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参麻颈复颗粒是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院经典的自制制剂，由丹参、山茱萸、栀子、续断等10余味药物组成，具有活血通络，宁神安脑，健筋壮骨的功效。通过益气活血、滋阴降火、补肝益肾、温脾化痰以达到气血双补、上中下统调的治疗作用[1]，多用于颈椎病、脑供血不足、头昏胀痛、夜寐梦扰等。脑梗死属于中医“中风”范畴，是指各种原因引起的脑部血液供应障碍，使局部脑组织发生不可逆性损害[2]，主要采用溶栓、抗血小板或抗凝、调脂药以及脑保护药等治疗手段。参麻颈复颗粒作为上海中医药大学附属岳阳医院（本院）的特色自制制剂，在数十年的临床应用中发现其对脑梗死患者的预后有明显的治疗作用，研究表明该方中当归[3]、川芎[4]、蒺藜[5]、杜仲[6]、天麻[7]等药味均对脑梗死有一定的疗效，但作用机制尚不清楚。本研究借助网络药理学方法，对参麻颈复颗粒治疗脑梗死的作用机制进行研究，预测可能的活性成分、作用靶点及通路，为该制剂的进一步研发提供参考依据。
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参麻颈复颗粒共由十二味中药组成，本研究利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP数据库） [8]、中药百科全书数据库（ETCM数据库）[9]、中医药资料库检索参麻颈复颗粒中组成中药的化学成分，TCMSP 数据库没有收录中药天麻和首乌藤，因此天麻的化学成分从ETCM数据库检索，首乌藤的化学成分从中医药资料库数据库检索[10-11]，鉴于不同数据库中化学成分名称可能不同，因此将检索的化学成分根据其CAS 匹配到 TCMSP，找到该化学成分并获取其作用靶点。其余十味药通过TCMSP查找并导出用于筛选活性成分的相应数据，根据参数的口服生物利用度( oral bioavailability, OB) 和类药性( drug-likeness, DL)[12]，以OB≥30%且DL ≥0.18作为条件筛选出活性成分，再利用TCMSP，关联相应的靶点，得到潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[13]匹配靶点蛋白所对应的基因。
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将参麻颈复颗粒的活性成分及潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建参麻颈复颗粒的活性成分-预测靶点网络。 -
基于OMIM数据库[14]检索脑梗死相关靶蛋白基因，以脑梗死（cerebral infarction）和缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）为关键词进行靶标检索，所有靶标均通过UniProt数据库获取其UniProt ID信息。 -
将OMIM中收集到的与脑梗死相关的所有蛋白质，导入STRING数据库，导出分值>0.7的高置信度蛋白相互作用数据，用Cytoscape 3.7.2软件构建与治疗脑梗死有关的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI) 网络。 -
利用Cytoscape 3.7.2软件中Merge功能，将参麻颈复颗粒活性成分-预测靶点网络与脑梗死的蛋白质-蛋白质相互作用网络合并，确定两者是否存在交集，通过Cytoscape 3.7.2软件构建参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络，系统分析参麻颈复颗粒治疗脑梗死的潜在作用靶点。 -
采用DAVID数据库( https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) [15-17]，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行基于KEGG的生物通路富集分析，并利用OmicShare对通路进行可视化，采用DAVID数据库，对与治疗脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析。 -
在TCMSP数据库中对十二味药的活性成分进行检索，共得到183个潜在有效成分（表1），其中有13个为共有成分（表2）。
表 1 参麻颈复颗粒中药对应潜在有效成分个数
编号 中药名称 检索名称 检索拼音名 中药名称缩写 潜在有效成分个数 1 丹参 丹参 DAN SHEN DS 65 2 蒺藜 蒺藜 JI LI JL 30 3 杜仲 杜仲 DU ZHONG DZ 28 4 栀子 栀子 ZHI ZI ZZ 13 5 山茱萸 山茱萸 SHAN ZHU YU SZY 12 6 天麻 天麻 TIAN MA TM 9 7 川芎 川芎 CHUAN XIONG CX 7 8 续断 续断 XU DUAN XD 5 9 陈皮 陈皮 CHEN PI CP 5 10 首乌藤 夜交藤 YE JIAO TENG YJT 5 11 当归 当归 DANG GUI DG 2 12 桑寄生 桑寄生 SANG JI SHENG SJS 2 表 2 参麻颈复颗粒中药共有潜在有效成分
编号 共有成分 来源 编号 共有成分 来源 A1 槲皮素 栀子、杜仲、桑寄生 A8 多孔菌素-5-烯-3β-醇 丹参、山茱萸、天麻 A2 β-谷甾醇 栀子、杜仲、山茱萸、续断、当归 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 杜仲、栀子 A3 谷甾醇 桑寄生、续断、蒺藜、川芎、陈皮 A10 表儿茶素 杜仲、首乌藤 A4 山柰酚 栀子、杜仲、蒺藜 A11 大黄素甲醚 蒺藜、首乌藤 A5 豆甾醇 栀子、山茱萸、当归 A12 异欧前胡素 丹参、栀子 A6 十八碳-6,9-二烯酸乙酯 栀子、山茱萸、川芎 A13 油酸乙酯 山茱萸、栀子 A7 3-β-羟基亚甲基-苯醌 杜仲、丹参 -
将筛选出的参麻颈复颗粒183个潜在有效成分导入到TCMSP，查找相应的靶点，得到1785个潜在靶点蛋白，并通过UniProt数据库匹配其蛋白所对应的基因。将结果导入到Cytoscape 3.7.2软件中进行网络构建，得到参麻颈复颗粒主要活性成分靶点网络（见表1和图1）。该网络共有519个节点、1 927条边，矩形方阵中浅蓝色菱形表示单味药的作用靶点、蓝色菱形表示共有的作用靶点、八边形图标表示参麻颈复颗粒活性成分、黄色箭头图标表示共有活性成分。参麻颈复颗粒的活性成分按度值排序，前四名分别为槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、豆甾醇。该网络的构建提示参麻颈复颗粒的组成中药均具有多活性成分、多靶点的特点。
图 1 参麻颈复颗粒主要活性成分-靶点网络
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在OMIM数据库检索与脑梗死相关的基因，共检索到216个相关基因靶点。参麻颈复有效成份的1785个潜在靶点蛋白，删除重复项后得到384个相关靶点。将成分靶点和疾病靶点输入BioVenn在线软件进行交集分析，绘制韦恩图，筛选出脑梗死与参麻颈复活性成分共有30个共同靶点（图2）。
图 2 参麻颈复活性成分与脑梗死共同靶点韦恩图
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将参麻颈复颗粒预测所得的基因与脑梗死相关基因进行映射后得到共有靶基因，输入STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析过程中，选取物种为Homosapiens ，并将蛋白-蛋白互作得分>0.7的基因输入Cytoscape 3.7.2进行网络可视化，共有30个节点，253个连线。应用软件中的Network analysis plugin对网络图中节点（Node）进行统计，分析其在图中的作用，自由度（Degree）越大，该节点在网络中的生物功能则越多。同时，颜色越深代表该节点自由度较大、生物功能较多（图3）。进一步对与脑梗死潜在靶点网络进行分析，得到网络中潜在靶点的度值，网络中有20个靶点的度值>16.86（平均度值），可能为参麻颈复颗粒活性成分发挥作用的潜在靶点。
图 3 参麻颈复颗粒治疗脑梗死的PPI网络图
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利用DAVID平台进行GO功能富集分析，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的30个蛋白在基因功能中的作用进行研究，得到了151个GO条目，根据P<0.05，筛选出117个GO条目，针对前10条BP分析、CC分析、MF分析绘制直方图（图4）。其中，生物过程相关的条目最多，有74个，结果显示参麻颈复颗粒主要对基因表达的正向调控、白细胞迁移、炎症反应、一氧化氮生物合成过程的正向调节等方面影响较大；分子功能相关的条目23个，结果显示参麻颈复颗粒主要对蛋白质结合、钙离子结合、受体活性、细胞因子活性等方面影响较大；细胞组成相关的条目20个，结果显示参麻颈复颗粒主要对细胞外间隙、质膜、细胞表面、胞外区等方面影响较大。
图 4 参麻颈复颗粒治疗脑梗死潜在靶点的GO富集分析
利用DAVID平台的KEGG通路富集分析功能，对与脑梗死相关的参麻颈复颗粒活性成分-潜在靶点网络中涉及的蛋白信号通路中的作用进行研究，得到19条信号通路，包括补体和凝血级联通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HTLV-I感染、神经活性配体受体相互作用等。
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基于上述信息，构建活性成分-靶点-通路图，以全面阐述参麻颈复颗粒脑梗死的作用机制（图5、表3），图中有74个节点和188条边，黄色菱形代表参麻颈复颗粒活性成分，绿色圆形代表潜在靶点，红色箭头代表信号通路，边代表三者之间的相互作用。从结果可以看出参麻颈复方中槲皮素、β-胡萝卜素、柚皮素、西红花酸、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可能是参麻颈复治疗脑梗死的关键成分。
图 5 参麻颈复颗粒治疗脑梗死的“活性成分-靶点-信号通路”网络图
表 3 参麻颈复颗粒活性成分对照表
编号 活性成分 口服利用度（%） 类药系数 度值 A1 槲皮素 46.43 0.28 414 A4 山柰酚 41.88 0.24 174 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 36.91 0.75 45 TM1 蔗糖 37.17 0.23 38 CP1 柚皮素 59.29 0.21 34 TM3 琥珀酸 31.62 0.23 34 CP4 柠檬苦素 61.67 0.52 33 JL2 大黄素 32.41 0.24 33 JL1 异鼠李素 49.60 0.31 31 SWT1 表儿茶素 48.96 0.24 29 A11 大黄素甲醚 22.29 0.27 28 ZZ5 5-羟基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色酮 51.96 0.41 25 CX1 杨梅酮 40.60 0.51 22 TM7 胡萝卜苷 36.91 0.75 20 JL4 麦黄酮 118.35 0.26 17 DZ11 （E）-3-[4-[（1R，2R）-2-羟基-2-（4-羟基-3-甲氧基-苯基）-1-羟甲基-乙氧基]-3-甲氧基苯基]丙烯醛 56.32 0.36 15 DZ20 报春色素苷 49.81 0.37 15 DZ5 β-胡萝卜素 37.18 0.58 15 DZ15 脱氢二甘醇4，γ'-二-O-β-D-吡喃糖苷 51.44 0.40 13 DZ13 （+）-右旋杜仲树脂酚 87.19 0.62 12 DZ4 40957-99-1 57.20 0.62 12 JL10 4-酮皮诺类 49.60 0.56 12 CP3 二氢川陈皮素 86.90 0.51 11 DZ19 4-[（2S，3R）-5-[（E）-3-羟基p-1烯基]-7-甲氧基-3-羟甲基-2,3-二氢苯并呋喃-2-基]-2-甲氧基苯酚 50.76 0.39 11 ZZ1 西红花酸 35.30 0.26 11 ZZ3 苏丹Ⅲ 84.07 0.59 11 A10 表儿茶素 48.96 0.24 10 TM6 香兰素 52.00 0.33 8 DZ8 AIDS214634 92.43 0.55 7 -
中药复方具有多活性成分、多作用靶点的特性，通过网络药理学手段，可以有效预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的作用机制。通过药物-化合物-靶点-通路网络的构建，可以发现参麻颈复颗粒中的陈皮、川芎、栀子、蒺藜、杜仲、天麻、首乌藤、山茱萸等药味中的槲皮素[18]、β-胡萝卜素[19]、西红花酸、柚皮素[20]、大黄素、报春色素苷、表儿茶素等活性成分可改善脑梗死患者的预后情况。研究显示槲皮素可通过抑制细胞凋亡和氧化应激水平，改善脑梗死受损神经功能，改善脑纤溶功能。β-胡萝卜素能阻止脑组织因自由基激活的氧化损伤，保护低密度脂蛋白免遭氧化损伤，在降低脑血管病危险因素方面有一定的作用。柚皮素可降低缺血再灌注损伤侧脑组织含水量、缩小脑梗死体积、降低脑组织MDA含量，提高SOD活性，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。通过GO功能富集结果提示，参麻颈复颗粒可能通过作用于纤溶酶原激活物抑制物1、血栓调节蛋白、凝血因子Ⅶ、血管内皮生长因子A等多个靶点，干预血小板激活、改善受损神经功能、保护脑缺血再灌注损伤，从而有助于脑梗死患者的恢复。
脑梗死后出现的炎症反应与脑损伤存在一定的关系，KEGG生物通路富集分析结果提示参麻颈复颗粒在干预脑梗死相关通路中，TNF信号通路和NF-κB信号通路起到了治疗脑梗死后炎症反应的重要作用。 IL-6靶点和TNF信号通路是脑梗死后重要的炎症反应通路[21]。NF-κB信号通路对炎症反应具有显著的影响，是脑缺血后炎性级联反应的始动因素[22]，NF-κB被激活，使其调控的靶基因转录活性升高，可诱导TNF和IL-6等炎症因子的产生，促进炎症发生发展和诱导细胞凋亡加重脑缺血的损伤。因此，参麻颈复颗粒可能是通过抑制NF-κB、TNF等炎症信号通路，起到保护脑血管损伤的作用。
HIF-1信号通路参与脑缺血组织的血管再生和血脑屏障的维持[23]，可以通过调控下游基因的转录，对抗低氧造成的细胞功能紊乱。HIF-1可以调控10余种下游基因的表达和转录，进而对多种细胞的多种生物学活动有重要影响[24]。因此，参麻颈复颗粒可能通过调节HIF-1信号通路促进对脑血管组织的再生，维持脑梗死患者的血脑屏障，改善脑梗死患者的预后情况。
本研究运用网络药理学的技术和方法，通过中药活性成分的筛选、靶点预测、网络构建与分析，从“药物-化合物-靶点-疾病”的关联性对中药复方参麻颈复颗粒治疗脑梗死的相关作用机制进行分析，预测参麻颈复颗粒治疗脑梗死的主要活性成分、作用靶点及信号通路，为进一步的实验验证提供依据。
Study on the treatment of cerebral infarction with Chinese medicine Shenmajingfu granule by network pharmacology
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摘要:
目的 应用网络药理学的研究方法探索中药复方参麻颈复颗粒治疗脑梗死的物质基础及其作用机制。 方法 通过TCMSP数据库、ETCM数据库、中医药资料库检索参麻颈复颗粒中潜在活性成分及作用靶点；OMIM数据库检索脑梗死相关靶蛋白基因，采用交集法获得参麻颈复颗粒与脑梗死的共同靶点基因。运用Cytoscape 构建“参麻颈复活性成分-靶点”网络，利用STRING 数据库构建PPI网络，采用DAVID数据库进行GO和KEGG 富集分析。 结果 筛选出参麻颈复颗粒的183个潜在有效成分，在TCMSP数据库中筛选到1785个潜在靶点蛋白，其中与脑梗死有关的作用靶点 30个，这些靶点基因主要参与炎症反应和细胞凋亡过程，涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等。 结论 参麻颈复颗粒对脑梗死的治疗作用可能与调控炎症反应、改善受损神经功能、保护脑缺血再灌注损伤有关。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Shenmajingfu granules in the treatment of cerebral infarction. Methods The potential active ingredients and targets of Shenmajingfu granules were retrieved through TCMSP, ETCM database and TCM Database. The related target genes of cerebral infarction were searched from OMIM database. The common targets of Shenmajingfu granules and cerebral infarction were obtained by the intersection method. Cytoscape was used to construct active components of Shenmajingfu granules-targets network. Protein-protein interaction network was constructed by STRING software. DAVID database was used for GO and KEGG enrichment analysis. Results The 183 potential active ingredients of Shenmajingfu granules were screened out. 1785 potential targets were screened in the TCMSP database, including 30 targets related to cerebral infarction. These target genes were mainly involved in the inflammatory response and apoptosis process, involving the TNF signaling pathway, HIF-1 signaling pathway and NF-κB signaling pathway. Conclusion The therapeutic effect of Shenmajingfu granules on cerebral infarction may be related to the regulation of inflammatory response, improvement of impaired neurological function and protection of cerebral ischemia-reperfusion injury. -
Key words:
- Shenmajingfu granules /
- cerebral infarction /
- network pharmacology
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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
1. 材料和方法
1.1 样品
菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
1.2 仪器与试剂
Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
1.3 发酵与萃取
取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
1.4 提取分离
乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
2. 结构鉴定
化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。3. 活性测试
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
4. 讨论
本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
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表 1 参麻颈复颗粒中药对应潜在有效成分个数
编号 中药名称 检索名称 检索拼音名 中药名称缩写 潜在有效成分个数 1 丹参 丹参 DAN SHEN DS 65 2 蒺藜 蒺藜 JI LI JL 30 3 杜仲 杜仲 DU ZHONG DZ 28 4 栀子 栀子 ZHI ZI ZZ 13 5 山茱萸 山茱萸 SHAN ZHU YU SZY 12 6 天麻 天麻 TIAN MA TM 9 7 川芎 川芎 CHUAN XIONG CX 7 8 续断 续断 XU DUAN XD 5 9 陈皮 陈皮 CHEN PI CP 5 10 首乌藤 夜交藤 YE JIAO TENG YJT 5 11 当归 当归 DANG GUI DG 2 12 桑寄生 桑寄生 SANG JI SHENG SJS 2 
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表 2 参麻颈复颗粒中药共有潜在有效成分
编号 共有成分 来源 编号 共有成分 来源 A1 槲皮素 栀子、杜仲、桑寄生 A8 多孔菌素-5-烯-3β-醇 丹参、山茱萸、天麻 A2 β-谷甾醇 栀子、杜仲、山茱萸、续断、当归 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 杜仲、栀子 A3 谷甾醇 桑寄生、续断、蒺藜、川芎、陈皮 A10 表儿茶素 杜仲、首乌藤 A4 山柰酚 栀子、杜仲、蒺藜 A11 大黄素甲醚 蒺藜、首乌藤 A5 豆甾醇 栀子、山茱萸、当归 A12 异欧前胡素 丹参、栀子 A6 十八碳-6,9-二烯酸乙酯 栀子、山茱萸、川芎 A13 油酸乙酯 山茱萸、栀子 A7 3-β-羟基亚甲基-苯醌 杜仲、丹参
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表 3 参麻颈复颗粒活性成分对照表
编号 活性成分 口服利用度（%） 类药系数 度值 A1 槲皮素 46.43 0.28 414 A4 山柰酚 41.88 0.24 174 A9 京尼平-1-O-龙胆双糖苷 36.91 0.75 45 TM1 蔗糖 37.17 0.23 38 CP1 柚皮素 59.29 0.21 34 TM3 琥珀酸 31.62 0.23 34 CP4 柠檬苦素 61.67 0.52 33 JL2 大黄素 32.41 0.24 33 JL1 异鼠李素 49.60 0.31 31 SWT1 表儿茶素 48.96 0.24 29 A11 大黄素甲醚 22.29 0.27 28 ZZ5 5-羟基-7-甲氧基-2-（3,4,5-三甲氧基苯基）色酮 51.96 0.41 25 CX1 杨梅酮 40.60 0.51 22 TM7 胡萝卜苷 36.91 0.75 20 JL4 麦黄酮 118.35 0.26 17 DZ11 （E）-3-[4-[（1R，2R）-2-羟基-2-（4-羟基-3-甲氧基-苯基）-1-羟甲基-乙氧基]-3-甲氧基苯基]丙烯醛 56.32 0.36 15 DZ20 报春色素苷 49.81 0.37 15 DZ5 β-胡萝卜素 37.18 0.58 15 DZ15 脱氢二甘醇4，γ'-二-O-β-D-吡喃糖苷 51.44 0.40 13 DZ13 （+）-右旋杜仲树脂酚 87.19 0.62 12 DZ4 40957-99-1 57.20 0.62 12 JL10 4-酮皮诺类 49.60 0.56 12 CP3 二氢川陈皮素 86.90 0.51 11 DZ19 4-[（2S，3R）-5-[（E）-3-羟基p-1烯基]-7-甲氧基-3-羟甲基-2,3-二氢苯并呋喃-2-基]-2-甲氧基苯酚 50.76 0.39 11 ZZ1 西红花酸 35.30 0.26 11 ZZ3 苏丹Ⅲ 84.07 0.59 11 A10 表儿茶素 48.96 0.24 10 TM6 香兰素 52.00 0.33 8 DZ8 AIDS214634 92.43 0.55 7
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[1] 孙浩, 杨春雷, 赵庆. 参麻颈复颗粒联合超短波治疗颈性眩晕62例[J]. 陕西中医, 2014, 35(6):677-678. [2] 陈宗胜, 程宜福. 脑梗死临床治疗研究进展[J]. 中医药临床杂志, 2011, 23(12):1116-1120. [3] 杨正飞, 杨小燕, 陈叶飞, 等. 当归-川芎药对治疗脑梗死的“调控网络”和机制[J]. 中医学报, 2020, 35(1):149-154. [4] 黄赫, 甘雨, 袁媛, 等. 川芎赤芍对急性脑梗死大鼠Nogo-A/NgR/RhoA/ROCK mRNA水平的影响[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2018, 20(10):1816-1821. [5] 张新平. 蒺藜总皂苷对缺血性脑卒中患者神经功能重建的影响[J]. 解放军医学杂志, 2008, 33(4):450-452. [6] 陈云华, 张硕峰, 孙建宁, 等. 杜仲红景天胶囊对大鼠脑缺血的保护作用[J]. 中国中医药信息杂志, 2006, 13(12):30-32. [7] 冯鹏硕, 王健, 高春雷. 天麻在治疗缺血性中风中的应用[J]. 中国社区医师, 2019, 35(6):91-92. [8] RU J L, LI P, WANG J N, et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]. J Cheminformatics, 2014, 6(1): 13. [9] XU H Y, ZHANG Y Q, LIU Z M, et al. ETCM: an encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J]. Nucleic Acids Res, 2019, 47(D1):D976-D982. doi: 10.1093/nar/gky987 [10] LV L S, SHAO X, WANG L Y, et al. Stilbene glucoside from Polygonum multiflorum Thunb.: a novel natural inhibitor of advanced glycation end product formation by trapping of methylglyoxal[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(4):2239-2245. doi: 10.1021/jf904122q [11] CHEN Y, WANG M, ROSEN R T, et al. 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical-scavenging active components from Polygonum multiflorum thunb[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(6):2226-2228. doi: 10.1021/jf990092f [12] XU X, ZHANG W X, HUANG C, et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(6):6964-6982. doi: 10.3390/ijms13066964 [13] ZHANG Y Q, MAO X, GUO Q Y, et al. Network pharmacology-based approaches capture essence of Chinese herbal medicines[J]. Chin Herb Med, 2016, 8(2):107-116. doi: 10.1016/S1674-6384(16)60018-7 [14] RAPPAPORT N, TWIK M, PLASCHKES I, et al. MalaCards: an amalgamated human disease compendium with diverse clinical and genetic annotation and structured search[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(D1):D877-D887. doi: 10.1093/nar/gkw1012 [15] JIAO X L, SHERMAN B T, HUANG D W, et al. DAVID-WS: a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis[J]. Bioinformatics, 2012, 28(13):1805-1806. doi: 10.1093/bioinformatics/bts251 [16] HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc, 2009, 4(1):44-57. doi: 10.1038/nprot.2008.211 [17] HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists[J]. Nucleic Acids Res, 2009, 37(1):1-13. doi: 10.1093/nar/gkn923 [18] 范崇桂, 张燕平, 付国惠, 等. 槲皮素对急性脑梗死大鼠模型神经功能和氧化应激的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2020, 37(4):685-688. [19] 潘天虹, 苗玲,金慧芳,等. 脑梗塞患者血清抗氧化维生素及低密度脂蛋白分析[J]. 现代康复, 2000, 4(3):356-357. [20] 唐黎黎, 杨运周, 傅佳, 等. 柚皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 安徽医科大学学报, 2006, 41(4):430-432. [21] 代鸣明, 吴志殿, 苏庆杰, 等. 脑梗通汤联合舒血宁注射液治疗脑梗死患者临床效果观察及对患者IL-6、IL-10、TNF-α、MMP-9水平影响[J]. 中药药理与临床, 2018, 34(2):104-107. [22] 吴海洋, 王颖, 韩为, 等. 基于NF-κB通路动态观察通督调神针刺对动脉硬化性脑梗死模型大鼠Chemerin水平的影响[J]. 云南中医学院学报, 2018, 41(1):20-24. [23] 马岱朝, 陈会生, 刘辉. 基于网络药理学探讨涤痰汤治疗脑梗死作用机制[J]. 山东中医药大学学报, 2020, 44(4):350-355. [24] 刘盼月, 段淑荣, 曹国娟, 等. 脑梗死后HIF-1α及下游因子VEGF、SDF-1对神经干细胞作用的研究进展[J]. 脑与神经疾病杂志, 2018, 26(6):393-396. -
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