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病理性心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)是常见的心血管病理生理表现，存在于多种心血管疾病，具体机制尚不明确，减轻心肌纤维化可能成为缓解房颤等多种心血管疾病治疗的有效靶点[1-4]，但目前心肌纤维化的治疗尚缺乏有效治疗策略。研究表明，Rho/ROCK/JNK途径调节多种关键细胞功能，可以介导细胞凋亡、增殖、分化等，而抑制JNK和TGFβ/Smad途径可改善2型糖尿病大鼠的心肌纤维化，使RhoA/ROCK/JNK成为预防心肌纤维化的潜在治疗靶点[5- 6]。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ）是从中药黄芪中提取出的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎症、降低血糖等多重药理作用, 并且AS-Ⅳ通过抑制ROS/Caspase-1/GSDMD信号通路可减轻心肌梗死诱导的心肌纤维化和心脏重塑[7-9]。本研究采用异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化，探讨黄芪甲苷对心肌纤维化的改善作用以及对ROCK/JNK信号的调控作用。
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6周龄健康雄性C57/BL小鼠，体质量（20.5±1.1） g，购自空军军医大学实验动物中心[许可证号：SYXK（陕）2019-001]，实验经空军军医大学伦理委员会批准（No.20220262）；Atg5、Beclin-1、LC3 Ⅰ/Ⅱ、ROCK、JNK、GAPDH抗体、黄芪甲苷（美国Sigma-Aldrich公司）；ROCK抑制剂Y-33075（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；异丙肾上腺素（ISO，天津泰泽兴业生物科技有限公司）；BNP试剂盒、结缔组织生长因子（CTGF）试剂盒（美国R＆D Systems公司）；超氧化物阴离子荧光检测探针（DHE，美国ThermoFisher公司）；多功能酶标仪（美国Thermo公司）；Olympus FV2000激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）；小动物超声仪（美国VisualSonics公司）。
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将60只C57/BL小鼠按照随机数字表法随机分成4组，每组15只，即对照组、心肌纤维化组（MF组）、黄芪甲苷组、黄芪甲苷联合ROCK抑制剂Y-33075组（黄芪甲苷+Y-33075组）。各组以普通饲料喂养，MF组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+Y-33075组于小鼠肩胛间皮下注射异丙肾上腺素（ISO），首次剂量为 5 mg/(kg·d)，后以2.5 mg/(kg·d)，重复给药持续30 d，诱导心肌纤维化模型。对照组于同一部位注射相同体积生理盐水。给药组在造模同时给与药物治疗，黄芪甲苷组按100 mg/(kg·d）腹腔注射黄芪甲苷，黄芪甲苷+Y-33075组分别按100 mg/(kg·d）和10 mg/(kg·d)腹腔注射黄芪甲苷和Y-33075，MF组和对照组腹腔注射等量生理盐水，重复给药持续30 d。
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各组小鼠经2%异氟烷麻醉后，四肢插上超声仪电极，探头在乳头肌水平位置用M型取样线检测，测量并计算得出左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室舒张期前壁厚度（LVAWd）、左心室舒张末期容积（LVEDV）等指标。
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固定小鼠，剪开并剥离小鼠颈部皮肤、皮下组织，暴露小鼠颈动脉，剪开快速取血2 ml至EP管中，3000 r/min离心15 min，取上层清亮血清。按照LDH、BNP、CTGF检测试剂盒说明书检测。
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迅速剪下心脏，冷PBS缓冲液冲洗3遍，洗净血细胞后，以多聚甲醛（40 g/L）固定72 h，石蜡包埋、切片，行Masson、天狼星红染色，在光学显微镜下拍摄染色后的Masson、天狼星红图像并保存，使用Image J软件测定Masson染色中胶原阳性蓝色染色面积与组织总面积比值，即胶原容积分数。
心脏在液氮中快速冷冻，并切成3 μm厚的切片。冷冻组织切片在黑暗潮湿的小室中用DHE反应混合物染色。使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜检查每个样品。使用Image J软件测定切片中二氢乙锭的荧光强度，以评估心肌组织中活性氧簇（ROS）的产生。
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测定BNP、CTGF、Atg5的表达评估心肌组织纤维化及自噬水平。用TRIzol试剂从组织中分离总RNA，逆转录实验生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法测定RNA和cDNA的浓度和纯度，PrimerPremier 6.0软件设计引物并合成（上海吉凯基因有限公司）。在iQ™5 RT-PCR系统中进行PCR扩增，采用2−ΔΔct法对靶基因表达量进行相对定量。各检测基因引物序列由美国复能基因公司提供（见表1）。
表 1 相关引物序列
基因 上游序列(5'-3') 下游序列(5'-3') BNP TAGCCAGTCTCCAGAACAAATCC AAACAACCTCAGCCCGTCA CTGF CAGCATGGACGTTCGTCTG AACCACGGTTTGGTCCTTGG Atg5 CAGAAGCTGTTCCGTCCTGT CCGTGAATCATCACCTGGCT GAPDH AGAACATCATCCCTGCATCC AGTTGCTGTTGAAGTCGC -
各组小鼠心肌组织取相同质量放入离心管中，加入预冷PBS，剪碎心肌组织，4℃ 3000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA强裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4℃ 12000 r/min离心30 min，取上清；BCA法蛋白定量；电泳并用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，裁剪目的条带，放入对应ROCK（1∶1000）、JNK（1∶1000）、Beclin 1（1∶1000）、LC3 Ⅰ/Ⅱ（1∶1000）、Atg5（1∶1000）和GAPDH抗体（1∶5000）中，4℃摇床孵育过夜；TBST洗脱3次，5 min/次，将目的条带放入山羊抗兔或抗鼠二抗（1∶5000）中室温摇床孵育2 h，TBST洗脱3次，5 min/次，ECL化学发光液避光检测，Image Lab统计灰度值。
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取小鼠左室前壁组织，石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，用PBS缓冲溶液洗5次，每次3 min，Triton-X100（2 g/L）处理15 min，PBS液冲洗3次，每次3 min，山羊血清室温封闭1.5 h，PBS液洗3次，每次3 min，每个切片加LC3 Ⅰ/Ⅱ抗体（1∶100）50 μl，4 ℃孵育15 h，PBS液洗5次，每次3 min，暗室内每张切片加荧光二抗（1∶500） 50 μl，PBS液洗5次（3 min/次），避光条件下每张切片加DAPI溶液50 μl，PBS液洗5次，每次3 min，用荧光防淬灭液封片，采集图像。
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数据采用GraphPad Prism 9.0软件统计和分析。计量资料以（均数±标准差）表示，多组间比较采用单因素方差分析，随后采用Bonferroni校正及post hoc t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
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与对照组比较，MF组心脏功能明显降低，LVEF、LVEDV显著减小，LVAWd显著增加（P<0.05）；与MF组比较，黄芪甲苷组心脏功能得到明显改善，LVAWd显著减少，LVEF、LVEDV显著增加（P<0.05）；和黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组的LVEF、LVEDV显著降低（P<0.05）。超声结果表明，黄芪甲苷可以改善MF诱发的心脏功能障碍，Y-33075可阻断黄芪甲苷的心肌保护作用（表2）。
表 2 各组小鼠超声测量心功能结果(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+
Y-33075组LVEF (%) 72.31±6.27 35.43±8.12* 55.25±7.43^ 40.28±11.36# LVAWd (mm) 1.51±0.03 1.94±0.25* 1.62±0.20^ 1.71±0.18# LVEDV(μl) 57.92±7.23 49.78±9.36* 56.32±6.28^ 50.79±5.46# *P<0.05，与对照组比较； ^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 与对照组相比，MF组血清中LDH、BNP、CTGF水平显著增加（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达显著增加（P<0.05），Atg5的mRNA表达降低（P<0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组血清LDH、BNP、CTGF水平显著降低（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达减少（P<0.05），Atg5的mRNA表达增加（P<0.05）；黄芪甲苷+Y-33075组血清中LDH、BNP、CTGF水平比黄芪甲苷组显著增加（P<0.05），心肌组织BNP、CTGF的mRNA表达明显增加（P<0.05），Atg5的mRNA表达降低（P<0.05），具体见表3、表4。
表 3 各组小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平比较(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 LDH（U/L） 395.25±30.38 1102.43±62.35* 500.89±19.48^ 974.21±101.72# BNP（ng/L） 80.29±12.90 200.61±31.92* 137.33±19.28^ 194.72±26.31# CTGF（ng/L） 121.91±20.25 213.37±29.58* 163.05±10.29^ 189.03±25.42# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 表 4 各组小鼠心肌组织BNP、CTGF、 Atg5的mRNA相对表达量(n=5)
项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 BNP 1 4.02±0.59* 1.59±0.33^ 3.98±0.49# CTGF 1 1.62±0.23* 0.91±0.37^ 1.54±0.29# Atg5 1 0.53±0.09* 2.56±0.61^ 0.69±0.30# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较 -
心肌组织Masson、天狼星红染色检测各组小鼠心肌组织结构、胶原含量及纤维化水平。对照组小鼠心肌组织无纤维化，胶原含量低；MF组可见心肌结构排列紊乱，肌纤维断裂明显，胶原含量高；与MF组相比，黄芪甲苷组肌纤维排列整齐，纤维化程度改善，胶原含量降低；与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组心肌纤维化程度明显增加，排列紊乱，胶原含量增高(图1)。
图 1 Masson、天狼星红染色检测各组心肌组织纤维化程度（×400, n=5）
黄芪甲苷能够显著减轻脓毒症小鼠心肌组织氧化应激损伤。与对照组相比，MF组小鼠肾组织中ROS生成量显著增加（P<0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组小鼠心肌组织中ROS生成量显著降低（P< 0.05）；而与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组小鼠ROS生成量显著增加（P < 0.05，图2）。
图 2 DHE染色检测各组小鼠心肌组织氧化应激水平（×400, n=5）
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蛋白印迹检测结果提示，与对照组比较，MF组心肌组织中自噬相关蛋白ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平降低（P<0.05）；与MF组比较，黄芪甲苷组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平增高（P<0.05）；而与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+Y-33075组心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平降低（P<0.05），提示黄芪甲苷可以改善MF所致心肌细胞自噬水平的降低，而Y-33075能阻断黄芪甲苷的这一作用（图3）。
图 3 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬（n=5）
心肌LC3- I/II免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，MF组LC3-I/II蛋白免疫荧光染色数量显著减少（P>0.05）；与MF组相比，黄芪甲苷组LC3-I/II蛋白染色的数量显著增加（P<0.05）；与黄芪甲苷组相比，黄芪甲苷+Y-33075组LC3-I/II蛋白免疫荧光染色数量显著减少（P<0.05），结果也提示黄芪甲苷可以改善MF诱发的心肌自噬功能障碍，而Y-33075可阻断黄芪甲苷的这一作用（图4）。
图 4 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬水平的LC3-I/II免疫荧光染色（×400, n=5）
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病理性心肌纤维化是由多种因素引起的，这些因素可导致胶原纤维过度沉积，胶原浓度和体积分数显著增强，心肌胶原类型和结构排列紊乱，是房颤等多种慢性心血管疾病进展中的重要病理过程，然而心肌纤维化在分子水平的具体机制尚不清楚[10-13]。研究表明，多种重要机制参与了病理性心肌纤维化的发展过程，其中包括炎症反应、氧化应激、纤维化、细胞死亡等。近年来发现，自噬和泛素-蛋白酶体系统是维持细胞中蛋白稳态的重要途径，研究表明自噬在心肌纤维化过程中起着重要作用[14-16]。然而，自噬与心肌纤维化的相互作用机制尚不十分清楚，自噬及其调节可能成为治疗心肌纤维化的潜在策略。
近年来多项研究发现，一种来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的黄酮类化合物黄芪甲苷，在心血管相关疾病中发挥了重要的保护作用[13-14]。然而，黄芪甲苷能否减轻心肌纤维化及其潜在分子机制还有待进一步探究。
本研究旨在探讨自噬与小鼠心肌纤维化的关系，并阐明了黄芪甲苷通过上调自噬改善MF的保护机制。根据本研究结果发现，心肌细胞自噬抑制参与了MF进展，同时，黄芪甲苷可激活ROCK/JNK通路促进细胞自噬改善MF，结果从一定从程度上阐明了MF的可能作用机制，并辅助探寻预防和治疗心肌纤维化的潜在靶点。
Rho蛋白激酶(ROCK)是丝氨酸蛋白激酶家族成员， Rho/ROCK途径调节多种关键细胞功能，如基因转录、细胞黏附、神经发育、细胞死亡[5-6]。Rho/ROCK的相关研究有助于更好地阐明多种疾病的病理生理过程，而抑制Rho/ROCK也可能成为潜在治疗靶点[17-19]。细胞自噬在心肌纤维化中起着关键作用，ROCK/.JNK具有自噬调控作用[17]。黄芪甲苷的心脏保护作用是通过激活细胞自噬介导[20-21]。本实验结果表明，在MF模型中，ROCK和JNK表达均下调，而黄芪甲苷组ROCK和JNK表达恢复。Y-33075是ROCK的抑制剂，Y-33075处理后可通过阻断ROCK减弱黄芪甲苷对MF的改善作用。因此，通过抑制ROCK/JNK通路，部分消除了黄芪甲苷对MF的改善作用以及黄芪甲苷调控细胞自噬的影响。
综上，本研究的结果表明黄芪甲苷通过激活ROCK/JNK通路促进自噬发挥保护作用，并发现MF与ROCK/JNK通路介导的自噬有关。然而，自噬在MF等不同疾病的特定阶段的具体作用机制仍不十分明确，自噬、MF以及两者之间的关系需要深入研究与进一步探索。
Alleviation of isoproterenol-induced myocardial fibrosis in mice by autophagy regulated by Astragaloside Ⅳ through activating ROCK/JNK pathway
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摘要:
目的 探讨黄芪甲苷（AS-Ⅳ）激活ROCK/JNK调控自噬，改善异丙肾上腺素（ISO）诱导的小鼠心肌纤维化(MF)的作用及机制。 方法 将小鼠随机分为对照组、ISO诱导心肌纤维化组（MF组）、黄芪甲苷组、黄芪甲苷与Y-33075（ROCK抑制剂）联合组（黄芪甲苷+Y-33075组），重复给药持续30 d后，检测小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平，超声检测心功能指标，天狼猩红、Masson染色检测各组小鼠心肌结构及组织纤维化程度， DHE检测各组小鼠心肌组织氧化应激（ROS）水平，蛋白印迹法检测心肌组织ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达。 结果 与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+Y-33075组的EF值降低，心肌纤维化程度增加，血清LDH、BNP、CTGF水平升高，心肌组织ROS水平增高，ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平表达降低（P<0.05），表明Y-33075能够阻断黄芪甲苷对心肌纤维化的保护作用，并抑制黄芪甲苷对ROCK和JNK的调控。 结论 黄芪甲苷通过激活ROCK/JNK信号促进自噬减轻小鼠心肌纤维化。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of astragaloside Ⅳ(AS-Ⅳ) activating ROCK/JNK to regulate autophagy in improving isoproterenol (ISO) induced myocardial fibrosis (MF) in mice. Methods The mice were randomly divided into control operation group (Control group), ISO induced myocardial fibrosis group (MF group), AS-Ⅳ treatment group (AS-Ⅳ group) and combination group of astragaloside IV and Y-33075 (ROCK inhibitor) (astragaloside IV+Y-33075 group). After repeated administration for 30 days. The serum levels of LDH, BNP, CTGF in each group were detected. The cardiac function was detected by ultrasound. Myocardial structure and tissue fibrosis degree in each group were detected by Sirius Red and Masson staining. Oxidative stress (ROS) levels in myocardial tissue of each group were detected by DHE staining and the expression of ROCK, JNK, Atg5, Beclin 1, and LC3 Ⅰ/Ⅱ in myocardial tissue were detected by Western blotting. Results Compared with AS-Ⅳ group, the EF value of AS-Ⅳ+Y-33075 group decreased and the degree of myocardial fibrosis increased (P<0.05). The serum level of LDH, BNP, CTGF increased and the level of ROS in myocardial tissue increased while the expression of ROCK, JNK, Atg5, Beclin 1, LC3 Ⅰ/Ⅱ decreased (P<0.05). Y-33075 could block the protective effect of AS-Ⅳ on myocardial injury induced by MF and inhibit the regulation of AS-Ⅳ on ROCK and JNK. Conclusion AS-Ⅳ could attenuate myocardial fibrosis in mice by activating ROCK/JNK signal and promoting autophagy. -
Key words:
- myocardial fibrosis /
- autophagy /
- ROCK/JNK /
- astragaloside Ⅳ /
- mice
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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图 1 Masson、天狼星红染色检测各组心肌组织纤维化程度（×400, n=5）
A. Masson染色代表性图像；B.天狼星红染色代表性图像；C.各组心肌组织胶原容积分数；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 2 DHE染色检测各组小鼠心肌组织氧化应激水平（×400, n=5）
A.DHE染色代表性图像；B.各组心肌组织活性氧簇表达水平统计图；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 3 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬（n=5）
A. ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ和GAPDH的免疫印迹图；B-G. ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅰ/Ⅱ和GAPDH的表达水平；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
图 4 Y-33075阻断黄芪甲苷改善MF所致心肌细胞自噬水平的LC3-I/II免疫荧光染色（×400, n=5）
A. LC3-I/II、DAPI和Merge的免疫荧光染色图像；B. LC3-I/II相对荧光强度统计图；*P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
表 1 相关引物序列
基因 上游序列(5'-3') 下游序列(5'-3') BNP TAGCCAGTCTCCAGAACAAATCC AAACAACCTCAGCCCGTCA CTGF CAGCATGGACGTTCGTCTG AACCACGGTTTGGTCCTTGG Atg5 CAGAAGCTGTTCCGTCCTGT CCGTGAATCATCACCTGGCT GAPDH AGAACATCATCCCTGCATCC AGTTGCTGTTGAAGTCGC 
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表 2 各组小鼠超声测量心功能结果(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+
Y-33075组LVEF (%) 72.31±6.27 35.43±8.12* 55.25±7.43^ 40.28±11.36# LVAWd (mm) 1.51±0.03 1.94±0.25* 1.62±0.20^ 1.71±0.18# LVEDV(μl) 57.92±7.23 49.78±9.36* 56.32±6.28^ 50.79±5.46# *P<0.05，与对照组比较； ^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
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表 3 各组小鼠血清LDH、BNP、CTGF水平比较(n=10)
检测项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 LDH（U/L） 395.25±30.38 1102.43±62.35* 500.89±19.48^ 974.21±101.72# BNP（ng/L） 80.29±12.90 200.61±31.92* 137.33±19.28^ 194.72±26.31# CTGF（ng/L） 121.91±20.25 213.37±29.58* 163.05±10.29^ 189.03±25.42# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
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表 4 各组小鼠心肌组织BNP、CTGF、 Atg5的mRNA相对表达量(n=5)
项目 对照组 MF组 黄芪甲苷组 黄芪甲苷+Y-33075组 BNP 1 4.02±0.59* 1.59±0.33^ 3.98±0.49# CTGF 1 1.62±0.23* 0.91±0.37^ 1.54±0.29# Atg5 1 0.53±0.09* 2.56±0.61^ 0.69±0.30# *P<0.05，与对照组比较；^P<0.05，与MF组比较；#P<0.05，与黄芪甲苷组比较
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