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海马为海龙科动物线纹海马（Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder）、刺海马（H. histrix Kaup）、大海马（H. kuda Bleeker）、三斑海马（H. trimaculatus Leach）或小海马（海蛆）（H. japonicus Kaup）的干燥体。性温，味甘、咸，归肝、肾经，具有温肾壮阳，散结消肿的功效[1]。现代研究表明，海马含有氨基酸、甾体、脂肪酸、微量元素和磷脂等化学成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、性激素样作用和增强机体免疫力等多种药理活性[2]。目前，我国中药材市场上的海马品种众多，且不同品种的海马化学成分和药理作用存在差异，因此深入研究不同品种海马的外观及内在差异，使海马资源得到合理利用显得十分重要。何旭辉等[3]发现不同品种海马在鳃盖的嵴纹和头冠处有较明显的区别，使用微性状鉴别法能够简单快捷的区分出不同品种的海马。陈璐[4]通过海马的本草考证、鉴别及药用品种、化学成分检查项等研究，建立了稳定可控的海马质量评价方法，为《中国药典》中海马内容的补充提供了参考依据。闫珍珍等[5]从营养价值和功能性成分方面分析，三斑海马具有高蛋白、低脂肪的特征，且雌海马氨基酸营养价值优于雄性；除尿苷含量低于雄性外，雌海马的胆甾醇和次黄嘌呤含量均高于雄性，该研究发现为特异性开发海马产品提供了科学依据。陈梦等[6]使用DNA条形码分子鉴定技术表明COI、16 S rRNA、ATP6序列作为条形码均可以鉴定三斑海马及其他混伪品海马药材，为保障海马临床用药安全提供了新的技术手段。三斑海马作为我国较为常见的一种海马，资源丰富，在浙江、广东、海南等沿海地区均有分布[7]。为进一步明确三斑海马的化学成分，更合理地开发利用海马资源，本文以三斑海马为研究对象，对其化学成分进行研究，从三斑海马乙醇提取物中分离鉴定了8个化合物（图1），分别为：L-苯丙氨酸（化合物1，图1A）、丙氨酸（化合物2，图1B）、肌苷（化合物3，图1C）、胆固醇（化合物4，图1D）、N-乙酰基酪胺（化合物5，图1E）、尿嘧啶（化合物6，图1F）、D-甘露醇（化合物7，图1G）、河豚素（化合物8，图1H）。其中，N -乙酰基酪胺 、D-甘露醇、河豚素为首次从三斑海马中分离得到。
图 1 三斑海马分离出的 8 种化合物结构
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实验用海马药材购自安徽亳州药材市场，经海军军医大学辛海量教授鉴定为海龙科动物三斑海马（Hippocampus trimaculatus Leach）的干燥体。
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Bruker DRX-600 MHz 核磁共振仪（TMS内标，德国Bruker公司）；1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；柱层析硅胶、GF254薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（GE Pharmacia公司）；ACE 3 C18-PFP色谱柱（3.0 mm×150 mm, 3.0 μm, 美国Agilent公司）；其余试剂为分析纯。
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干燥三斑海马药材1.74 kg，剪碎后10倍量95%乙醇浸泡过夜，85 ℃加热回流提取3次，每次2 h，10倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，65 ℃减压浓缩至无醇味。提取物经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(20:1、10:1、5:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(10:1、5:1、1:1)、甲醇洗脱，薄层色谱检测，合并相同流份后，得到H-1~H-9共9个组分。
H-1~H-3组分合并后经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 10:1、5:1、2:1）分离，葡聚糖凝胶柱色谱纯化得到化合物1（11 mg）。H-4~H-6组分合并，经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯 10:1、5:1、1:1）分离，合并较纯斑点，再经反相C18柱，葡聚糖凝胶柱色谱（40%甲醇）纯化2次，硅胶柱色谱分离得到化合物2 （19 mg）和 化合物3（39 mg）。H-7和H-8组分合并后甲醇溶解，溶解部分经反相C18柱分离，收集7-1至7-7共7个组分。7-1经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 1:1）分离，反相体系分离，葡聚糖凝胶柱色谱（40%甲醇）纯化2次，再经硅胶柱色谱纯化，培养结晶析出白色固体，得到化合物8（9 mg）。7-2经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇1:1）分离，葡聚糖凝胶柱色谱(45%甲醇)纯化2次，得到化合物4（15 mg）和化合物5（7 mg）。7-4经硅胶柱色谱(乙酸乙酯-甲醇 1:1)分离，再经反相C18柱色谱(10%甲醇)，葡聚糖凝胶柱色谱，硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇 2:1)纯化，得到化合物7（6 mg）。H-9组分经硅胶柱色谱（乙酸乙酯-甲醇 1:1），反相C18柱色谱（10%甲醇），葡聚糖凝胶柱色谱分离后，合并较纯斑点，析出固体过滤，得到化合物6（9 mg）。三斑海马提取分离过程见图2。
图 2 三斑海马提取分离流程图
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化合物1为白色粉末，分子式为C9H11NO2。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 7.38 (2H, dd, J=7.4, 6.8 Hz, H-3', 5'), 7.33 (1H, t, J=6.9 Hz, H-4'), 7.27 (2H, dd, J=7.4, 6.8 Hz, H-2', 6'), 3.93 (1H, dd, J=7.9, 5.2 Hz, H-2), 3.24 (1H, m, H-3a), 3.06 (1H, m, H-3b); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 36.4 (C-3), 56.1 (C-2), 127.7 (C-4′), 129.1 (C-3′, 5′), 129.4 (C-2′, 6′), 135.1 (C-1′), 173.9 (C-1)。该化合物核磁共振数据与参考文献[8]基本一致，确定化合物为L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)。
化合物2为白色固体，分子式为C3H7NO2。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.70 (1H, q, J=6.4 Hz, H-2), 1.40 (3H, d, J=6.4 Hz, H-3); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 16.1 (C-3), 50.6 (C-2), 175.8 (C-1)。该化合物核磁共振数据与参考文献[9]基本一致，确定化合物为丙氨酸(alanine)。
化合物3为白色固体，分子式为C10H12N4O5。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.76 (1H, m, H-5'), 3.54 (1H, m, H-5'), 4.21 (1H, m, H-3'), 4.36 (1H, m, H-2'), 6.00 (1H, d, J=5.7 Hz, H-1'), 8.12 (1H, s, H-2), 8.24 (1H, s, H-8); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ : 61.3 (C-5′), 70.4 (C-3′), 74.1 (C-2′), 85.5 (C-4′), 88.4 (C-1′), 124.2 (C-5), 140.2 (C-2), 146.1 (C-8), 148.4 (C-4), 158.4 (C-6)。该化合物核磁共振数据与参考文献[10]基本一致，确定化合物为肌苷(inosine)。
化合物4为针状结晶，分子式为C27H46O。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ : 5.37 (1H, m, H-6), 3.55 (1H, m, H-3), 0.68 (3H, s, H-18); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ : 11.9 (C-18), 18.7 (C-21), 19.4 (C-19), 21.1 (C-11), 22.5 (C-26), 22.8 (C-27), 23.8 (C-15), 24.3 (C-23), 28.0 (C-25), 28.2 (C-12), 29.7 (C-2), 31.7 (C-8), 31.9 (C-7), 35.8 (C-20), 36.2 (C-22), 36.5 (C-10), 37.3 (C-1), 39.5 (C-24), 39.8 (C-16), 42.3 (C-13), 42.3 (C-4), 50.2 (C-9), 56.2 (C-17), 56.8 (C-14), 71.8 (C-3), 121.7 (C-6), 140.8 (C-5)。该化合物核磁共振数据与参考文献[11]基本一致，确定化合物为胆固醇(cholesterol)。
化合物5为褐色固体，分子式为C10H13NO2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 6.96 (2H, d, J=1.8 Hz, H-2, 6), 6.68 (2H, d, J=1.8 Hz, H-3, 5), 2.73 (2H, m, H-8), 2.55 (2H, m, H-7), 1.74 (3H, s, CH3); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 24.6 (CH3), 38.2 (C-7), 43.6 (C-8), 115.6 (C-3, 5), 129.8 (C-2, 6), 156.4 (C-4), 176.7 (C-10)。该化合物核磁共振数据与参考文献[12]基本一致，确定化合物为N-乙酰基酪胺(N-acetyltyramine)。
化合物6为类白色固体，分子式为C4H4N2O2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 5.45 (1H, d, J=7.5 Hz, H-5), 7.40 (1H, d, J=7.5 Hz, H-6), 10.81 (1H, br s, NH), 11.00 (1H, br s, NH); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 100.7 (C-5), 142.6 (C-6), 151.9 (C-2), 164.8 (C-4)。该化合物核磁共振数据与参考文献[13]基本一致，确定化合物为尿嘧啶(uracil)。
化合物7为白色固体，分子式为C6H14O6。1H NMR (600 MHz, D2O) δ : 3.80 (2H, m), 3.73 (2H, m), 3.70 (2H, m), 3.61 (2H, m); 13C NMR (150 MHz,D2O) δ : 63.2 (C-1, 6), 69.3 (C-3, 4), 70.9 (C-2, 5)。该化合物核磁共振数据与参考文献[14]基本一致，确定化合物为D-甘露醇(D-mannitol)。
化合物8为白色固体，分子式为C4H8SO2Cl2。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ : 3.36 (2H, t, J=6.6 Hz), 3.19 (2H, t, J=6.6 Hz); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ : 35.4, 47.5。该化合物核磁共振数据与参考文献[15]基本一致，确定化合物为河豚素 (tetrodoine)。
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近年来，海洋生物因其次生代谢产物具有独特的结构骨架和特殊的药理活性受到了广泛关注，海马作为常见的海洋动物，同时也是经济价值较高的名贵中药，药用历史悠久、疗效显著，备受关注。研究发现，海马中含有多种化学成分，包括胆固醇、胆甾-4-烯-3-酮、胆甾-5-烯-3β, 7α-二醇等甾体化合物；苯丙氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、牛磺酸等多种氨基酸；SHP-1、HTP-1、HKPLP等多肽类成分；十四酸、EPA、DHA等脂肪酸类成分，以及核酸类、糖蛋白、肌酸酐等。药理研究表明，海马提取物可改善肾阳虚模型动物的体征，提高性激素水平；可通过调节NF-κB和MAPK信号通路抑制炎症因子的释放从而发挥抗炎作用；可通过清除自由基发挥抗氧化作用；还可增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，提高免疫力等；此外，海马提取物对骨质疏松的防治具有一定的作用，为动物药抗骨质疏松研究提供了新方向[2,7,16-19]。
本研究从三斑海马中分离得到了8个化合物，其中N-乙酰基酪胺、D-甘露醇、河豚素为首次从三斑海马中分离得到，进一步明确了三斑海马的化学成分。赵晓喆等[20]采用核磁代谢组学技术在三斑海马甲醇提取物中指认出33种化学成分，其中包括丙氨酸、苯丙氨酸和肌苷。陈璐[4]通过HPLC-MS分析得到海马化学成分中含有核酸类成分3种，即尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤；此外，从海马中分离鉴定出的甾体类化合物以胆固醇为主，占总胆甾醇的59.02%~95.99%。José等[21]从溶藻弧菌的菌株M3-10中分离到了N-乙酰基酪胺，发现其具有较高的细菌群体感应抑制剂的活性，并且N-乙酰基酪胺可逆转阿霉素耐药白血病P388细胞的耐药性[22]，提示在中药海马中N-乙酰基酪胺可能通过独特的途径参与发挥抗菌抗炎作用。甘露醇是临床常用的脱水剂，在治疗脑水肿、降低颅内压等方面发挥重要作用，具有清除自由基、抗氧化等活性[23]，可能参与中药海马的抗氧化过程。基于海马显著的药效活性，深入探究海马的药效物质基础，对中药海马进一步的开发和应用具有非常重要的意义。
Study on chemical constituents of Hippocampus trimaculatus Leach
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摘要:
目的 研究三斑海马的化学成分。 方法 采用乙醇提取和硅胶柱色谱、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱、反相C18柱色谱等方法对三斑海马化学成分进行分离纯化，通过理化性质、波谱数据和文献对比，对得到的化合物进行结构鉴定。 结果 从三斑海马中分离得到8个化合物，分别鉴定为：L-苯丙氨酸(1)、丙氨酸(2)、肌苷(3)、胆固醇(4)、N-乙酰基酪胺(5)、尿嘧啶(6)、D-甘露醇(7)、河豚素(8)。 结论 化合物5、7、8为首次从三斑海马中分离得到。 Abstract:Objective To study the chemical constituents of Hippocampus trimaculatus Leach. Methods After extracted with ethanol, Hippocampus trimaculatus Leach was isolated and purified by silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography, and reversed-phase C18 column chromatography. The structures of compounds were identified by physical and chemical properties, spectral data and literature comparison. Results Eight compounds were isolated from Hippocampus trimaculatus Leach and identified as L-phenylalanine (1), alanine (2), inosine (3), cholesterol (4), N-acetyltyramine (5), uracil (6), D-mannitol (7), tetrodoine (8), respectively. Conclusion Compounds 5, 7, 8 are isolated from Hippocampus trimaculatus Leach for the first time. -
新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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