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阿霉素（DOX）是一种蒽环类化疗抗生素，尽管其能有效治疗多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤，但对肿瘤细胞和正常细胞的无差别攻击导致的毒副作用，使其临床应用受到限制[1-3]。特别是剂量依赖性心脏毒性最为突出，研究认为氧化应激是诱导心脏毒性的重要机制。其他常见的毒副作用还包括急性恶心呕吐、口腔炎、胃肠道紊乱、脱发、神经障碍和骨髓发育不全等[4-6]。同时，多药耐药的出现是DOX使用的附加问题[2]。因此，需要寻求DOX新的剂型结构来降低药物毒副作用带来的风险。
金纳米粒（AuNPs）具有毒副作用小、生物相容性良好的特性，且其具有粒径大小可调控、表面易修饰、高效的光热转化等优势，常被用于肿瘤的诊断和治疗[7-8]。AuNPs表面可修饰连接抗肿瘤药物、靶向肽、荧光物质或功能化基团等，实现精准治疗和实时监测[9]。常用的修饰配体为巯基（-SH），以形成Au-S键的方式连接在AuNPs表面，也可利用氨基与AuNPs的静电作用构建载体，但有研究表明，巯基比氨基作用更强，不易断裂[10]。
本研究制备了一种载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，验证了该纳米载体在保持对乳腺肿瘤细胞杀伤活性的同时，降低了DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，为后续AuNPs连接DOX用于肿瘤治疗提供参考。
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ZD-85A型气浴恒温震荡培养箱（上海启前电子科技有限公司）；十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；超纯水系统、数显pH计（均为德国Sartorius公司）；HDC-15K型离心机（上海泰坦科技股份有限公司）；Zetasizer nano ZS型激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；1260 Infinity II型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV1800型紫外可见分光光度仪（中国TECHCOMP公司）。
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金纳米粒（20 nm，南京东纳生物科技公司）；HS-mPEG5K（上海芃硕生物科技有限公司）；HS-DOX（西安瑞禧生物科技有限公司）；乙腈、三乙胺、磷酸，均为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）。
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人乳腺细胞（MCF-10A）、人乳腺癌细胞（MCF-7），均由海军军医大学药学系药剂学教研室提供。
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用纯水溶解HS-mPEG5K得到浓度为1 mg/ml的HS-mPEG5K溶液，向1 ml AuNPs（50 μg/ml）中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h，孵育结束后于4 ℃、以12000 g离心10 min，弃去含未反应HS-mPEG5K的上清液，纯水重悬。
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用纯水溶解HS-DOX得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX溶液，取上步1 ml AuNPs-mPEG重悬液离心，弃去上清液，用0.75 ml纯水重悬后，加入0.25 ml HS-DOX溶液， 4 ℃孵育8 h，离心弃去含未反应HS-DOX的上清液，纯水重悬。
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取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于马尔文Zeta电位样品池，使用激光粒度分析仪测定粒径和Zeta电位，每个样品测量3次。
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取1 ml AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX溶液于石英皿中，扫描波长400 nm～700 nm，以纯水作为各样品的纯溶剂参比进行光谱分析。
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向1 ml 50 μg/ml AuNPs中加入5 μl HS-mPEG5K溶液，4 ℃孵育8 h后离心去上清，分别用0.9375、0.875、0.75、0.5 ml 纯水重悬AuNPs-mPEG，再分别加入0.0625、0.125、0.25、0.5 ml HS-DOX溶液，得到投药浓度分别为2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的反应体系，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，通过高效液相色谱法（HPLC）对上清液进行定量检测，考察HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。具体检测方法见“2.3”项。
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色谱柱：Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：水（0.1%三乙胺，磷酸调节pH 3.0）∶乙腈=75∶25；流速：1.0 ml/min；进样量：10 µl；柱温：室温；检测波长：254 nm。
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对照品溶液：精密称取HS-DOX 4.47 mg，加纯水在100 ml量瓶中定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得到浓度为44.7 μg/ml的HS-DOX对照品溶液。
供试品溶液：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml HS-DOX（44.7 μg/ml），4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
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配制以下溶液：A：5.59 μg/ml HS-DOX对照品溶液；B：1 ml AuNPs-mPEG离心沉淀用0.75 ml纯水重悬，加入0.25 ml纯水混合，4 ℃孵育8 h，离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，为空白基质溶液；C：供试品溶液。
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用纯水稀释HS-DOX对照品溶液，制得HS-DOX浓度为1.40、2.79、5.59、11.18、22.35 μg/ml的标准工作液。以峰面积（A）为纵坐标，质量浓度（μg/ml）为横坐标进行线性回归。
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分别选取低、中、高3个质量浓度（1.40、5.59、22.35 μg/ml）的HS-DOX标准工作液，1 d内进样3次，每次每个浓度连续进样5次，计算峰面积的相对标准偏差（RSD），考察日内精密度；连续进样3 d，每次每个浓度连续进样5次，考察日间精密度。
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取对照品溶液和供试品溶液于室温下储存，分别于0、4、8、12、16、24 h测定HS-DOX的含量，计算RSD。
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取9份供试品各1 ml，分别加入1 ml的含8.12、10.15、12.18 μg的HS-DOX对照品溶液混合，每组平行制备3份，得到80%、100%、120%加样量的加样供试品溶液。根据以下公式计算HS-DOX的加样回收率。
$$ \text{加样回收率}=\frac{{\mathrm{m}}_{\text{测得量}}-{\mathrm{m}}_{\text{原有量}}}{{\mathrm{m}}_{\text{加入量}}}\times 100{\%} $$ -
测定离心后的上清液，根据以下公式计算吸附率和载药量。
$$\begin{array}{c} \text{吸附率}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}-{\mathrm{m}}_{\text{上清}}}{{\mathrm{m}}_{\text{投药}}}\times 100{\%}\text{；}\\\text{载药量}=\displaystyle\frac{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}}{{\mathrm{m}}_{\text{吸附}}+{\mathrm{m}}_{\text{金纳米粒}}}\times 100 \% \end{array} $$ -
分别取MCF-10A和MCF-7细胞，用DMEM混合培养基调整细胞密度为5×104 cells/ml，以每孔0.1 ml的体积铺板于96孔板，37 ℃下孵育24 h。分别用相同摩尔浓度的AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX（0.02、0.06、0.18、0.53、1.58、4.75、14.25 μmol/L）处理24 h和48 h，每种药物浓度重复3个孔。用10%的CCK8溶液染色30 min。
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实验结果用(
$\bar x $ ±s)表示。采用GraphPad Prism v9 （San Diego, USA）软件进行统计分析。两组间比较采用Two-Way ANOVA ，P≤0.05认为差异有统计学意义。 -
AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的粒径分布和Zeta电位如表1所示，3种纳米颗粒的粒径逐渐增大，Zeta电位由负电荷转为正电荷，最终得到水动力直径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV的AuNPs-mPEG@DOX。AuNPs与HS-mPEG5K孵育后，部分柠檬酸根被甲氧基聚乙二醇取代，连接了PEG长链的AuNPs-mPEG更稳定不易聚集，粒径增大，负电荷减少；连接HS-DOX后，由于阿霉素含有氨基带正电，因而制备得到带正电荷的纳米颗粒。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 -
如图1所示，AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的最大吸收波长分别为524、526、530 nm，随着HS-mPEG5K和HS-DOX被修饰到AuNPs上，最大吸收波长依次出现红移，表明mPEG5K和DOX通过HS键成功连接在AuNPs上。
图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
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为提高纳米载体的吸附率和载药量，考察了HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。如表2所示，随着HS-DOX的投药浓度增加，载体的吸附率和载药量都逐渐升高，当投药浓度为11.18 μg/ml时，纳米载体的吸附率和载药量达到最大值，继续提高HS-DOX的投药浓度，载药量不再上升，吸附率降低。表明HS-DOX投药浓度在11.18 μg/ml时，AuNPs表面吸附可能达到饱和，因而选择11.18 μg/ml投药浓度用于制备AuNPs-mPEG@DOX。
表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04 -
首先考察方法专属性，实验表明，制备过程未对HS-DOX的测定产生影响（图2）。进一步考察HS-DOX的线性，得线性回归方程为y=17.884 x−5.3651，r=0.9999，证明该液相色谱方法在1.40～22.35 μg/ml浓度范围内线性良好。分别考察了1.40、5.59、22.35 μg/ml 3个低、中、高浓度的精密度，见表3，日内精密度和日间精密度均<2.0%，符合精密度要求。对照品溶液和供试品溶液在24 h内基本稳定，其RSD分别为0.78%和1.01%。HS-DOX平均加样回收率为99.06%，RSD为0.83%，回收率符合要求（表4）。结果表明，该液相方法准确可靠，可用于HS-DOX的定量检测。
图 2 HS-DOX的液相色谱图
表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $±s RSD（%） $\bar x $±s RSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77 表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83 -
AuNPs-mPEG@DOX和DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h毒性作用如图3所示，随着DOX浓度的增加以及药物作用时间延长，MCF-10A和MCF-7细胞的存活率皆降低。在相同DOX浓度下，AuNPs-mPEG@DOX比游离DOX对正常乳腺细胞MCF-10A的毒性作用明显降低，可起到减小DOX毒副作用的目的。当DOX浓度<4.75 μmol/L作用于乳腺癌细胞MCF-7时，游离DOX表现出比AuNPs-mPEG@DOX明显的细胞毒性作用；在DOX浓度≥4.75 μmol/L的情况下，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX表现出无差异的细胞毒性作用。结果表明将DOX修饰于AuNPs上，由于Au-S键稳定存在，以及PEG的长链保护作用，DOX与细胞的直接接触面积减小，可降低对正常细胞的毒副作用。由于肿瘤细胞的高间质液压大，尺寸较大的AuNPs-mPEG@DOX较游离DOX不易被泵回血液和细胞胞吐，在高浓度时，与DOX肿瘤细胞杀伤作用相当。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
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DOX在杀伤肿瘤细胞的同时也会损害机体的正常细胞，其随剂量增加会对心脏、大脑、肝脏和肾脏等器官产生不良反应。同时，它还会损害免疫系统，增加病人对病原体的易感性，削弱他们的愈合能力。本文制备了载DOX的mPEG修饰金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。成功建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，在HS-DOX投药浓度为11.18 μg/ml时有最大吸附率和载药量。该纳米载体能明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用，且当浓度达到一定值时，具有与游离DOX相同的肿瘤细胞杀伤作用，为后续开发AuNPs连接DOX的肿瘤治疗方案奠定了良好的基础。
纳米颗粒被认为是选择性增加肿瘤细胞内药物积累从而减少毒副作用的重要途径。AuNPs作为无机纳米颗粒的一种，因其独特性质被广泛应用于药物递送、肿瘤诊断和治疗领域。除AuNPs本身结构可降低DOX毒副作用，也可通过在AuNPs表面修饰核酸适配体[11-12]、肿瘤穿透肽[13]等有效靶向和进入肿瘤细胞，减少DOX对正常细胞的损害；或利用肿瘤部位的特殊环境，通过响应型功能键将DOX连接于AuNPs上，如低pH[14]、过表达酶[15]和高水平的GSH[16]等来调控载体尺寸大小和DOX释放，提高载药纳米颗粒在肿瘤部位蓄积量，继而提高抗肿瘤作用。此外，也可以通过将DOX和Varlitinib与PEGAuNPs结合[17]，来增强DOX对肿瘤细胞的抑制作用，降低对正常细胞的毒性。虽然利用AuNPs载DOX同时降低其毒性的策略目前已被广泛研究，但其粒径大小、表面电荷和各类形状等因素对生物分布和细胞摄取的影响，AuNPs表面有限吸附能力带来的载体量过大，以及进入细胞后的代谢途径等问题还需要进行更多的探索。
Preparation and cytotoxicity of doxorubicin-containing gold nanoparticles
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摘要:
目的 构建载阿霉素（DOX）的甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰的金纳米粒AuNPs-mPEG@DOX，以降低DOX的毒副作用。 方法 制备AuNPs-mPEG@DOX，通过粒径、电位和紫外可见光吸收光谱（UV-Vis）进行表征。考察连接巯基的DOX（HS-DOX）投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响。建立未吸附HS-DOX含量测定的高效液相色谱法（HPLC），对专属性、线性、精密度、稳定性和加样回收率进行考察。采用CCK-8法检测AuNPs-mPEG@DOX对MCF-10A和MCF-7细胞的毒性作用。 结果 成功制备了AuNPs-mPEG@DOX，粒径为（46.12±0.49） nm，电位为（18.60±1.51） mV，最大吸收波长为530 nm。建立了可用于检测AuNPs-mPEG@DOX未吸附HS-DOX含量的HPLC方法，测定最佳投药浓度11.18 μg/ml，HS-DOX条件下的吸附率为（9.21±2.88）%，载药量为（2.01±0.62）%。细胞毒性实验表明AuNPs-mPEG@DOX可明显降低DOX对正常乳腺细胞的毒副作用；DOX在≥4.75 μmol/L时，AuNPs-mPEG@DOX与游离DOX对乳腺肿瘤细胞的细胞毒性作用一致。 结论 AuNPs-mPEG@DOX可有效降低DOX的毒副作用，为后续AuNPs连接药物降低其毒副作用的研究提供参考。 Abstract:Objective To construct methoxy polyethylene glycol (mPEG) modified gold nanoparticles (AuNPs) loaded with doxorubicin (DOX) AuNPs-mPEG@DOX in order to reduce the toxicity and side effects of DOX. Methods AuNPs-mPEG@DOX was prepared and characterized by Z-Average, Zeta potential and UV-Vis spectroscopy. The impact of thiol-linked DOX (HS-DOX) at various dosage concentrations on the drug adsorption rate and drug loading of AuNPs-mPEG@DOX was investigated. Furthermore, a HPLC method was developed to accurately determine the content of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX. The specificity, linearity, precision, stability and average recovery of this method were thoroughly investigated. The cytotoxic effect of AuNPs-mPEG@DOX on MCF-10A and MCF-7 cells was evaluated using a CCK-8 assay. Results AuNPs-mPEG@DOX was successfully prepared with Z-Average of (46.12±0.49) nm, Zeta potential of (18.60±1.51) nm and the maximum absorption wavelength of 530 nm. An efficient HPLC method for the detection of unadsorbed HS-DOX in AuNPs-mPEG@DOX was devised. The optimal dosage concentration of HS-DOX for AuNPs-mPEG@DOX was determined to be 11.18 μg/ml, resulting in a drug adsorption rate of (9.21±2.88)% and a drug loading rate of (2.01±0.62)%. Cytotoxicity experiments demonstrated that AuNPs-mPEG@DOX significantly reduced the toxic and side effects of DOX on normal breast cells. Additionally, AuNPs-mPEG@DOX and free DOX exhibited comparable cytotoxic effects on breast tumor cells when DOX concentration was equal to or greater than 4.75 μmol/L. Conclusion AuNPs-mPEG@DOX effectively reduce the toxicity of DOX, providing a reference for future research on reducing the toxicity of AuNPs-linked drugs. -
Key words:
- gold nanoparticles /
- doxorubicin /
- breast tumor /
- toxicity
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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图 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的UV-Vis光谱图
注：1. AuNPs-mPEG@DOX；2. AuNPs；3. AuNPs-mPEG。
图 3 AuNPs-mPEG@DOX和游离DOX分别对MCF-10A和MCF-7细胞的24 h和48 h细胞毒性
A.MCF-10A的24 h细胞毒性；B.MCF-10A的48 h细胞毒性；C.MCF-7的24 h细胞毒性；D.MCF-7的48 h细胞毒性*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与DOX组比较。
表 1 AuNPs、AuNPs-mPEG和AuNPs-mPEG@DOX的平均粒径和Zeta电位（n=3）
纳米颗粒 平均粒径（nm） 多分散系数 Zeta电位（mV） AuNPs 28.31±0.37 0.38±0.02 −25.30±0.99 AuNPs-mPEG 43.32±1.40 0.38±0.07 −22.20±0.49 AuNPs-mPEG@DOX 46.12±0.49 0.38±0.04 18.60±1.51 
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表 2 HS-DOX投药浓度对AuNPs-mPEG@DOX吸附率和载药量的影响（n=3）
HS-DOX投药浓度
（μg/ml）吸附浓度
（μg/ml）吸附率
（%）载药量
（%）2.79 0.11±0.02 3.96±0.57 0.22±0.03 5.59 0.51±0.16 9.20±2.89 1.02±0.32 11.18 1.03±0.32 9.21±2.88 2.01±0.62 22.35 0.92±0.02 4.13±0.09 1.81±0.04
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表 3 HS-DOX 3种浓度的日内和日间精密度（n=5）
浓度
（μg/ml）日内精密度 日间精密度 $\bar x $ ±sRSD（%） $\bar x $ ±sRSD（%） 1.40 1.41±0.02 1.70 1.41±0.03 1.79 5.59 5.52±0.08 1.40 5.55±0.10 1.83 22.35 22.37±0.19 0.84 22.36±0.17 0.77
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表 4 HS-DOX的加样回收率（n=3）
加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 原有量（m/μg） 回收率（%） 8.12 18.13 10.03 99.75 18.11 10.10 98.65 17.97 9.98 98.40 10.15 20.42 10.21 100.59 20.33 10.30 98.82 20.00 10.02 98.33 12.18 21.95 9.95 98.52 22.18 10.20 98.36 22.19 9.99 100.16 平均回收率（%） 99.06 RSD（%） 0.83
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