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细菌耐药性已成为全球公共卫生威胁，其中耐碳青霉烯类肠杆菌目（CRE）细菌的感染是全球抗感染领域最引人注目的问题之一，原因是临床仅以碳青霉烯类抗菌药物已无法有效治疗此类细菌的感染[1]，尤其是新德里金属β-内酰胺酶（NDM）的出现，给防控耐药菌株的传播敲响了警钟，到目前为止，临床可用于治疗产NDM型碳青霉烯酶菌株的药物仍寥寥无几[2-3]。2021年，我国肺炎克雷伯菌（CR-Kpn）对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为20.8%和21.9%，几乎是2005年的7倍（3.0% 和2.9%）。大肠埃希菌（CR-Eco）对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为1.8%和2.0%[4]。此外，研究表明，新冠肺炎可能会加速CRE通过病毒促进细菌附着和呼吸道定植，从而导致CRE在世界各地的传播率有所上升[5-6]。肠杆菌目不同属细菌的耐药性可能由多种机制单独或协同介导，不同菌株主要的耐药机制也不尽相同，对于特定菌株来讲，各个机制之间的协同作用也会大大提高其对碳青霉烯类抗生素的耐受性[7-8]。因此，为应对CRE带来的重大挑战，实验室需做好抗微生物药物敏感性试验，开展针对碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的酶型检测，为临床的抗感染治疗提供尽其所能的协助。本研究旨在通过评价上海交通大学医学院附属仁济医院浦南分院（本院）CRE对常见临床抗菌药物体外敏感性药敏试验的结果，了解CRE最常见的基因型，以及比较碳青霉烯酶耐药表型和基因型两种不同检测方法，以期为CRE的临床治疗和医院感染控制提供流行病学依据。
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菌株来源：收集本院2022年1月至12月患者临床标本分离的CR-Kpn及CR-Eco非重复分离株，共400株。
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使用珠海迪尔 Smart MS质谱仪对菌株进行鉴定。体外药敏试验使用96孔微量肉汤稀释法（仪器：Nephelometer比浊仪、Sensititre AIM自动加样系统、肉汤阅读仪）。
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美罗培南、环丙沙星、多黏菌素B、阿米卡星、替加环素均用无菌水溶解及稀释；头孢他啶用磷酸缓冲液（pH=6.0）溶解，无菌水稀释；头孢吡肟均用磷酸缓冲液（pH=6.0）溶解及稀释；氨曲南用饱和碳酸氢钠溶解，无菌水稀释。
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将过夜纯分培养的受试菌用直接菌落悬浮法调制成0.5麦氏浊度管比浊，行100倍稀释，最终接种菌量为105 CFU/ml。
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肠杆菌目：空气状态下，（35±2）℃培养16～20 h。
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最低抑菌浓度（MIC）结果根据美国临床和实验室标准化协会2022年M100第32版文件颁布的折点进行判读[9]。CRE的定义是根据美国疾病预防控制中心2015年颁布的文件[10]。
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CR-Eco ATCC25922、CR-Kpn ATCC700603 （上海市临床检验中心）。
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使用RESIST-5 O.O.K.N.V.（CORIS Bioconcept）胶体金法，对碳青霉烯类药物耐药（美罗培南MIC值≥4）的菌株，进行初筛。
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采用聚合酶链反应（PCR）技术检测CR-Eco blaKPC、blaNDM；CR-Kpn blaKPC、blaNDM、blaOXA-48 耐药基因，对阳性扩增产物进行测序确认。
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采用煮沸裂解法制备细菌DNA样本，即从培养基上选取新鲜培养的单个菌落到0.5 ml双蒸水，100℃震荡加热15 min，之后10 000 r/min离心5 min，留上清液作为被检测DNA样本。
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根据参考文献设计blaKPC、blaNDM 、blaOXA-48 3个耐药基因的检测引物（购自上海生工生物工程技术有限公司）。TaKaRa TaqTM HS Perfect Mix、DL2000DNA Marker等PCR试剂（TakaRa Bio）。PCR反应条件为：95℃预热5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共38次循环；72℃反应5 min，然后4℃储存。PCR反应完成后，取5 μl PCR产物与1 μl 6×上样缓冲液混合后加入2.5%琼脂糖凝胶上样孔中进行电泳，设恒压110 V电泳30 min。最后通过凝胶成像仪观察电泳结果。KPC耐药基因的产物长度为882 bp、NDM 耐药基因的产物长度为813 bp、OXA-48耐药基因的产物长度为743 bp。
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PCR电泳后观察，将符合预期片段长度的产物进行测序验证。
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采用WHONET 5.6版软件对药敏试验结果进行统计分析，其中计数资料以例数和百分比表示。
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共分离到CR-Kpn及CR-Eco非重复分离株共400株，其中CR-Kpn 195株（48.75%），CR-Eco 205株（51.25%）。51株CRE中CR-Kpn 41株（80.39%）、CR-Eco 10株（19.61%）。CRE菌株大多来自呼吸道，血液和中段尿标本。其中，CR-Kpn来源的前3位标本分别为：痰标本、血标本、中段尿标本，CR-Eco来源的前3位标本分别为：中段尿标本、血标本、导管，具体见表1。此外，41株CR-Kpn主要分布在ICU 21株（51%）和老年科5株（12%）；10株CR-Eco主要分布在普外科6株（60%）。
表 1 CRE来源的不同标本类型分布
标本类型 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） 株数 构成比（%） 株数 构成比（%） 痰 17 41.46 0 0.00 血液 11 26.83 3 30.00 中段尿 8 19.51 6 60.00 肺泡灌洗液 2 4.88 0 0.00 导管 0 0.00 1 10.00 脓 1 2.44 0 0.00 胆汁 1 2.44 0 0.00 胸水 1 2.44 0 0.00 -
CR-Kpn对美罗培南耐药率为21.03%、对替加环素、多黏菌素B、阿米卡星耐药率为0.00%、4.10%、11.79%，对头孢吡肟、头孢他啶耐药率分别为48.21%、45.64%，对氨曲南、环丙沙星耐药率分别是50.26%、53.85%。CR-Eco对美罗培南耐药率为4.88%，对替加环素、多黏菌素B、阿米卡星耐药率分别为0.00%、0.49%、0.98%，对头孢吡肟、头孢他啶耐药率分别为30.24%、39.51%，对氨曲南、环丙沙星耐药率分别是41.95%、64.88%，见表2。
表 2 肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌体外药物敏感性试验结果（%）
抗菌药物 肺炎克雷伯菌菌（n=195） 大肠埃希菌（n=205） 耐药 敏感 耐药 敏感 美罗培南 21.03 78.97 4.88 95.12 头孢吡肟 48.21 43.59 39.51 48.78 头孢他啶 45.64 48.72 30.24 62.44 环丙沙星 53.85 41.54 64.88 22.44 替加环素 0.00 97.44 0.00 100.00 多黏菌素B 4.10 95.90 0.49 99.51 阿米卡星 11.79 88.21 0.98 99.02 氨曲南 50.26 47.69 41.95 48.78 注：替加环素折点参考FDA，多黏菌素折点参考杨启文等[11]专家共识，其余均参考CLSI。 -
对 CRE的体外抗菌活性最高的前2位抗菌药物分别为替加环素（0.00%）、多黏菌素B（7.84%）。此外，对CR-Eco体外抗菌活性较高的还包括阿米卡星（90%）和氨曲南（80%），见表3。
表 3 CRE菌株体外药物敏感性试验结果（%）
抗菌药物 肺炎克雷伯菌菌（n=41） 大肠埃希菌（n=10） 耐药 敏感 耐药 敏感 美罗培南 100.00 0.00 100.00 0.00 头孢吡肟 100.00 0.00 90.00 0.00 头孢他啶 100.00 0.00 100.00 0.00 环丙沙星 100.00 0.00 100.00 0.00 替加环素 2.56 97.44 0.00 100.00 多黏菌素B 10.26 89.74 0.00 100.00 阿米卡星 51.28 48.72 10.00 90.00 氨曲南 100.00 0.00 10.00 80.00 注：替加环素折点参考FDA，多黏菌素折点参考杨启文等[11]专家共识，其余均参考CLSI。 -
51株CRE中检测到碳青霉烯酶49株（96.08%）。耐药表型检测中产NDM型碳青霉烯酶共13株（25.49%）、产KPC型碳青霉烯酶共34株（66.67%）、产OXA酶共2株（3.92%），见表4。耐药基因检测中以产blaKPC为主共34株（66.67%）、以产blaNDM共13株（25.49%）、以产blaOXA-48为主共2株（3.92%），见表5，图1、图2和图3。
表 4 CRE中检测到的碳青霉烯酶耐药表型分布
耐药表型 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） KPC酶 32（78.05） 2（20.00） NDM酶 5（12.20） 8（80.00） OXA酶 2（4.88） 0 阴性结果a 2（4.88） 0 注：a表示未检测到任何目标碳青霉烯酶。 表 5 CRE中检测到的碳青霉烯酶耐药基因分布
耐药基因 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） blaKPC 32（78.05） 2（20.00） blaNDM 5（12.20） 8（80.00） blaOXA-48 2（4.88） 0 阴性结果a 2（4.88） 0 注：a表示未检测到任何目标碳青霉烯酶。 
图 1 34株blaKPC基因电泳图谱
图 2 13株blaNDM基因电泳图谱
图 3 2株blaOXA-48基因电泳图谱
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近年来，由于抗菌药物的选择局限性和感染控制措施的实施不足，多重耐药菌感染率不断升高，尤其随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，在抗生素选择压力下CRE菌株不断被检出，已引起临床关注[12]。肠杆菌目中有许多种属可检测出CRE，最常见的有CR-Kpn、CR-Eco，其次是阴沟肠杆菌、变形杆菌属和弗劳地柠檬酸杆菌等[13-15]。CRE对碳青霉烯类药物的耐药机制主要以产碳青霉烯酶为主，其次是孔蛋白缺失或改变、外排泵过表达、青霉素结合蛋白改变和生物膜产生。耐药基因的突变、插入和转录修饰也可能影响肠杆菌目细菌对碳青霉烯类的敏感性[16]。本研究结果显示51株CRE包括CR-Kpn 41株（80.39%）和CR-Eco 10株（19.61%）。通过耐药表型筛选并结合基因型检测，本研究发现CRE耐药表型与携带的耐药基因型基本一致，CRE菌株中产blaKPC共34株（66.67%）、产blaNDM共13株（25.49%）、产blaOXA-48共2株（3.92%），blaKPC-2基因是本院主要的碳青霉烯类耐药基因，与PORRECA等[17]报道一致。此外，本研究结果显示，CR-Kpn中有78.05%产blaKPC， 12.20%产blaNDM， 4.88%产blaOXA-48，该结果与 CHINET 2016~2018年对全国24个省市的36家医院收集到935株非重复 CRE 菌株研究[18]结果CR-Kpn中产blaKPC 64.6%，产blaNDM 9.5%，产blaOXA-48 4.88%略有不同，可能与当地流行的 CRE携带的碳青霉烯酶耐药基因存在区域差异性有关。本研究体外抗菌药物敏感性试验结果显示，CRE均呈多重耐药，对头孢菌素类、碳青霉烯类出现较高程度的耐药，多黏菌素B，替加环素和一些氨基糖苷类药物是少数可能对CRE保持活性的药物之一。本研究的结果显示替加环素对所有CRE菌株具有较好的抗菌活性，敏感性均>95%，CR-Kpn对多黏菌素B敏感性为89.74%，略低于2021年CHINET监测数据，而CR-Eco对多黏菌素B敏感性为100%。某些抗菌药物对特定CRE菌株有较好的抗菌活性，如CR-Eco对阿米卡星敏感性为90%。由于碳青霉烯类耐药革兰阴性菌往往对临床常用抗菌药物耐药，其所致感染临床治疗选择药物有限，建议临床根据体外药物敏感性试验结果联合用药，如替加环素联合氨基糖苷类或多黏菌素B，但替加环素和多黏菌素B的临床治疗效果可参考的文献较少，建议临床根据实际治疗效果不断调整治疗方案。
本研究也存在某些不足之处，首先，纳入耐药菌除CR-Kpn、CR-Eco外，其他肠杆菌目细菌均未纳入；其次，CRE耐药基因型可能同时携带一种或多种AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶[19]，其复杂的基因型及其内在表达机制有待于进一步研究。
综上所述，替加环素、多黏菌素B还保持着较高的抗菌活性，KPC-2是本院CRE的主要酶型。由于作用不同碳青霉烯酶抗菌药物对不同碳青霉烯酶的抑制作用不同，因此，对于临床分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌，实验室应开展碳青霉烯酶表型或基因型的检测并进行临床报告。临床应根据微生物实验室药物敏感性及碳青霉烯酶分析结果结合本地区CRE耐药基因型分布特点，制定治疗策略和预防措施，合理用药。
Analysis of resistance situation and resistance genes of clinical isolates of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli
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摘要:
目的 分析住院患者临床分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CR-Kpn）及大肠埃希菌（CR-Eco）耐药现状、耐药类型并检测其相关耐药基因，为临床治疗耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（CRE）感染，合理使用抗菌药物提供参考。 方法 收集上海交通大学附属仁济医院浦南分院2022年1月至12月患者临床标本分离的CR-Kpn、CR-Eco非重复分离株共400株，使用肉汤微量稀释法检测分离株对临床常用的抗菌药物的最低抑菌浓度，并通过耐药表型检测、聚合酶链反应（PCR）对 CRE的碳青霉烯酶及其相关耐药基因进行检测。 结果 400株菌株中，检出CRE 51株(12.75%），CRE对替加环素、多黏菌素B的敏感率>95%。51株CRE中有49株产碳青霉烯酶，其中携带blaKPC 34株（66.67%）、携带blaNDM 13株（25.49%）、携带blaOXA-48 2株（3.92%）。 结论 和其他临床常用抗菌药物相比，替加环素和多黏菌素B对产碳青霉烯酶的CR-Kpn及CR-Eco具有较好的体外抗菌活性。此外，耐药表型检测和基因型检测有较好的符合性，临床微生物实验室可持续跟踪检测CRE耐药表型和基因型，根据实际情况制订用药方案。 Abstract:Objective To analyze the current status of anti-bacterial activity of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli clinically isolated from hospitalized patients, detect their related resistance genes, and provide reference for the clinical treatment of carbapenem resistant Enterobacteria （CRE） infections and the rational use of antibiotics. Methods A total of 400 non-repetitive isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolated from clinical specimens of Punan Branch of Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine from January 2022 to December were collected. The minimum inhibitory concentrations of these strains against commonly used antibiotics were determined by the broth microdilution method. The carbapenemase and related resistance genes of CRE were detected by drug resistance phenotype testing and PCR. Results Among the 400 strains, 51 strains were identified as CRE, accounting for 12.75%. Among these, 49 strains produced carbapenemases, with 41 strains （80.39%） being CR Klebsiella pneumoniae and 10 strains （19.61%） being CR Escherichia coli. Among the CRE strains, 34 strains （66.67%） carried blaKPC, 13 strains （25.49%） carried blaNDM, and 2 strains （3.92%） carried blaOXA-48. Conclusion Compared with other commonly used antibiotics, colistin and tigecycline exhibited good in vitro antibacterial activity against carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. In addition, there was good concordance between drug resistance phenotype testing and genotyping. Clinical microbiology laboratories could continuously monitor the drug resistance phenotype and genotype of CRE and develop appropriate treatment plans based on actual conditions. -
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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表 1 CRE来源的不同标本类型分布
标本类型 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） 株数 构成比（%） 株数 构成比（%） 痰 17 41.46 0 0.00 血液 11 26.83 3 30.00 中段尿 8 19.51 6 60.00 肺泡灌洗液 2 4.88 0 0.00 导管 0 0.00 1 10.00 脓 1 2.44 0 0.00 胆汁 1 2.44 0 0.00 胸水 1 2.44 0 0.00 
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表 2 肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌体外药物敏感性试验结果（%）
抗菌药物 肺炎克雷伯菌菌（n=195） 大肠埃希菌（n=205） 耐药 敏感 耐药 敏感 美罗培南 21.03 78.97 4.88 95.12 头孢吡肟 48.21 43.59 39.51 48.78 头孢他啶 45.64 48.72 30.24 62.44 环丙沙星 53.85 41.54 64.88 22.44 替加环素 0.00 97.44 0.00 100.00 多黏菌素B 4.10 95.90 0.49 99.51 阿米卡星 11.79 88.21 0.98 99.02 氨曲南 50.26 47.69 41.95 48.78 注：替加环素折点参考FDA，多黏菌素折点参考杨启文等[11]专家共识，其余均参考CLSI。
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表 3 CRE菌株体外药物敏感性试验结果（%）
抗菌药物 肺炎克雷伯菌菌（n=41） 大肠埃希菌（n=10） 耐药 敏感 耐药 敏感 美罗培南 100.00 0.00 100.00 0.00 头孢吡肟 100.00 0.00 90.00 0.00 头孢他啶 100.00 0.00 100.00 0.00 环丙沙星 100.00 0.00 100.00 0.00 替加环素 2.56 97.44 0.00 100.00 多黏菌素B 10.26 89.74 0.00 100.00 阿米卡星 51.28 48.72 10.00 90.00 氨曲南 100.00 0.00 10.00 80.00 注：替加环素折点参考FDA，多黏菌素折点参考杨启文等[11]专家共识，其余均参考CLSI。
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表 4 CRE中检测到的碳青霉烯酶耐药表型分布
耐药表型 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） KPC酶 32（78.05） 2（20.00） NDM酶 5（12.20） 8（80.00） OXA酶 2（4.88） 0 阴性结果a 2（4.88） 0 注：a表示未检测到任何目标碳青霉烯酶。
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表 5 CRE中检测到的碳青霉烯酶耐药基因分布
耐药基因 CR-Kpn（n=41） CR-Eco（n=10） blaKPC 32（78.05） 2（20.00） blaNDM 5（12.20） 8（80.00） blaOXA-48 2（4.88） 0 阴性结果a 2（4.88） 0 注：a表示未检测到任何目标碳青霉烯酶。
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