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肝癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国特别高发，全球HCC患者超过半数在中国。2022年我国HCC发病率达36.77/10万人，位于恶性肿瘤第4位；总体病死率达31.65/10万人，居恶性肿瘤第2位[1]。HCC已然成为我国一项社会公共卫生问题，严重危害国民健康，给国民经济和社会发展带来沉重负担[2-4]。目前手术及肝移植可以临床治愈早期HCC，但多数患者诊断时已是晚期[5]。尽管免疫检查点抑制剂和小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂联合治疗法为晚期HCC患者带来了希望，但患者的中位生存期仅提高至19.2个月[6]。中医药治疗晚期HCC有其独特的优势，可以增强化疗、靶向、免疫治疗疗效，减轻毒副作用，改善症状，延长患者总生存期。因此运用中医药探索晚期HCC患者的治疗方案，对阻止该疾病的进一步发展，延长患者生存期具有重要的意义。
八宝丹起源于明代，至今有近400年的应用历史，是原国家食品药品监督管理总局允许使用天然麝香的特效药之一。八宝丹成分包含天然牛黄、天然麝香、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七等。既往研究已证实，八宝丹可用于急慢性肝炎、胆囊炎等肝胆系统疾病，具有清热利湿、祛黄解毒的功效[7-8]，并且八宝丹对HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有治疗效果[9-10]。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制慢性炎症介导的肝纤维化进而抑制HCC的发生，但八宝丹对于晚期HCC的治疗作用机制尚未明确[11]。因此探寻八宝丹对晚期HCC的作用机制可为中医药治疗HCC提供证据。
二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠模型是一个成熟的原发性HCC模型。DEN模型中HCC的发展过程与人类HCC相似，是一种非常合适研究HCC的生物工具[12]。本研究利用DEN大鼠观察八宝丹对HCC的影响，发现其能有效延缓HCC进展，但是作用机制尚不明确。由于八宝丹成分复杂多样，需要多组学分析技术探明八宝丹中有效药物成分与疾病的互作关系，因此本研究基于网络药理学和UPLC-MS方法，筛选八宝丹治疗HCC的有效化合物和潜在治疗靶点，构建“疾病－基因－药物”的多层次网络，揭示八宝丹调控疾病进展的潜在机制，为八宝丹的“老药新用”和HCC晚期患者的临床用药提供新思路。
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八宝丹胶囊（批号Z10940006，厦门中药厂有限公司）、甲醇（A452-4，Fisher）、乙腈（A998-4，Fisher）、甲酸（A117-50，Fisher）；DEN（245437, Sigma-Aldrich）；高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC I-Class HF，Water）、色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, Water）、PDA检测器（ACQUITY Premier PDA eλ，Water）；高分辨液质联用质谱仪（Thermo-Obritrap-QE，Thermo）。
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将32只SD大鼠（6~8周龄，180~200 g，雄性，SPF级）随机分为 4 组，每组8只，分别为：对照组、八宝丹组、DEN 诱导组（DEN组）、DEN+八宝丹组。DEN组和DEN+八宝丹组连续饲喂12周DEN溶液（95 μg/ml）, 对照组和八宝丹组饲喂灭菌水。八宝丹组不进行DEN诱导，从第12周开始予以八宝丹给药。DEN 诱导组，DEN饮水喂养大鼠持续12周，诱导HCC的发生，然后使用生理盐水灌胃，1次/2 d ，持续4周。DEN+八宝丹组，DEN诱导HCC发生后，八宝丹按照0.5 g/kg的剂量对实验动物进行灌胃，1次/2 d，持续4周（图1A）。实验结束后处死部分大鼠获取肝脏组织标本，剩余部分停药后继续观察生存期。
图 1 八宝丹对HCC大鼠的影响
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将八宝丹取出，用液氮研磨均匀后，称取约98.3 mg样本于1.5 ml离心管中；加入983 μl 甲醇-水溶液（V/V=3∶1，含混合内标，4 μg/ml），涡旋震荡1 min，加入钢珠；放入−40 ℃冰箱中预冷2 min后，在研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；冰水浴超声提取60 min，−40 ℃下静置30 min；离心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取全部上清液过0.22 μm的有机相滤膜；4 ℃下静置过夜，离心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液过0.22 μm的有机相滤膜置于内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析。本次实验的分析仪器为ACQUITY UPLC I-Class HF超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。色谱条件：色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱温：45 ℃；流动相：水（含0.1%甲酸）和乙腈，梯度洗脱信息详见表1；流速：0.35 ml/min；进样体积：5 μl；PDA扫描范围210~400 nm。质谱条件：离子源（HESI，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式）；数据采集模式为DDA；扫描方式为Full MS/dd-MS2（TOP 8）；质谱参数详见表2。
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间（t/min） 水（含0.1%甲酸）（%） 乙腈（%） 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压（U/V） 3 800 −3 000 毛细管温度（T/°C） 320 320 辅助气体加热器温度（T/ ℃） 350 350 鞘气流量（Arb） 35 35 辅助气体流速（Arb） 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围（m/z） 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10，20，40 10，20，40 -
八宝丹 UPLC-MS数据由上海欧易生物医学科技有限公司提供，根据八宝丹化学成分在210 nm 和 254 nm波长下的紫外吸收图初步确定其结构类型。质谱数据经Progenesis QI v3.0 软件（Nonlinear Dynamics, Newcastle, 英国）处理（基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化）获得八宝丹的质谱峰表。
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八宝丹的质谱峰表中化合的鉴定基于精确质量数、二级碎片以及同位素分布，并结合TCM数据库（上海欧易生物医学科技有限公司，中国）进行鉴定。在本研究中，质谱峰表中对各鉴定物质进行评分，满分80分，其中，一级质谱精确分子量匹配，20分；二级质谱碎片匹配，20分；同位素分布匹配，20分；保留时间匹配，20分。将化合物相对峰面积的总含量定为100%，得到定性定量结果数据矩阵，并规定峰面积的比值大于1%，总分大于55，一级分子量误差在1.4×10−6以内的化合物作为八宝丹的有效成分进行后续分析。
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根据前期筛选出的有效化学成分导入 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找与有效活性成分相对应的Smiles号，并将Smiles号导入 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）和SuperPred（https://prediction.charite.de/subpages）数据库进行有效活性成分对应靶点的预测，保留结合可能性1%以上或文献报道过与化合物相关的作用靶点。根据各成分相关基因富集情况，利用R（version 3.6.1）构建各组分之间互作网络。
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使用 GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库、OMIM（https://omim.org/）数据库和Therapeutic Target Database（https://db.idrblab.net/）筛选HCC对应靶点，以“Hepatocellular carcinoma”为关键词进行筛选。并根据文献比对，保留与HCC相关的靶点用于后续研究。
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根据前期有效成分相关靶点筛选和HCC相关靶点的选择，取交集进行后续分析。将共同靶点的数据导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）构建蛋白互作网络，再利用Cytoscape3.9.0软件，以介数中心数为参考，筛选出关键调控蛋白。
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将有效成分和HCC之间的共有靶点导入 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，设置物种为人，P<0.01，分别勾选 GO 分析中的生物过程、细胞组成 、分子功能以及Pathway 中的 KEGG 进行富集分析，提取结果后，应用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平台将富集分析结果可视化。
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将有效成分和HCC之间的共有靶点依次导入GEPIA2 （http://gepia2.cancer-pku.cn/）中，以182例TCGA数据库中保留的临床HCC患者的RNA测序数据为基础，分析共有靶点与患者生存期的相关性。
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大鼠被处死后，用磷酸盐缓冲盐水和 4% 多聚甲醛进行经心灌注。取肝脏组织进行病理评估。石蜡包埋后肝脏切成 5 µm 厚的切片。染色时将HCC组织石蜡切片，60 ℃烘烤固片30 min；脱蜡至水，并按照生产商的方案用苏木精-伊红染色，最后镜下观察各组织病理学情况。
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使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行方差分析，每次实验的定量数据以平均值±标准差表示，组间差异采用t检验。Kaplan-Meier 分析用于进行生存期分析。采用对数秩检验比较各组存活时间。以P<0.05为差异有统计学意义。
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在实验观察期间，对照组和八宝丹组的大鼠均存活，而DEN组平均生存期为17.1周，DEN+八宝丹组平均生存期为23周，是DEN组的1.35倍（图1B）。同时观察肝脏大体发现，对照组和八宝丹组肝脏组织未见异常；DEN 组肝脏组织中均出现大量肉眼可见肿瘤结节；而DEN+八宝丹组肝脏组织中虽然出现了部分肉眼可见的肿瘤结节，但大体形态上相较于DEN组损伤较轻（图1C）。通过对肿瘤结节的最大直径和数量测量统计发现DEN+八宝丹组肿瘤负荷和最大肿瘤直径显著小于DEN组（图1D）。同时，对各肝脏组织进行病理学评估和H&E染色结果发现，八宝丹组和正常肝脏组织组织排列紧密，未出现肝脏损伤，而DEN组出现明显的组织空泡化，组织间排列弥散，肝脏损伤严重。尽管DEN+八宝丹组大鼠肝脏组织相较于八宝丹组和正常对照大鼠出现了明显的炎症浸润和肝纤维化，但是，相较于DEN组的肝脏组织损伤较轻且组织排列较为紧密（图1E）。H&E染色结果表明，八宝丹对大鼠肝脏未发现实质性病理损伤，并且缓解了同期DEN大鼠的肝脏病理状态。上述结果表明，八宝丹能延缓DEN大鼠的生存期并减少肿瘤负荷，但是具体机制尚不明了。
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为进一步探索八宝丹对HCC的影响机制，本研究首先对八宝丹进行UPLC-MS中药化学成分检测。中药成分鉴定流程如图2A所示，将八宝丹颗粒进行溶解、研磨、过滤和提纯后上机检测。紫外吸收图谱发现，210 nm处皂苷类成分在该波长下有强吸收，254 nm处含有苯环、双键等结构的成分在该波长下有强吸收。然后通过基峰色谱图反应样品的整体信息，3次重复性检测结果可知该检测方法离子相应响度、保留时间重复性良好，由此说明本次实验仪器稳定、数据可靠。原始数据经Progenesis QI软件处理和TCM数据库进行定性后，共发现851个中药成分，保留9个主要活性成分供后续研究，分别是牛磺草胆酸盐、12-酮脱氧胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸、三七皂苷R1、环氧油酸和3α,7α-二羟基-12-羰基-5β-胆烷酸。将主要活性成分信息分别导入PubChem和Swiss Target Prediction数据库，共获得285个潜在作用靶点，并绘制出化合物之间的互作网络，发现八宝丹中主要化学成分之间关系密切，相互存在多个共有靶点（图2B）。在Therapeutic Target Database、GeneCards、OMIM数据库和文献中共筛选出与HCC相关的靶点637个，保留八宝丹与HCC共有相关性靶点16个（图2C）作为潜在调控分子。将潜在调控分子导入STRING数据库构建蛋白与蛋白间互作网络（图2D），再利用Cytoscape3.9.0软件，以介数中心数（网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目占最短路径数的比例）为参考，将潜在调控分子进行排序，介数中心数越大，圆形的直径越大，颜色越蓝，说明在该网络中的关联度就越高，反之圆形的直径越小，颜色越绿（图2E）。其中，潜在调控分子介数中心数排名前5的分别是：白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、过氧化酶增殖因子活化受体-γ（PPARG）和雌激素受体1（ESR1）。
图 2 八宝丹通过多化学成分和多靶点对原发HCC的影响
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为探索八宝丹调控HCC的潜在作用机制，本研究基于DAVID数据库将上述16个共有相关靶点进行GO及KEGG富集分析。GO富集分析显示802个生物过程、11个细胞组成、43个分子功能，KEGG通路富集分析共90条通路，展示排名前10的富集条目。
图3A提示八宝丹在生物过程中通过沉默细胞中mRNA的转录，抑制上皮样细胞的增殖和转录因子的结合调控HCC；图3B提示八宝丹有效化学成分在细胞层面上通过结合各种细胞器或细胞膜受体发挥作用；图3C提示八宝丹有效化学成分能调控转录因子的结合、细胞因子的分泌及细胞核的状态。图3D提示八宝丹调控HCC是通过多通路、多靶点之间的相互作用。最后在TCGA数据库中查询了共有相关靶点与HCC患者的临床相关性，在182例临床样本的调查中发现，3个基因的高表达提示着患者的总生存期较短，分别为ESR1 （Logrank P=0.000 69）、PPARG（Logrank P=0.000 74）和COL18A1（Logrank P=0.006），详见图3E~G，P值由Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验确定。
图 3 富集分析发现八宝丹临床上可能是通过多途径影响HCC
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HCC是一种典型的炎症相关癌症，近90%的HCC与病毒性肝炎、过度酒精摄入、非酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝引起的长期炎症相关。在HCC慢性炎症微环境中，先天免疫细胞和成纤维细胞被募集并激活至损伤部位分泌细胞因子和生长因子，有利于肿瘤细胞的增殖或抵消凋亡[6]。研究表明，NF-κB和JAK-STAT两条经典通路是促进HCC的关键炎症信号通路，抑制炎症通路的激活能有效抑制住HCC进一步进展[13]。八宝丹作为传统中药复方，临床上已发现对HCC、胰腺癌、胆囊癌等消化系统肿瘤性疾病疾也有着积极的治疗效果，但是具体机制尚不明了。本团队前期研究发现，八宝丹可以通过抑制炎症细胞因子分泌和减少肝前体细胞上TRL4的表达，从抑制肝前体细胞的肿瘤转化，进而抑制肿瘤发生[11]。因此本研究团队假设八宝丹减缓了原发性HCC的肿瘤进展。
在本研究中，通过观察八宝丹对DEN诱癌大鼠的影响，发现八宝丹可以延长DEN大鼠的生存期，并且缓解DEN导致的肝脏肿瘤负荷。但是，目前尚未有具体的机制阐明这一现象。为探索是八宝丹中何种中药成分发挥了作用，利用UPLC-MS技术检测出化学成分851个，鉴定出主要活性成分9个，其中大部分是人体胆汁酸中主要成分，也发现具有强抗炎作用的三七皂苷R1[14]，主要活性成分之间关系密切。共筛选出285个潜在作用靶点。在与HCC相关靶点取交集后，筛选出八宝丹调控HCC的16个潜在靶点。利用上述靶点构建了八宝丹“化学成分-潜在靶点”网络模型以及PPI网络，将潜在作用靶点进行排序，发现了HCC小鼠模型已验证能加速HCC的发展并影响肿瘤的侵袭性免疫信号IL-6和TNF[15]；HCC中的显性突变驱动因子TP53和RB1[16]；与HCC炎症相关的信号分子STAT3；与肿瘤细胞增殖相关的分子MTOR和AFP[17]。
GO富集分析结果提示，八宝丹调控HCC在生物过程上参与miRNA对基因的沉默负调控、转录后miRNA对基因的沉默负调控、RNA对基因的沉默负调控等；在细胞组分上富集到RNA聚合酶Ⅱ转录调节因子复合物、吞噬作用相关受体、细胞膜受体等词条；在分子功能上富集到与转录起始因子结合，激活核受体，与配体结合激活转录因子活性等。KEGG信号通路提示，八宝丹参与了癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、HIF-1信号通路、化学致癌受体激活、EGFR络氨酸激酶抑制剂耐药等通路。TCGA数据库中发现，ESR1、PPARG和COL18A1高表达与HCC患者总生存期密切相关。据报道，PPARG高表达可激活WNT/CTNNB1信号通路，从而维持肿瘤细胞干性特征，促进癌症进展[18]。人类HCC临床样本调查和组织染色也证实，ESR1可通调控miR-141-3p /GSN信号影响原发性HCC进展[19]；肌成纤维细胞分泌的胶原α-1（ⅩⅤⅢ）链（COL18A1）可促进肿瘤转移，加速HCC进展[20]。因此TCGA结果提示，八宝丹可能是通过调控ESR1、PPARG和COL18A1来延长原发性HCC患者的生存期。
综上所述，本研究证实了八宝丹对治疗原发性HCC的积极影响，并且发现9种八宝丹的有效活性成分。还利用网络药理学的研究方法，分析揭示八宝丹可能是通过多靶点、多通路来调控原发HCC，并结合已有的研究进行分析验证，提出新的视角与思路，为后续的实验研究提供参考。
Potential mechanism of Babao Dan in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology
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摘要:
目的 基于网络药理学探讨八宝丹对原发性肝癌（HCC）影响的潜在机制。 方法 首先利用二乙基亚硝胺诱导的原发性HCC大模型，观察八宝丹对HCC的影响；然后利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）检测八宝丹中的有效成分，再在Swiss Target Prediction数据库等预测八宝丹有效成分的潜在作用靶点。运用GeneCards、OMIM和Therapeutic Target Database筛选HCC对应靶点，取交集后获得八宝丹与HCC的共同靶点。使用Cytoscape软件和STRING数据库绘制蛋白与蛋白间互作网络，筛选出八宝丹调控HCC的关键分子。利用DAVID数据库对有效作用靶点进行GO及KEGG富集分析。最后在TCGA数据库验证关键分子与HCC患者的临床相关性。 结果 八宝丹可延缓HCC大鼠肿瘤进展。UPLC-MS检测出八宝丹中化学成分851个，主要活性成分9个，作用靶点285个；筛选出HCC靶点637个，八宝丹调控HCC的靶点16个。GO富集分析显示802个生物过程、11个细胞组成、43个分子功能，KEGG通路共90条。TCGA相关性分析发现3个关键分子与HCC患者生存期相关。 结论 通过HCC大鼠模型发现，八宝丹可显著延长HCC大鼠的生存周期并减少肿瘤负荷，通过UPLC-MS及网络药理学方法初步预测八宝丹调控HCC的作用机制，表明八宝丹具有多成分、多通路、多靶点作用原发性HCC的特点，为进一步相关实验研究提供参考。 -
关键词:
- 原发性肝癌 /
- 八宝丹 /
- 网络药理学 /
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 作用机制
Abstract:Objective To explore the potential mechanism of Babao Dan on primary liver cancer based on network pharmacology. Methods First, the diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma rat（HCC）model was used to observe the effects of Babao Dan. Then, the effective components in Babao Dan were detected by UPLC-MS, and the potential target sites of these effective components were predicted in the Swiss Target Prediction databases, etc. The corresponding target sites for HCC were screened using GeneCards, OMIM and Therapeutic Target Database, and the common target sites between Babao Dan and HCC were obtained after getting the intersection. The protein-protein interaction network was drawn by Cytoscape software and the STRING database, and the key molecules regulating HCC by Babao Dan were screened out. The effective target sites were subjected to GO analysis in the DAVID database and enrichment analysis in the Pathway’s KEGG. Finally, the clinical relevance of key molecules to liver cancer patients was verified by the TCGA database. Results Babao Dan could slow down the tumor development. 851 chemical components were detected in BaBao Dan by UPLC-MS , 9 major active components and 285 target sites were identified. 637 hepatocellular carcinoma-related targets were screened out, and 16 targets of Babao Dan regulating HCC were identified. GO enrichment analysis showed 802 biological processes, 11 cell compositions, and 43 molecular functions, while KEGG pathway enrichment analysis identified a total of 90 pathways. Correlation analysis of TCGA identified three key molecules associated with the survival of liver cancer patients. Conclusion In the primary rat liver cancer model, Babao Dan was found to significantly prolong the survival of cancer-induced rats and reduce tumor burden. The initial prediction of the mechanism by which Babao Dan regulating liver cancer was made through UPLC-MS analysis and network pharmacology methods, indicating that Babao Dan has the characteristics of multi-component, multi-pathway, and multi-target regulation of primary liver cancer, which could provide a reference for further relevant experimental research. -
Key words:
- hepatocellular carcinoma /
- Babao Dan /
- network pharmacology /
- UPLC-MS /
- mechanism of action
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1. GMP检查总体情况概述
1.1 企业数量及其分布地区
截至2018年12月31日，安徽省中药饮片生产企业有226家，分布于安徽省内16个市区，其中，亳州市176家，阜阳市16家，占全省中药饮片生产企业总数比重分别为78%和7%。
1.2 检查结果
2014−2018年安徽省共组织涉及中药饮片生产范围的药品GMP现场检查293家次。其中，通过GMP检查243家次，未通过GMP检查50家次，不合格率为17.10%，详见表1。
表 1 2014−2018年中药饮片GMP认证检查结果（厂家/次数）年份 年检查总次数 认证通过 未认证通过 不合格率（%） 2014 58 51 7 12.10 2015 74 64 10 13.50 2016 49 43 6 12.20 2017 45 30 15 33.30 2018 67 55 12 17.90 总计 293 243 50 17.10 2. 缺陷项目构成情况
对50家次未通过的GMP现场检查报告进行分析，共发现严重缺陷66项，主要缺陷134项。依据《药品生产现场检查风险评定指导原则》，其中5家次GMP现场检查存在多项主要缺陷相互关联，经综合分析表明，质量管理体系中某一系统不能有效运行，合并升级为严重缺陷项。
2.1 严重缺陷项目
依据药品GMP及中药饮片等附录对缺陷进行分类，发现严重缺陷条款数量最多的GMP章节为总则（15项），其后依次为机构与人员（11项）、质量管理（9项）、质量控制与保证（8项）等，其中，涉及中药饮片附录章节依次为原则（2项），质量管理（1项），见表2。
表 2 严重缺陷项目分布情况GMP章节 严重缺陷
（项）涉及GMP
条款出现频次
(次)所占比例
（%，n=66）总则 15 第2、4条 151 22.73 质量管理 9 第7、9、11、12、14条 92 13.64 机构与人员 11 第18、20、25条 113 16.67 厂房与设施 5 第38、40、46条 5 7.58 物料与产品 1 第103条 1 1.52 确认与验证 2 第138、140条 2 3.03 文件管理 5 第150、159、163、175条 5 7.58 质量控制与保证 8 第217、222、223、243条 84 12.12 中药饮片附录 3 第7、51条 3 4.55 计算机化系统附录 2 第14条 2 3.03 合并升级 5 5 7.58 注：1 第2条出现频次为6次，第4条出现频次为9次；2 第12条出现频次为4次；3 第18条出现频次为6次，第20条出现频次为4次；4 第223条出现频次为4次。 对66项严重缺陷汇总分析发现，企业存在生产检验记录和数据不真实，在未通过检查的场所生产中药饮片，人员、设施、设备与企业的生产经营规模不完全适应，存在关键岗位人员兼职或者不能有效履行职责，生产记录或原始数据不能追溯，验证生产品种没有涵盖申请认证范围，物料管理混乱，许可检查中发现的缺陷项目未进行整改等问题。
2.2 主要缺陷项目
依据GMP正文及中药饮片等附录对134项主要缺陷进行分类，发现主要缺陷条款数量最多的GMP章节为机构与人员（22项），其后依次为质量控制与保证（21项）、文件管理（19项）、中药饮片附录（19项）、确认与验证（16项）、生产管理（8项）等，其中，涉及中药饮片附录章节依次为人员（1项）、厂房与设施（5项）、物料与产品（1项）、确认与验证（6项）、文件管理（3项）、生产管理（1项）、质量管理（2项），见表3。
表 3 主要缺陷项目分布情况GMP章节 主要缺陷（项） GMP条款 出现频次(次) 所占比例（%，n=134） 质量管理 6 第12、13、14条 6 4.48 机构与人员 22 第17、18、22、23、24、25、27条 221 16.42 厂房与设施 3 第38、44、47条 3 2.24 设备 5 第81、84、86、90条 5 3.73 物料与产品 7 第103、106、112条 7 5.22 确认与验证 16 第139、140、142、143、144、148、149条 162 11.94 文件管理 19 第150、152、155、158、159、161、164、170、173、180、183条 193 14.18 生产管理 8 第184、188、191、196条 84 5.97 质量控制与保证 21 第217、220、222、223、225、226、228、230、241、242、248、250条 215 15.67 自检 2 第309条 2 1.49 中药饮片附录 19 第11、23、24、25、34、39、40、41、43、44、47、52条 19 14.18 确认与验证附录 2 第23、25条 2 1.49 计算机化系统附录 3 第14、16条 3 2.24 取样附录 1 第5条 1 0.75 注：1 第18条出现频次为6次，第27条出现频次为7次；2 第139、140条出现频次均为4次；3 第150条出现频次为4次；4 第184条出现频次为5次；5 第223条出现频次为6次。 对134项主要缺陷汇总分析发现，企业存在以下问题：关键岗位人员职责不清；对某方面的操作知识了解不够，未能完全履行职责；开展培训的内容针对性不强，与该岗位的要求不相适应；缺乏对照品或对照药材不能对品种进行全项检验；偏差未采取有效的纠正和预防措施；未对检验方法进行确认，不能保证检验结果的准确性；工艺规程缺少关键的控制参数；生产检验记录不及时、不准确；确认与验证工作不充分等。
3. 存在的主要问题
从缺陷项目的构成情况和频次可以看出，缺陷相对集中在质量管理及质量控制与保证、机构与人员、文件与生产管理、确认与验证、物料与产品5个方面。以上统计数据一定程度上反映了目前中药饮片生产企业实施新修订药品 GMP过程中普遍存在的一些问题。
3.1 质量管理体系不能有效实施
在GMP检查过程中发现，部分中药饮片企业法人和负责人思想重视程度不够，法律意识淡薄，社会责任感不强，认为中药饮片标准不高也不会产生安全问题，忽略了饮片是用于临床的药品。这类中药饮片生产企业在执行GMP的各个环节中，违反GMP要求的情况频繁发生，如在GMP车间外生产中药饮片；不按炮制工艺进行生产；生产检验记录和数据不真实，质量把关流于形式，提升企业法人和负责人法律意识是保证中药饮片质量的基石。
3.2 不重视人才与培训
GMP现场检查过程中，多次发现关键人员生产负责人和质量负责人实际履职能力不足，采购、验收、仓储以及检验人员不熟悉药材的分类种属，药材鉴别能力较弱，检验人员检验基本技能差。对药品生产、质量有关的关键岗位人员培训不到位，培训次数少、时间短。另外，培训目的性不强，培训形式单一，内容简单，不分层次和岗位，培训效果不理想，同时也未对培训效果进行评估。企业还未认识到在药品生产中“人、机、料、法、环”最关键的生产要素是人，只有保证有足够的训练有素的人员，才能使质量管理体系顺利运行。
3.3 文件与实际生产结合不足
重生产、轻管理的现象还是普遍存在，企业制订的文件缺乏可操作性，工艺规程未根据工艺验证内容进行修订，批记录设计不合理，如缺少工艺参数、设备编号、生产操作过程等信息；记录填写、修改不规范。原因是企业的负责人及质量管理人员对文件管理的重要性认识不足，特别是质量保证人员没有充分发挥其在企业生产中的管理作用，使相关受控文件没有得到有效的执行。
3.4 对确认与验证认识不足
从目前来看，确认与验证仍然是企业的一个薄弱环节。检查中发现多数企业在验证工作中带有盲目性或应对性。为了认证而验证，方案及验证内容粗糙，有些仅做一组数据，没有重现性，验证的结果不能证明设备操作的可靠性和工艺规程的合理性。
3.5 中药材供应商的审计流于形式
部分企业的中药材供应商管理不完善，供应商的审计走形式，供应商档案信息过于简单，没有对直接从农户购入中药材质量进行评估并建立质量档案，不能从物料源头抓起，保证药品的质量。
4. 做好中药饮片GMP 生产和监管工作的建议
4.1 深入贯彻新修订《药品管理法》落实企业等各方责任
必须全面提升企业法人和负责人法律意识，药品生产企业是药品质量的责任主体，必须履行药品生产经营的各项法律法规和技术规范，必须对自己生产经营的产品质量安全承担法律责任，在强化责任中落实“四个最严”。
2019年颁布实施的新修订的《药品管理法》对药品违法行为处罚等都作出更严格的要求。一是切实“处罚到人”。明确对严重影响质量安全的违法行为，在对违法主体依法处罚的同时，对其法人、主要责任人、直接负责的主管人员和其他责任人员也予以处罚，包括没收违法行为发生期间其所获收入、罚款、一定期限甚至终身禁业，并可以处以拘留。二是提高财产罚幅度，处罚额度全面提升。三是专条规定刑事责任。设专条强调药品违法行为构成犯罪的，要依法追究刑事责任，立场鲜明地保持对药品安全犯罪行为的强力震慑和高压态势[1]。
4.2 注重引进中药饮片生产和质量管理人才与实际培训效果
药品生产各要素中最关键的要素是人，尤其是生产负责人和质量负责人。由于中药材品种繁多、来源复杂，各地用药习惯不同，药典和地方规范炮制过程时有不同，同物异名、同名异物的现象多，因此，中药材的验收、鉴别、检验以及中药饮片的炮制生产过程是一项技术性、经验性很强的工作[2]。2010版中药饮片附录对生产和质量管理部门负责人专业、学历、从业经验、年限做出明确要求，要求质量保证和控制人员具备中药材和中药饮片质量控制和鉴别真伪优劣的实际能力，要求采购、仓储验收人员明确中药材鉴别要求以及储存养护知识。
企业应积极引进中药生产和质量管理专业人才，制定切实可行的培训计划，针对不同岗位、不同层次的人员开展培训。培训内容包含法律法规、专业知识、操作技能等，让员工明白做什么、怎么做、达到什么标准。培训是提高企业员工素质的有效途径和手段，只有积极开展注重实效的培训，使最基层的员工到高管层全体人员真正理解GMP的精髓，才能真正执行好GMP，更好地保证产品质量。
4.3 建立符合自身实际的文件体系与保证质量体系有效运行
一个有效的文件管理体系能够很好地指导生产实践。质量管理文件的制定者需深刻理解GMP条款，基于风险管理和企业实际，反复修订文件，确保系统文件具有规范性、系统性和可操作性，文字表达应清晰易懂，确保所有执行人员能获得相关岗位工作的详细指令并遵照执行。对于工艺规程和操作规程中的关键参数，要经过充分验证，确定关键控制点，并保证生产和质量全过程的记录可追溯，确保质量体系在企业中有效运行[3]。
4.4 从源头抓起加强中药材供应商的审计管理
中药材质量直接影响中药产品制剂，中药饮片质量优劣直接影响临床疗效，其供应商的选择和管理就显得尤为重要。中药生产企业应对中药材供应商做好供应商审计，形成合格供应商目录，对于发现不符合要求且有作假、掺假、以次充好的，取消其供货资格。为确保药品质量，中药饮片生产企业必须建立良好的物料管理体系，从源头抓起，保证药品的质量。
4.5 有针对性做好生产管理工作
通过对缺陷项目进行统计分析不难发现，部分缺陷项目属于“细节问题”，不被人们所重视，往往正是这些“细节问题”增加了药品质量风险事件的发生率。企业必须按照法定标准和各省、自治区、直辖市中药炮制规范制定工艺规程，并按照工艺规程编写标准操作规程和批生产记录，在生产过程中，及时填写批生产记录、数据完整、内容真实，由操作人及复核人签字，控制好生产过程中每一个环节[4]。
4.6 统一检查判定尺度，加强中药饮片生产监管
中药饮片GMP监管工作是一项对检查员工作技巧性、专业性、原则性较高的工作。这就需要充实人员，建立职业化检查员队伍，有针对性的加强培训，提高对GMP检查工作的认知水平，加深对GMP标准的理解，统一检查尺度[5]。
5. 结语
新修订的GMP已实施了10年。我国从GMP认证发展到GMP的持续符合性监管，提升的是管理理念，不变的是GMP在药品生产中的重要作用。中药饮片生产企业应提高法律意识，加强诚信建设，注重人员培训，根据中药饮片的生产特点，真正将GMP的思想贯彻到实处，提高硬件配置水平，建立规范的文件体系并控制实际执行情况，持续合规生产，最大程度地降低药品生产风险，而GMP监管应突出专业性和职业化，切实保证中药饮片质量安全。
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图 1 八宝丹对HCC大鼠的影响
A. 动物模型的构建与八宝丹干预策略机制图；B. Kaplan-Meier总生存曲线；C. 各组间代表性肝脏大体观，黄色箭头指示肿瘤结节；D. 定量分析DEN组和DEN+八宝丹组大鼠肝组织肿瘤结节数和最大肿瘤结节直径（mean±SD，n=3，**P<0.01，与DEN组比较）；E. H&E染色各组间代表性肝脏组织切片
图 2 八宝丹通过多化学成分和多靶点对原发HCC的影响
A. 八宝丹检测流程示意图及基峰色谱图（红、蓝、绿色表示三针技术重复）；B. 八宝丹中有效中药成分相互作用玹图；C. 韦恩图显示八宝丹与HCC共有相关性靶点；D. 基于STRING数据库绘制的蛋白与蛋白间互作网络；E. 基于介数中心数为参考绘制的蛋白与蛋白间互作网络
图 3 富集分析发现八宝丹临床上可能是通过多途径影响HCC
A. 生物过程富集分析柱状图；B. 细胞组分富集分析柱状图；C. 分子功能富集分析气泡图；D. KEGG富集分析花瓣图；E. ESR1与HCC患者总生存期的关系图；F. PPARG与HCC患者总生存期的关系图；G. COL18A1与HCC患者总生存期的关系图
表 1 八宝丹梯度洗脱信息
时间（t/min） 水（含0.1%甲酸）（%） 乙腈（%） 0 95 5 2 95 5 4 70 30 8 50 50 10 20 80 14 0 100 15 0 100 15.1 95 5 16 95 5 
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表 2 Thermo-Obritrap-QE质谱参数信息
参数 正离子 负离子 喷雾电压（U/V） 3 800 −3 000 毛细管温度（T/°C） 320 320 辅助气体加热器温度（T/ ℃） 350 350 鞘气流量（Arb） 35 35 辅助气体流速（Arb） 8 8 S透镜射频水平 50 50 质量范围（m/z） 100~1 200 100~1 200 全质谱分辨率 70 000 70 000 串联质谱分辨率 17 500 17 500 质谱仪二级碎裂能量 10，20，40 10，20，40
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