex and multifaceted role of nitric oxide and the epigenetic nitric oxide donor, RRx-001[J]. Redox Biol, 2015, 6:1-8. doi: 10.1016/j.redox.2015.07.002 [10] ORONSKY B, CARTER C A, CAROEN S, et al. RRx-001, a first-in-class small molecule inhibitor of MYC and a downregulator of CD47, is an “erythrophagoimmunotherapeutic”[J]. Oncoimmunology, 2020, 9(1):1746172. doi: 10.1080/2162402X.2020.1746172 [11] JANI V P, ASARO R, ORONSKY B, et al. RRx-001 increases erythrocyte preferential adhesion to the tumor vasculature[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(9):4713. doi: 10.3390/ijms22094713 [12] ORONSKY B, SCICINSKI J, NING S C, et al. RRx-001, A novel dinitroazetidine radiosensitizer[J]. Invest New Drugs, 2016, 34(3):371-377. doi: 10.1007/s10637-016-0326-y [13] BAIRD L, DINKOVA-KOSTOVA A T. The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J]. Arch Toxicol, 2011, 85(4):241-272. doi: 10.1007/s00204-011-0674-5 [14] JAYABALAN N, ORONSKY B, CABRALES P, et al. A review of RRx-001: a late-stage multi-indication inhibitor of NLRP3 activation and chronic inflammation[J]. Drugs, 2023, 83(5):389-402. doi: 10.1007/s40265-023-01838-z [15] ORONSKY B, TAKAHASHI L, GORDON R, et al. RRx-001: a chimeric triple action NLRP3 inhibitor, Nrf2 inducer, and nitric oxide superagonist[J]. Front Oncol, 2023, 13:1204143. doi: 10.3389/fonc.2023.1204143 [16] ORONSKY B, SCICINSKI J, REID T, et al. RRx-001, a novel clinical-stage chemosensitizer, radiosensitizer, and immunosensitizer, inhibits glucose 6-phosphate dehydrogenase in human tumor cells[J]. Discov Med, 2016, 21(116):251-265. [17] LV Y, LV X T, ZHANG J H, et al. BRD4 targets the KEAP1-Nrf2-G6PD axis and suppresses redox metabolism in small cell lung cancer[J]. Antioxidants, 2022, 11(4):661. doi: 10.3390/antiox11040661 [18] ORONSKY B, CABRALES P, CAROEN S, et al. RRx-001, a downregulator of the CD47- SIRPα checkpoint pathway, does not cause anemia or thrombocytopenia[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2021, 17(4):355-357. doi: 10.1080/17425255.2021.1876025 [19] NIU S D, CHENG K X, JIA L Z, et al. Lineage tracing of mutant granulosa cells reveals in vivo protective mechanisms that prevent granulosa cell tumorigenesis[J]. Cell Death Differ, 2023, 30(5):1235-1246. doi: 10.1038/s41418-023-01132-1 [20] CABRALES P. RRx-001 acts as a dual small molecule checkpoint inhibitor by downregulating CD47 on cancer cells and SIRP-α on monocytes/macrophages[J]. Transl Oncol, 2019, 12(4):626-632. doi: 10.1016/j.tranon.2018.12.001 [21] GUO Y D, BAO Q Q, HU P, et al. Nanomedicine-based co-delivery of a calcium channel inhibitor and a small molecule targeting CD47 for lung cancer immunotherapy[J]. Nat Commun, 2023, 14(1):7306. doi: 10.1038/s41467-023-42972-2 [22] 陈昀. NLRP3炎症小体抑制剂的发现、药理机制及疾病干预策略研究[D]. 中国科学技术大学, 2021. [23] MA M, LI G Y, QI M H, et al. Inhibition of the inflammasome activity of NLRP3 attenuates HDM-induced allergic asthma[J]. Front Immunol, 2021, 12:718779. doi: 10.3389/fimmu.2021.718779 [24] ORONSKY B, KNOX S, CABRALES P, et al. Desperate times, desperate measures: the case for RRx-001 in the treatment of COVID-19[J]. Semin Oncol, 2020, 47(5):305-308. doi: 10.1053/j.seminoncol.2020.07.002 [25] HAMMOND T C, LEE R C, ORONSKY B, et al. Clinical course of two patients with COVID-19 respiratory failure after administration of the anticancer small molecule, RRx-001[J]. Int Med Case Rep J, 2022, 15:735-738. [26] GUO X N, WANG X H, SHEN S, et al. Subset analysis of safety and efficacy in Asian patients treated with RRx-001 across three clinical trials[J]. Am J Cancer Res, 2022, 12(9):4448-4457. [27] REID T, ORONSKY B, SCICINSKI J, et al. Safety and activity of RRx-001 in patients with advanced cancer: a first-in-human, open-label, dose-escalation phase 1 study[J]. Lancet Oncol, 2015, 16(9):1133-1142. doi: 10.1016/S1470-2045(15)00089-3 [28] REID T, ORONSKY B, CAROEN S, et al. Phase 1 pilot study of RRx-001 + nivolumab in patients with advanced metastatic cancer(PRIMETIME)[J]. Front Immunol, 2023, 14:1104753. doi: 10.3389/fimmu.2023.1104753 [29] FINE H, REID T, CAROEN S, et al. A multicenter, phase 1, dose escalation clinical trial(G-FORCE-1)of XRT, RRx-001 and temozolomide followed by temozolomide +/- RRx-001 in newly diagnosed glioblastoma[J]. Front Oncol, 2023, 13:1176448. doi: 10.3389/fonc.2023.1176448 [30] KIM M M, PARMAR H A, SCHIPPER M, et al. BRAINSTORM: a multi-institutional phase 1/2 study of RRx-001 in combination with whole brain radiation therapy for patients with brain metastases[J]. Int J Radiat Oncol, 2020, 107(3):478-486. doi: 10.1016/j.ijrobp.2020.02.639 [31] REID T R, ABROUK N, CAROEN S, et al. ROCKET: phase II randomized, active-controlled, multicenter trial to assess the safety and efficacy of RRx-001 + irinotecan vs. single-agent regorafenib in third/fourth line colorectal cancer[J]. Clin Colorectal Cancer, 2023, 22(1):92-99. doi: 10.1016/j.clcc.2022.11.003 [32] REID T, ORONSKY B, ABROUK N, et al. The small molecule NLRP3 inhibitor RRx-001 potentiates regorafenib activity and attenuates regorafenib-induced toxicity in mice bearing human colorectal cancer xenografts[J]. Am J Cancer Res, 2022, 12(4):1912-1918. [33] MORGENSZTERN D, ROSE M, WAQAR S N, et al. RRx-001 followed by platinum plus etoposide in patients with previously treated small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer, 2019, 121(3):211-217. doi: 10.1038/s41416-019-0504-8 [34] BONOMI M, BLAKAJ D M, KABARRITI R, et al. PREVLAR: phase 2a randomized trial to assess the safety and efficacy of RRx-001 in the attenuation of oral mucositis in patients receiving head and neck chemoradiotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2023, 116(3):551-559. doi: 10.1016/j.ijrobp.2022.12.031 [35] ORONSKY B, REID T R, LARSON C, et al. REPLATINUM Phase III randomized study: RRx-001 + platinum doublet versus platinum doublet in third-line small cell lung cancer[J]. Future Oncol, 2019, 15(30):3427-3433. doi: 10.2217/fon-2019-0317 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 5563
- HTML全文浏览量: 2310
- PDF下载量: 24
- 被引次数: 0
