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肝纤维化是由肝炎病毒、酒精摄入过量或代谢紊乱引起的急性/慢性肝损伤的一种病理伤口愈合反应，也是慢性肝病发病率和病死率高的主要原因[1, 2]。肝纤维化的特点是I 型胶原和纤维连接蛋白等细胞外基质（ECM）成分的过多聚集，形成纤维疤痕扭曲肝脏结构，最终造成肝脏器官功能损伤[2]。研究显示，肝星状细胞（HSCs）的过度激活是肝纤维化进程中的关键环节，也是肝纤维化防治研究的重要靶点[3, 4]。
全反式维甲酸（ATRA）是维生素A主要的生物活性形式，已是急性早幼粒细胞白血病的标准治疗方案[5]。近期研究证实，ATRA可逆转HSCs的活化，并对肝纤维化具有抑制作用，但其具体机制尚未完全阐明[6]。本文拟在细胞水平探索ATRA抑制HSCs增殖及活化的作用和机制，为ATRA的临床应用提供理论和实验基础。
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HSCs系LX-2细胞和培养基购自上海中乔新舟生物科技公司。胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。血小板源性生长因子（PDGF-bb）、ATRA购自美国MedChemExpress公司。RNAiso试剂，逆转录和定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。CCK-8、活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）等检测试剂盒购自上海碧云天生物科技公司。抗α-SMA、Collagen I、NRF2和LC3的抗体购自武汉三鹰生物科技公司；抗HO-1、ATF4、Beclin 1和GAPDH的抗兔购自武汉博士德生物科技公司。辣根过氧化物酶及FITC标记的二抗购自美国thermo Fisher Scientific公司。
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HSCs系LX-2细胞解冻后，在DMEM培养基（含2%FBS），37 ℃，5%CO2条件下生长，每2 d更换一次培养基，细胞融合度达到85%以上时传代培养。以含PDGF-bb（10 ng/ml）的DMEM培养基作为诱导培养基；ATRA以5 μmol/L的浓度刺激。
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细胞生长活力通过CCK-8法检测。以每孔2×103个细胞的密度将LX-2细胞接种于96孔培养板，培养过夜。分别在常规培养基（含10%FBS）和PDGF-bb诱导培养基中培养，并添加ATRA（5 μmol/L）刺激。培养目标时间后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，继续培养1 h，轻轻拍动培养板充分混匀后，在酶标仪上测定450 nm的吸光度（A），并绘制细胞生长活力曲线。
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以每孔5×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板（预置细胞爬片），培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，以4%的多聚甲醛固定，并经Triton X-100（0.1%）透化10 min，随后经1%的BSA封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育后，加入FITC标记的二抗，避光孵育1 h。加入DAPI染色1 min，以PBS-T缓冲液清洗后，用抗淬灭封片剂封片，于荧光倒置显微镜下观察并拍照。
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以每孔2×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于12孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，利用RIPA试剂提取总蛋白。以20 μg总蛋白作为上样量，经SDS凝胶电泳分离后，转至甲醇预处理的PVDF膜。以5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜孵育后，加入辣根过氧化物酶标记二抗，常温孵育1 h。用TBS-T缓冲液清洗3次，经显色后在凝胶成像仪上观察并拍照记录。
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以每孔2×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于12孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h，利用trizol试剂提取总RNA。以200 ng总RNA为模板，逆转录成互补DNA（cDNA），反应程序为37 ℃，10 min，85 ℃，5 s。以稀释后的cDNA为模板进行实时定量PCR反应，反应程序为95 ℃，15 s；56 ℃，20 s；72 ℃，20 s，共40个循环。以GAPDH基因作为内参，每个样品重复3次，经2−△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。
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细胞内ROS利用DCFH-DA荧光探针检测。以每孔1×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h。去除培养液并加入100 μl含DCFH-DA（10 μmol/L）的无血清培养基，继续孵育20 min。用无血清培养基清洗3次后，在荧光显微镜下观察并拍照记录。
以每孔1×105个细胞的密度将LX-2细胞接种于6孔培养板，培养过夜后以不同方式刺激培养48 h。细胞内GSH和MDA水平根据试剂盒说明书进行检测，计算总蛋白中GSH和MDA的含量（nmol/mg）。
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双荧光自噬流通过转染自噬双标腺病毒（pAd-mRFP-GFP-LC3）后检测。以每孔1×104个细胞的密度将LX-2细胞接种于24孔培养板，培养过夜。将腺病毒转染细胞后，以不同方式刺激培养48 h，即在荧光显微镜下分别观察红色及绿色荧光信号并拍照记录。自噬激活后，自噬体与溶酶体融合后绿色荧光发生淬灭，红色荧光增强。
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所有数据均使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，满足正态分布的计量数据以（
$ \bar x \pm s $ ）表示。组间差异以独立样本t检验比较分析，以P<0.05说明差异具有统计学意义。 -
如图1A所示，常规培养条件下，5 μmol/L的ATRA处理48 h和72 h后的HSCs生长活力为对照组的（84.5±4.8）%和（86.7±3.0）%，具有一定的抑制作用。如图1B所示，在PDGF-bb诱导条件下，5 μmol/L的ATRA处理48 h和72 h后的HSCs生长活力为对照组的（52.4±3.0）%和（57.6±2.0）%，具有显著的抑制作用（P<0.01）。
图 1 ATRA对HSCs生长活力的影响（n=5）
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免疫荧光结果如图2A所示，与对照组相比，PDGF-bb刺激的HSCs中α-SMA的绿色荧光信号较强，而ATRA处理后，α-SMA荧光信号显著降低。蛋白质免疫印迹的结果如图2B所示，与对照组相比，PDGF-bb刺激的HSCs中α-SMA和Collagen I的蛋白表达明显增加，而ATRA处理后，α-SMA和Collagen I蛋白表达明显降低。
图 2 ATRA对PDGF-bb诱导HSCs活化的影响
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ROS的检测如图3A所示，PDGF-bb刺激后HSCs中的荧光强度明显强于对照组，而ATRA处理后荧光强度明显降低，提示ATRA抑制HSCs中ROS的生成。如图3B所示，PDGF-bb刺激后，HSCs中GSH的含量明显低于对照组（18.82±1.83 nmol/mg vs. 46.45±1.69 nmol/mg），MDA的含量则明显高于对照组（13.46±1.43 nmol/mg vs. 5.45±0.47 nmol/mg）；ATRA处理后GSH的含量明显升高（32.60±2.23）nmol/mg，MDA的含量则明显降低（9.56±0.34）nmol/mg。
图 3 ATRA对HSCs氧化应激的影响
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实时定量PCR的检测结果如图4A所示，ATRA处理后HSCs中抗氧化基因NRF2、HO-1和ATF4的表达明显增加（P<0.01），分别是PDGF-bb组的（2.53±0.15）倍、（3.34±0.12）倍和（2.58±0.10）倍。蛋白质免疫印迹的结果如图4B所示，NRF2、HO-1和ATF4的蛋白表达在ATRA处理后也明显增加。
图 4 ATRA对HSCs中抗氧化基因表达的影响
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蛋白质免疫印迹的结果如图5A所示，ATRA处理后HSCs中自噬标志蛋白Beclin 1的表达和LC3 II/I均明显减少。双荧光自噬流的检测结果如图5B所示，ATRA处理后HSCs中红色荧光信号显著降低，绿色荧光信号明显增强，自噬流信号显著降低。
图 5 ATRA对HSCs自噬活力的影响
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目前，还没有特定的抗纤维化疗法来预防或逆转肝纤维化，现有的治疗方案旨在去除潜在的致病因子或紊乱，但也证明了肝纤维化的潜在可逆性[7]。研究证实，HSCs是主要的肝胶原生成细胞，并被认为是肝纤维化的主要效应细胞[8]。在健康肝脏中，HSCs位于窦周间隙，处于静止状态；当受到损伤或刺激时，HSCs会对各种促纤维化信号做出反应，如来自受损肝细胞的产物、来自Kupffer细胞的生长因子和细胞因子、重构的ECM以及肝外信号等[9]。HSCs的活化涉及多个进程，包括细胞死亡、衰老和恢复静止状态等。在此过程中，HSCs会失去其特有的细胞质脂滴，并转分化为肌成纤维样细胞，并合成ECM成分（如胶原纤维I型和III型），增殖、收缩和迁移等能力增强，并具有促炎作用。HSCs活化的作用机制和干预是肝纤维化防治研究的重要内容。
静息状态HSCs中富含的脂滴，其主要成分是甘油三酯和维生素A。脂滴脱落被认为是HSCs活化的形态学标志，但其生物学作用仍被广泛研究[10-12]，作为维生素A的主要代谢产物，ATRA被发现广泛参与肝纤维化以及肝癌等的生物学过程[13, 14]。研究发现，ATRA能通过抑制硫氧还蛋白互用蛋白的表达，改善TGF-β诱导的HSCs的活化和维生素A缺乏诱导的肝纤维化[6]。目前的研究证实，ATRA 通过与 RAR（α、β、γ）或 PPARβ/δ 起作用，但这两组受体的生物效应在某些进程中却完全相反[15]，提示ATRA抗肝纤维化的作用机制未完全阐明。还有研究发现，纤维化药物对HSCs的激活最终会导致这些细胞的衰老，尽管有助于纤维化的逆转，但也可能会导致肝癌的发生[16]。因此，ATRA作为抗肝纤维化潜在药物的应用潜能仍需深入探索和验证。
研究证实，氧化应激与肝纤维化之间存在密切关系，当肝脏受到氧自由基的攻击时，机体抗氧化防御系统的平衡就会被打破，从而导致氧化应激[17, 18]。MDA是脂质过氧化的主要代谢产物，过量时会严重破坏细胞膜结构，也被认为是肝脏中自由基的间接指标[19]。GSH是哺乳动物细胞中最主要的自由基清除剂，广泛分布于包括肝脏在内的多个器官。研究发现，GSH可保护肝细胞免受各种自由基的侵害，包括ROS、脂质氢过氧化物、异生物毒物和重金属[20]。因此，调节MDA和GSH水平有助于控制氧化应激，最终可能有助于抑制肝纤维化。有研究报道，抑制氧化应激显著降低MDA水平，提高GSH水平，对CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化具有明显的保护作用[21]。本课题研究发现ATRA处理促进了HSCs中抗氧化基因的表达，造成细胞中GSH的增加和MDA的降低，减少细胞内ROS的水平，缓解了PDGF-bb诱导的HSCs氧化应激，研究结果提示，以氧化应激为靶点可能是肝纤维化防治的潜在策略。
自噬是真核细胞消除一次性或有潜在危险的细胞质物质的一种新陈代谢过程，可以消除有缺陷的蛋白质和细胞器、细胞内的病原体，防止异常蛋白质的积累，在许多疾病的病理过程中发挥着积极作用[22]。越来越多的证据表明，肝细胞和非实质性细胞（HSCs、Kupffer 细胞等）的自噬反应对肝脏的生理功能至关重要[23]。近年来，HSCs自噬成为肝纤维化研究领域的热点，其调控机制日益受到关注。研究显示，自噬水平的增加可加速HSCs中脂滴的降解，为HSCs的激活提供能量支持[24, 25]。降低HSCs自噬活性显著抑制其活化，降低小鼠的肝纤维化程度[26]。本课题的结果证实，ATRA能抵抗PDGF-bb诱导的HSCs自噬水平的增加，这可能是ATRA抑制HSCs活化的分子机制之一。
HSCs是目前研究药物代谢和毒理的重要工具，也是研究肝纤维化的绝佳模型[27]。HSCs具有高度的可塑性，在有害刺激下会改变其表型和代谢，并产生大量ECM成分来替代受伤细胞，生成纤维化疤痕[28]。在各种HSCs细胞系中，LX-2是目前广泛使用的细胞类型[29]。研究发现，LX-2细胞会根据培养基中FBS的浓度改变其代谢，从而诱导基因的差异表达。在低浓度FBS下，LX-2细胞呈静止样表型；在高浓度 FBS下，细胞呈肌成纤维细胞样表型，产生ECM成分[30]。本课题研究发现，PDGF-bb可诱导LX-2细胞向肌成纤维细胞样表型分化，表现为高增殖水平，且高表达α-SMA和Collagen I，而ATRA的处理显著降低细胞增殖能力并抑制α-SMA和Collagen I的表达，表明ATRA具有抵抗HSCs活化的潜在功能。
本课题在细胞水平探索了ATRA对HSCs激活的作用和潜在机制。ATRA促进抗氧化基因的表达，降低PDGF-bb诱导的HSCs氧化应激及自噬活力，抑制了HSCs的激活。研究结果证实了ATRA对肝纤维化防治的潜在应用。需要注意的是，自噬活性的激活存在“双刃剑”作用，ATRA对HSCs自噬活性的调节还需要进行剂量和分子机制等方面的深入研究。
Exploration of the role and mechanism of all-trans retinoic acid on activation and oxidative stress of hepatic stellate cell
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摘要:
目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）对肝星状细胞（HSCs）活化及氧化应激的作用和潜在机制。 方法 应用10 ng/ml的血小板源性生长因子（PDGF-bb）诱导HSCs活化，以5 μmol/L剂量的ATRA处理48 h。检测细胞生长活力和表型标志物表达的变化，评价ATRA对HSCs活化的影响；检测细胞内活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）、抗氧化基因表达的变化，评价ATRA对HSCs氧化应激的影响；检测自噬标志物表达和自噬流的变化，评价ATRA对HSCs自噬活性的影响。 结果 与PDGF-bb组相比，ATRA处理的HSCs生长活力显著降低（P<0.01），α-SMA和Collagen I蛋白的表达明显减少（P<0.01），细胞内ROS和MDA显著减少（P<0.01），GSH显著增加（P<0.01），抗氧化基因NRF2、HO-1和ATF4的表达明显增加（P<0.01）；同时自噬标志物Beclin 1和LC3 II/I的表达明显减少（P<0.01），自噬流信号显著降低。 结论 ATRA显著抑制PDGF-bb诱导的HSCs活化，降低HSCs的氧化应激水平和自噬活性，对肝纤维化的防治具有潜在应用价值。 Abstract:Objective To explore the role and potential mechanisms of all-trans retinoic acid （ATRA） on activation and oxidative stress of hepatic stellate cell （HSC）. Methods Platelet-derived growth factor （PDGF-bb, 10 ng/ml） was applied to induce the activation of HSCs, which was then treated with ATRA at a dosage of 5 μmol/L for 48 h. The effects of ATRA on HSC activation were evaluated by detecting changes in cell growth viability and phenotypic marker expression. The effects of ATRA on HSC oxidative stress were evaluated by detecting changes in intracellular reactive oxygen species （ROS）, reduced glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA）, and the expression of antioxidant genes. The effects of ATRA on HSC autophagic activity were evaluated by detecting changes in autophagy marker expression and autophagic flow. Results Compared with the PDGF-bb group, the cell viability was significantly reduced in ATRA-treated HSCs （P<0.01）, as well as the expression of α-SMA and Collagen I. The intracellular levels of ROS and MDA were significantly reduced in ATRA-treated HSCs （P<0.01）, whereas the GSH level was significantly increased （P<0.01）. The expression levels of antioxidant genes （NRF2, HO-1, and ATF4）, were significantly higher in ATRA-treated HSCs than those in the normal ones under PDGF-bb condition （P<0.01）. Meanwhile, the expression of autophagy markers Beclin 1 and LC3 Ⅱ/I, and signal of autophagy flow in ATRA-treated HSCs were found to be significantly reduced （P<0.01）. Conclusion ATRA significantly inhibited PDGF-bb-induced HSC activation and reduced the level of oxidative stress and autophagic activity of HSCs, which had potential applications in the prevention and treatment of liver fibrosis. -
Key words:
- all-trans retinoic acid /
- hepatic stellate cells /
- activation /
- oxidative stress /
- autophagy
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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图 1 ATRA对HSCs生长活力的影响（n=5）
A. 常规条件下ATRA对HSCs生长活力的影响；B. PDGF-bb刺激条件下ATRA对HSCs生长活力的影响*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较。
图 2 ATRA对PDGF-bb诱导HSCs活化的影响
A. HSCs中α-SMA（绿色）的免疫荧光检测；B. HSCs中α-SMA和Collagen I的免疫印迹检测注A图中细胞核以DAPI（蓝色）标记，标尺为100 μm，B图中GAPDH为内参。
图 3 ATRA对HSCs氧化应激的影响
A. HSCs中ROS的DCFH-DA荧光探针检测（标尺为20 μm）；B. HSCs中GSH和MDA含量的检测（n=3）**P<0.01，与Mock组比较；##P<0.01，与PDGF-bb组比较。
图 4 ATRA对HSCs中抗氧化基因表达的影响
A. HSCs中抗氧化基因的实时定量PCR检测（n=3）；B. HSCs中抗氧化蛋白的免疫印迹检测**P<0.01，与PDGF-bb组比较。GAPDH为内参。
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