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特应性皮炎（AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，在全球疾病负担研究（GBD）中以伤残调整寿命年的率衡量时，其造成的疾病负担在非致命性疾病中居于第15位，在所有疾病和损伤中居于59位[1]，同时AD造成的负担还与一个国家的国内生产总值呈正相关[2]。在过去的几十年里，亚洲国家居民的AD患病率持续上升，AD亦成为中国当前严重的公共卫生问题之一。中国居民AD的发病率逐年增加，儿童和老年人在亚洲五国均具有较高的AD发病风险，且中国居民的AD发病风险随时期的推进而加重[3]。
消风止痒颗粒现行质量标准收载于《部颁标准》中药成方制剂第十五册，标准编号：WS3-B-2975-98，处方中包括防风、蝉蜕、地骨皮、苍术（炒）、亚麻子、当归、地黄、木通、荆芥、石膏和甘草十一味药材[4]。消风止痒颗粒不仅对接触性荨麻疹作用明显，有缓解皮肤红肿，抑制风团之效[5]，还能改善尿毒症患者皮肤瘙痒症状[6]。本研究旨在通过消风止痒颗粒对AD引起的急性瘙痒的缓解作用，探究其可能的作用机制，为中药在止痒方面的研究提供一定的基础和参考依据。
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健康C57BL/6小鼠60只，雄性，体重18~20 g，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。饲养条件：室温20～25 ℃，湿度40 %～70 %，标准饲料，动物自由饮食和饮水。
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消风止痒颗粒由烟台东诚大洋制药有限公司提供，批号：Z20113054，规格：每袋3 g，临用前用纯净水配制成所需浓度。卡泊三醇（aladdin，批号：C126438）；卵清蛋白（OVA，SAITONC，批号：A80003）；无水乙醇（aladdin，批号：E111991）；小鼠白三烯C4（LTC4）Elisa试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号：JM-02678M1）；红细胞裂解液（BD，Cat：555899）；FITC 抗小鼠 FcεRIα 抗体（BioLegend，Cat：134305）；PE 抗小鼠 IgE 抗体（BioLegend，Cat：406907）；PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 CD49b 抗体（Bio Legend，Cat：103519）；APC 抗小鼠 CD200R （OX2R）抗体（BioLegend，Cat：123915）。
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JA2003A型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；A51119500C型全自动酶标仪（美国Thermo科技公司）；5420型高速离心机（美国Eppendorf公司）；CytoFLEX型流式细胞仪（美国贝克曼公司）。
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参照Wang等的小鼠AD急性瘙痒模型制备方法[7]。8周龄的C57小鼠，每天先用卡泊三醇（0.5 nmol，溶在15 μl的100 %乙醇中）涂抹右侧耳皮肤（右耳内外侧各7.5 μl），然后用卵清蛋白（OVA，5 mg/ml，溶在20 μl磷酸盐缓冲盐水PBS中）进行涂抹（右耳内外侧各10 μl），连续处理10 d（从第0天到第9天）以使小鼠敏感。对照组小鼠先用15 μl乙醇处理，然后用20 μl PBS处理。在第10天，在小鼠右颊皮内注射OVA（2.5 mg/ml，溶在生理盐水中）20 μl进行激发。
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60只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低（7.2 g/kg）和高剂量组（14.4 g/kg）、阳性对照组（孟鲁司特，5 mg/kg）5组，每组12只，适应性饲养1周后开始进行造模。消风止痒颗组低剂量是按体表面积换算方法由人临床使用剂量（15岁以上患者1日分2~3次口服36 g，按60 kg体重计算，即0.6 g/(kg·d)）换算成小鼠剂量（7.2 g/kg），高剂量设为低剂量的2倍，即14.4 g/kg。各组小鼠给药途径均为灌胃给药，各组药物均在给药前现配。消风止痒颗粒低剂量组药物加饮用水后配成1 g/ml浓度, 消风止痒颗粒高剂量组药物加饮用水后配成2 g/ml浓度；阳性对照组孟鲁司特加饮用水后配成0.695 mg/ml浓度，空白对照组用饮用水灌胃，各组小鼠均按7.2 ml/kg体积灌胃给药。各组于激发前12 h及激发前30 min各灌胃给药一次。
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瘙痒行为在第10天上午8点至11点之间进行。测试前2 d将右侧脸颊备皮，测试前1 d（即第9天）将动物在测试室中适应60 min。测试当天给药30 min后在小鼠右颊皮内注射OVA（2.5 mg/ml，溶在0.9 %生理盐水中）20 μl进行激发，录像60 min，记数30~60 min小鼠抓挠次数。抓挠的定义是前脚或后脚直接对背部、脸颊或耳朵进行连续抓挠的情况，当这种情况在鼠将前爪或后爪离开或放在嘴巴为计数1次。
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在小鼠瘙痒行为学实验结束后，每组随机取6只小鼠进行眼眶取血，在离心管中4 ℃静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清液到新的离心管中备用。血清样本按Elisa试剂盒操作说明书进行实验。
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外周血淋巴细胞样本制备：每组各取3只小鼠，腹主动脉取血于抗凝管中（500 μl左右），每个样品加入1 ml红细胞裂解液，室温孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再次加入1 ml红细胞裂解液，室温孵育15 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液后加入1 ml PBS重悬离心，得到外周血淋巴细胞。抗体孵育：各样品管外周血淋巴细胞用300 μl的PBS重悬，每管加入1 μl抗体，4 ℃孵育30 min，流式细胞仪进样检测。
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实验数据以均值±标准差（
$ \bar{x} $ ±s）表示，采用GraphPad Prism软件进行统计处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异的显著性检验。P<0.05为差异具有统计学意义。 -
空白对照组小鼠无明显的急性抓挠行为，模型组小鼠激发后出现明显的抓挠行为，模型组抓挠次数均值为56次，与模型组相比，各给药组均不同程度显著减少小鼠抓挠次数（P<0.05），阳性对照组为34次、消风止痒颗粒低剂量组为42次、消风止痒颗粒高剂量组为23次，结果见图1。消风止痒颗粒能明显减少小鼠抓挠次数，改善小鼠AD急性瘙痒症状。
图 1 小鼠激发后30~60 min内的抓挠次数（n=10，
$ \bar{x} $ ±s） -
与空白对照组相比，模型组小鼠血清中白三烯含量明显升高（P<0.001）；各给药组相较于模型组小鼠血清中白三烯含量均显著下降（P<0.05），结果见图2。结果表明，消风止痒颗粒能显著降低AD小鼠血清中白三烯水平，降低炎症水平。
图 2 激发后小鼠血清中白三烯水平（n=6，
$ \bar{x} $ ±s） -
模型组小鼠血液中CD49b+细胞和FceRla+细胞以及CD200R+细胞的比例显著高于空白对照组（P<0.05），消风止痒颗粒高剂量组与模型组相比较，能明显降低CD49b+细胞和FceRla+细胞以及CD200R+细胞的比例（P<0.05），结果如图3～图5所示。CD49b和FceRla以及CD200R为嗜碱性粒细胞表面抗原[7]，两者升高表明小鼠血液中嗜碱性粒细胞比例升高，而消风止痒颗粒能降低由特异性皮炎引起增多的嗜碱性粒细胞，减少炎症反应，进而减轻瘙痒症状。
图 3 CD49b+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s）
图 4 FceRla+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s）
图 5 CD200R+细胞的流式细胞结果（n=3，
$ \bar{x} $ ±s） -
AD是一种以皮肤持续瘙痒为特征的复发性、慢性、非感染性炎症性皮肤病。其发病机制是多种因素共同作用的结果，涉及表皮屏障功能受损、免疫异常、宿主遗传因素和环境因素的相互作用。表皮的最外层，角质层和颗粒层的紧密连接形成蛋白质和脂质屏障，防止皮肤种水分的流失、微生物病原体的入侵，以及过敏原、毒素和刺激物引起的炎症反应。AD发生后，皮肤屏障受损，表皮分化蛋白（特别是聚丝蛋白）和紧密连接蛋白表达减少，脂质，特别是长链脂肪酸和神经酰胺缺乏。由于抗菌肽（AMP）对环境病原体（包括金黄色葡萄球菌）的反应不足，使皮肤对微生物的屏障作用也被削弱[8]。国内外报道中，皮肤源性瘙痒动物模型是药物止痒研究实验最常使用的类型，由于不同药物作用机制、疾病生理病理特征不同，使用的模型也不尽相同。近年来，越来越多的新品系、新技术、新途径应用于皮肤源性急慢性瘙痒动物模型的建立，为机制研究提供基础，同时也出现了更加经济、造模周期短和更符合疾病生理病理特征等优势动物模型，如同时使用4-氨基吡啶（4-AP）和组胺能更好地诱发动物瘙痒行为，AD的卡泊三醇模型操作更简便，瘙痒更明显，并且具备更多 AD 临床特征[9]。本研究造模时参考Wang等的方法[7]，在小鼠皮内注射OVA激发后的30~60 min内，小鼠出现明显的抓挠行为，说明该方法能很好的诱发小鼠瘙痒行为。通过对各组小鼠30 min内抓挠次数的统计，发现消风止痒颗粒给药后能显著减少小鼠急性瘙痒后的抓挠次数，说明口服消风止痒颗粒能减轻AD后急性瘙痒的症状。
尽管嗜碱性粒细胞是哺乳动物体内最不常见的粒细胞群体，但在许多人类疾病中，如过敏性疾病、器官排斥反应、自身免疫疾病及癌症，都有发现其积累。例如，嗜碱性粒细胞被认为与过敏性接触性皮炎、AD、药物过敏反应、超敏反应、哮喘、大疱性类天疱疮、狼疮肾炎、克罗恩病、皮肤和肾脏同种异体移植反应以及急性和慢性骨髓性白血病的发病机制有关[10]。还有许多研究表明，在急性AD、慢性IgE介导的皮炎、气道炎症和嗜酸性粒细胞性食管炎疾病中，嗜碱性粒细胞在诱导TH2细胞因子介导的炎症中发挥重要作用[11-13]。本研究通过流式细胞术检测了小鼠血清中CD49b+和FceRla+细胞的比例，发现口服消风止痒颗粒能明显减少由AD诱导增加的嗜碱性粒细胞，说明消风止痒颗粒是通过降低小鼠血清中嗜碱性粒细胞数量来达成缓解瘙痒的效果。此外，有研究报道，AD患者的病变皮肤或尿液中检测到多种前列腺素和白三烯，如PGE2、LTB4和CysLTE4[14, 15]，提示前列腺素和白三烯可能参与AD 症状的发展。在OVA诱导的小鼠AD模型中，抓挠行为诱导中性粒细胞向皮肤浸润，浸润的中性粒细胞产生的LTB4作用于中性粒细胞和Th 2细胞上表达的BLT1，促进其向皮肤浸润[16]。有文献报道了作为白三烯拮抗剂的孟鲁司特可治疗AD，本实验选用了孟鲁司特作为特异性阳性对照药[17]。在分离小鼠血清后，检测了血清中白三烯含量，结果发现，消风止痒颗粒能明显降低AD小鼠血清中白三烯水平，说明消风止痒颗粒口服后改善AD小鼠瘙痒症状的机制可能与降低血清中白三烯水平有关。
综上所述，本研究证实了消风止痒颗粒能够改善AD小鼠的急性瘙痒症状，其机制可能与减少小鼠血液中嗜碱性粒细胞数量及血清中白三烯水平相关。本研究为将来进一步进行消风止痒颗粒在AD急性瘙痒方面的研究提供了深入的实验与理论依据。
Therapeutic effect of Xiaofeng Zhiyang granules on acute itching in mice with atopic dermatitis by decreasing leukotriene
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摘要:
目的 建立小鼠特应性皮炎急性瘙痒模型，研究消风止痒颗粒的止痒作用及其机制探讨。 方法 采用诱导法制备特应性皮炎小鼠模型。小鼠每天先后用卡泊三醇和卵清蛋白（OVA）涂抹右耳致敏10 d，然后在小鼠右颊皮内注射OVA进行激发，致使小鼠出现急性瘙痒，记录小鼠激发后30~60 min的抓挠次数。实验分为5组：空白对照组、模型组、消风止痒颗粒低剂量组（7.2 g/kg）和高剂量组（14.4 g/kg）、阳性对照组（孟鲁司特5 mg/kg）。各组于激发前12 h及30 min各灌胃给药一次。通过Elisa检测小鼠血清中白三烯水平，通过流式细胞术检测血液中嗜碱性粒细胞比例及激活状态。 结果 小鼠经致敏和激发后出现明显的抓挠行为，模型组小鼠激发后30~60 min内抓挠次数均值为56次，消风止痒颗粒低和高剂量组小鼠抓挠次数均值分别为42次和23次，较模型组均显著降低（P<0.05）。消风止痒颗粒低、高剂量组血清中白三烯水平和嗜碱性粒细胞比例与模型组比较，均明显降低（P<0.05）。 结论 消风止痒颗粒对小鼠特应性皮炎急性瘙痒具有一定治疗作用，作用机制与其降低特应性皮炎小鼠血清中白三烯水平和降低嗜碱性粒细胞比例有关。 Abstract:Objective To establish a mice model of atopic dermatitis with acute itching and investigate the antipruritic effect and its mechanism of Xiaofeng Zhiyang granules（XFZYG）. Methods A mice model of atopic dermatitis was prepared by induction method. Mice were sensitized by calcipotriol and ovalbumin (OVA) applying to the right ear daily for 10 days, and then stimulated by OVA injected intradermally into the right cheek to resulting in acute itching. These mice were divided into 5 groups: blank control group, model group, low dose (7.2 g/kg) and high dose (14.4 g/kg) of XFZYG, and positive control group (montelukast 5 mg/kg). Drugs were administered by gavage at 12 h and 30 min before stimulation. The leukotriene levels in the serum of the mice were measured by Elisa and the basophil ratio and activation status in the blood were measured by flow cytometry. Results The mean number of scratches in the model group was 56 between 30 min and 60 min after stimulation, while the mean number of scratches in the low and high dose of XFZYG groups were 42 and 23 respectively, which were significantly lower than those in the model group （P<0.05）. The serum leukotriene levels and the proportion of basophils in the low and high dose of XFZYG groups were significantly lower than those in the model group (P<0.05). Conclusion XFZYG had certain therapeutic effect on acute itching of atopic dermatitis in mice, and the mechanism of its action was related to the reduction of leukotriene level and basophil ratio in serum of mice with atopic dermatitis . -
Key words:
- Xiaofeng Zhiyang granule /
- atopic dermatitis /
- pruritus /
- basophil /
- leukotriene
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白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根，首载于《神农本草经》。白蔹是最早用于疮痈、烫伤[1]治疗的药物，具有解毒、生肌的功效。资料显示，白蔹在皮肤创伤治疗中的使用频率较高。随着白蔹药理研究的不断深入，发现白蔹还具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫调节及促进溃疡快速愈合等作用。
在2015版《中国药典》中，白蔹的质量标准只有定性分析而无定量分析。白蔹成分检测中发现其含大黄素等蒽醌类活性成分[7]，且白蔹中大黄素的定量测定方法文献资料[8-9]较少。本实验采用反相高效液相色谱法，建立白蔹药材中大黄素含量测定方法，为白蔹的质量控制标准提供方法和依据。
1. 试药与仪器
1.1 试药
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，经面积归一化法计算含量为99.1%）；甲醇（烟台远东精细有限公司，批号：160706）为色谱纯，水为超纯水，磷酸（莱阳市双双化工有限公司，批号：2010246）为分析纯，硫酸（淄博市淄川区张庄化学试剂厂，批号：950626）为分析纯。白蔹饮片（安国市弘发中药材饮片有限公司，批号：131001），经淄博市中医院药品供应科主任魏星教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹Ampelopsis japonica(Thunb.) Makino的干燥块根。
1.2 仪器
Lab Alliance PC 3000 高效液相色谱仪（美国科学系统公司），紫外检测器（北京普析通用仪器有限责任公司）；LD310-2R电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；FA/JA系列电子天平（上海上平仪器有限公司）；RE-201D型恒温水浴锅、RE-201D型旋转蒸发器（郑州博科仪器设备有限公司）；766-3型远红外快速干燥箱（江苏省南通县金余电器配件厂）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
Apollo-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇−0.2%磷酸溶液（85:15），流速1.0 ml/min，检测波长220 nm，进样量20 μl。在此条件下，大黄素与相邻色谱峰分离度良好，无干扰，理论塔板数为2 000。对照品与供试品色谱图见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的制备
取大黄素对照品（含量为99.1%）约10 mg，精密称定，置于1 000 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为9.91 μg /ml 的大黄素对照品储备液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取过5目筛的白蔹药材粉末，置烘箱内（70±2）℃，2 h烘干。精密称量30 g，用10倍量质量分数20%的硫酸在50 ℃条件下回流水解2 h。过滤，取滤渣。滤渣用纯化水洗至中性（pH=7），烘干。称其质量，记录。再以8倍量体积的95%乙醇在82 ℃条件下回流提取2次，每次1 h，过滤，合并乙醇提取液，减压蒸馏，浓缩至无醇味，加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中，即得供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
分别精密量取“2.2.1”项下制备的大黄素对照品溶液各125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成6种不同浓度的对照品溶液。依次精密吸取对照品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y = 53 962X − 966. 46，r = 0.999 7；结果表明大黄素在0.124～3.968 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验
精密量取对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。大黄素峰面积RSD为1.7%。仪器精密度良好，符合要求。
2.3.3 重复性试验
精密称取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法平行制备样品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别进样，测定大黄素的峰面积，RSD为1.2%（n= 6），结果表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取在室温（10~30 ℃）下放置0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供试品溶液各20 μl进样测定，记录大黄素的峰面积，6次进样结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为1.5%。
2.3.5 加样回收率试验
取同一批次（批号：20170704）已知含量的白蔹药材样品9份，分别按相当于样品溶液中大黄素含量的80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.3.1”项下制备的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。计算回收率，结果见表1。
表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果样品含有量（m/mg） 加样量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 2.3.6 样品测定
取不同批次白蔹药材样品，分别按“2.3.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，连续进样3次，以外标法计算含量，测定结果见表2。
表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)批号 含量（μg/g） RSD（%） 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50 3. 讨论
3.1 色谱条件的选择
3.1.1 检测波长的选择
笔者所查文献[8-10]中，测量大黄素所用波长有254、290 nm等。通过实验发现，不同的波长影响其重现性及灵敏度。通过对大黄素标准品甲醇溶液全波段（200～400 nm）紫外扫描可见:其在220、254、260、272、278 nm处均具有特征吸收。通过综合比较上述波长处大黄素峰的峰形及峰面积，220 nm处波长的峰形较好、干扰少、峰面积较大，故选定220 nm作为白蔹药材中大黄素的测定波长。
3.1.2 流动相的选择
大黄素的化学名为1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，具有一定的极性和酸性。所查文献中，大黄素含量测定的流动相体系有多种。在实验过程中发现，流动相对色谱峰的保留时间及分离度有较大影响。故本实验在选择流动相时，考察了不同比例的甲醇-水，乙腈-水，甲醇:0.1%磷酸溶液[8-10]，甲醇:0.5%磷酸溶液[11]，甲醇:0.2%磷酸溶液，甲醇:0.02%磷酸溶液，甲醇:1% 冰醋酸[12]等不同溶剂系统，结果表明，相同条件下，甲醇:0.2%磷酸溶液（85:15）为流动相时，可以达到基线分离，出峰时间较短，峰形较好。
3.1.3 流速与进样量的选择
在流动相及波长选定的条件下，考察了不同流速（0.5~2.0 ml/min）对出峰时间的影响，当流速小于1.0 ml/min时，保留时间延长，使流动相的用量增加，会造成试剂的浪费；当流速大于1.0 ml/min时，保留时间缩短，但大黄素的峰会与杂质峰产生重叠，影响分离度及重现性。本实验选择1.0 ml/min作为流速。
在样品浓度一定的条件下，考察了不同进样体积（10～30 μl）的影响。实验结果表明，进样体积小于20 μl时，重现性及灵敏度均下降；大于20 μl时，杂质峰明显。当进样量为20 μl时，峰的对称性得到保证。因此，本实验选择20 μl为进样量。
3.2 样品提取方法的选择
已有文献[8]对白蔹中大黄素的提取方法采用甲醇提取及三氯甲烷萃取法。通过实验发现这种方法稳定性差、步骤烦琐，且所用试剂毒性较大。本实验在上述提取方法的基础上，参照大黄药材中大黄素的提取方法[10]，通过4因素（粒度、溶剂剂量、溶剂浓度、提取时间）3水平的正交设计确定了白蔹中大黄素的提取方法。结果表明，采用过5目筛的白蔹粉末，先用20%的硫酸在50 ℃条件下回流酸水解2 h，滤渣用纯化水洗至中性。再用8倍量体积的95%乙醇，水浴回流2 h能够达到较好的提取效果。白蔹中含大黄素等游离蒽醌，还含有结合型蒽醌[13-14]。先进行酸水解，使结合型蒽醌水解，结果大黄素的含量有所提高。白蔹具有的抗菌性与其中的大黄素[15-16]有关，大黄素是白蔹的活性成分。本提取方法克服了以往相关文献报道方法的不足，分离度好、重现性好、结果准确，因此大黄素作为白蔹药材中指标成分有一定可行性，为完善白蔹药材的质量控制标准提供了方法和依据。新药临床试验的质量是药品上市后安全、有效的保障[17]，所以临床试验过程中的质量控制尤为重要。包括相似性评价（外观检测和观感评估测试）、安全性评价（常规安全性检测）、适用性评价（薄层鉴别、HPLC、指标成分测定和药理实验）和最终制剂的质量标准。临床试验过程中的质量控制所要评价的范围更广、要求更为严格，是为了确保临床数据的真实、准确、完整和可靠，为下一步临床应用提供依据，对提高医疗水平具有重大意义。
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