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中药沪地龙为上海市的唯一道地药材，具有突出的定惊，通络，平喘和利尿功效。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少等证[1]。当前，心脑血管疾病的发病率增高，该药是治疗这类疾病的中成药组方中重要组成成分[2-3]。地龙药用市场需求量从2010年的400 t已上涨至2020年的1100 t，并仍呈上涨趋势。沪地龙主产于上海，20世纪60年代供应量占全国地龙销售量的2/3，自1995年起被历版《中国药典》收载[4]。然而，随着上海城市化进程的发展、农业上化肥和农药的大量使用以及蔬菜大棚面积的扩大，沪地龙的原动物蚯蚓的生存条件遭受严重破坏，以致可得蚯蚓的数量明显减少，从而导致沪地龙药材的产量也急剧下降。目前沪地龙药材的产量已无法满足市场需求，人工养殖技术尚未取得实质性进展[5]。而且地龙来源复杂，采收混乱，近年来伪品地龙大量混入市场[6]。为满足市场对沪地龙药材的需求，确保人民的用药安全，解决沪地龙资源紧缺的问题，开展沪地龙的人工养殖研究迫在眉睫。本课题参照中药材生产质量管理规范的要求[7-8]，对沪地龙药材原动物的品种来源和鉴定、养殖环境、养殖方法、采收加工和包装运输进行研究，提出了作物和蚯蚓套养的新方法，考察了养殖蚯蚓对土壤改善的作用，并制订了相关的操作规程。
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沪地龙的品种按药典规定原动物为3个种，分别为环节动物门、寡毛纲、钜蚓科动物威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen[1]（图1）。
图 1 药典规定的沪地龙3种原动物形态
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我国是蚯蚓种数的大国，现有蚯蚓记录已达9科28属640种[9]，陆续还有新物种被发现[10]。蚯蚓的外部形态，如大小、颜色和环节数有较多的相似之处，所以鉴定蚯蚓除了一般的外部形态鉴定外，还必须进行解剖，对其有重要鉴别特征的盲肠和受精囊的形态特征进行观察，从而获得正确的鉴定结果。
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体长96～150 mm，宽5～8 mm。体节数88～156，背面颜色青黄，或灰青色。背中线深青色。环带于14～16节，戒指状，无刚毛。身体上刚毛较细，前段腹面并不粗而疏。13～22（Ⅷ）在受精囊孔间，13～21在雄孔之间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内。陷入时呈纵裂缝（图2A-1），内壁有褶皱，褶皱间有刚毛2～3条，在腔底突起上为雄孔，突起前面常有一乳突。受精囊3对（图2A-2），在6/7～8/9节间，孔在一横裂中小突上。无受精囊腔。隔膜8/9，9/10缺失。盲肠简单（图2A-3）。受精囊的盲管内端2/3在平面上，左右弯曲，为纳精囊，与管分明（图2A-4）。
图 2 沪地龙解剖鉴别要点
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本种身体大小、色泽及内部构造和前种相似。体长130～150 mm，宽5～7 mm。环带位于14～16节，戒指状，无刚毛。体上刚毛环生，13～18（Ⅷ）在受精囊孔间，9～13在雄孔间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内（图2B-1）。唯受精囊腔较深广，前后缘均隆肿（图2B-2），外面可见腔内大小乳突各一。雄交配腔亦深广，内壁多皱纹，有平顶乳突3个。盲管内端2/3在同一平面上左右弯曲，与外端1/3的管状有明显区别（图2B-3）。受精囊在第9节呈一定角度的弯曲（图2B-4）。
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体长100～150 mm，宽5～9 mm，背面及侧面有深紫颜色或紫红色，刚毛圈不白。环带占3节，无刚毛。身体前部刚毛虽粗，在2～9节并不特殊粗。28～34（Ⅷ）在受精囊孔间，20～36在雄孔之间。雄生殖孔在一“十”字形突的中央，常由一浅囊状皮褶盖住（图2C-1），内侧有一个或多个乳头，其排列变化很大。受精囊孔3对，位6/7至8/9节间，孔常常陷入（图2C-2），孔的内侧腹面在刚毛圈前或后，有乳头突，排列较规则。盲肠复式，其腹侧有栉状小囊（图2C-3）。副性腺有索状短管。盲管较受精囊本体长，内端3/4稍粗，或直或稍弯曲（图2C-4）。以上特征符合蚯蚓分类的描述[11]。
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沪地龙长8～15 cm，宽0.5～1.5 cm。全体具环节，背部棕褐色至黄褐色，腹部浅黄棕色；受精囊孔3对，在6/7至8/9环节间。第14～16环节为生殖带，较光亮。第18环节有一对雄生殖孔。通俗环毛蚓的雄交配腔能全部翻出，呈花菜状或阴茎状；威廉环毛蚓的雄交配腔呈纵向裂缝状；栉盲环毛蚓的雄生殖孔内侧有1或多个小乳突[1]。沪地龙药材形态见图3。
图 3 沪地龙药材形态
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根据蚯蚓喜欢安静的生活习性，养殖蚯蚓的地点须选择在离公路50 m以远的地方，周围没有化工厂，没有噪声源、震动源等工厂企业。有自然水源。空气清新。土壤要求腐殖土，pH为6.5～7.5。
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饲养蚯蚓的土地四周需挖水沟，其中分成多个畦，每畦宽度根据需要可达1.5～2.0 m，两畦间挖一宽30～50 cm，深30 cm的沟。经常保持周围和中间沟内的水量达2/3高度（冬天需降至1/4高度）。土壤的湿度保持在60%～70%。水沟中可种植芹菜或养殖黄鳝和泥鳅。水质要求卫生安全无污染，可利用附近的河水及雨水。
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蚯蚓的投放选择在春秋二季，气温在15～20 ℃之间。在蚯蚓苗地里挖出蚯蚓，选取符合沪地龙3个种基原要求的蚯蚓，并挑选活动能力强、无损伤的蚯蚓，按每亩地放30～50 kg鲜蚯蚓，分撒在用水浇湿的土地里，蚯蚓将自动钻入泥土中。
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选用发酵至少6个月的牛粪、猪粪、鸡粪或人工有机肥。按每亩田4～6 t的量投放。可一次投放，也可分2次投放。在畦上适时投放菜叶和粉碎或切断的秸秆。
为摸索牛粪（上海光明奶牛场供）、猪粪（崇明新村乡饲养场供）、鸡粪（崇明西新村农家供）或人工有机肥（上海聚源有机肥有限公司）对蚯蚓生长和繁殖的效果，比较在同一块地（分隔3块）投放相同量的饲料，1年后蚯蚓的生长情况（图4），结果表明牛粪和猪粪作为养殖蚯蚓饲料的效果最好。
图 4 不同蚯蚓饲料对蚯蚓增长的影响
在上海4月间的崇明区三星镇西新村养殖地里按每亩地放入30 kg鲜活蚯蚓（经鉴定为威廉环毛蚓），随后按每亩地放4 t经发酵后的牛粪，田里种芋艿。次年4月分散选择3个1 m2的土地，挖取蚯蚓称重，并计算每亩地里蚯蚓的产量。第3年、第4年仍旧按该方法操作，3年后的蚯蚓生长情况见图5。结果表明，在牛粪作为蚯蚓饲料的养殖下，蚯蚓3年的繁殖量达到500 kg，可以进行收获。
图 5 蚯蚓养殖年度产量
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人工养殖蚯蚓必须与农作物套养，否则养殖地不能获得经济效益，农民也就会失去养殖的积极性。而植物的生长好坏又与土质的改善有密切的关系。不同蚯蚓饲料的投放对蚯蚓生长地土质的改善有不同的结果。土壤的容重的改变是土地质量变化的重要指标。土壤的容重降低，表示土壤的团粒结构更好，更有利于作物的良好生长。按照测定土壤容重通常使用的环刀法[12]，对不同蚯蚓饲料投放的蚯蚓生长土地进行容重的测定，土壤容重改变的测试结果如下（表1）。由此可见，虽然牛粪和猪粪做饲料使蚯蚓的生长达到近乎相同的效果，但对于土壤的改善作用牛粪较猪粪的效果更胜一筹。所以在猪粪和牛粪同时可得的情况下，使用牛粪效果更好。
表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 -
使用农作物套种养殖蚯蚓的方法是本课题的创新点。如在农田里单独养殖蚯蚓，不但浪费土地资源，而且不可能达到理想的经济效益，蚯蚓的人工养殖方法就无法推广。所以必须在蚯蚓地里套种农作物，以期获得蚯蚓和农作物双双得利的效果。由于使蚯蚓生长良好的土壤其湿度要求在60%～70%的程度，所以必须选择能在这一土壤湿度下也能生长良好的作物品种，以适应蚯蚓喜潮湿土地的特性。此外，在夏天能有叶大能遮阳的植物，则更能降低土壤表面的温度，有利于蚯蚓晚间外出觅食。经试验，花菜、芋艿、玉米和卷心菜等能符合这一要求，而地瓜、马铃薯和山药等作物因不宜在60%～70%的土地湿度中生长，故不宜作为和蚯蚓套种的作物。由于养殖蚯蚓能使土壤松软，蚯蚓排出的粪便能增加土壤的肥力，套种作物的产量也获得了提高，从而明显地提高农民获得的经济效益，见表2。
表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800 -
根据套种作物的生长习性，调节生长密度。经常除草。尽量不用杀虫药和除草剂，如作物生长的要求必须使用，应按国家的规定使用低毒和最小有效剂量。使用前一星期起降低水沟里的水量。蚯蚓养殖地内要经常灌水，其中水沟的水要经常保持在2/3的高度。盛夏土地的表面也要常喷水。在蚯蚓的养殖中要注意除去蚯蚓的天敌，如野鼠、家鼠、黄鼬、蜈蚣和蚂蚁等，防止他们进入养殖区造成对蚯蚓的损害。
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①利用插秧前稻田灌水后，蚯蚓自动游到田埂上避水，此时进行人工抓捕。②在养殖的蚯蚓田里，当一季作物收割后，在水沟里放水。此时蚯蚓自动爬到土埂上避水，可进行人工抓捕。③在一种作物收割后至另一种作物栽种前的间歇期内挖土捕捉蚯蚓。④选择在每年的4～5月或10月捕捉蚯蚓。⑤温和湿润的天气，在蚯蚓养殖地人工挖掘。⑥严格禁止用电击方法捕捉蚯蚓。
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将捕捉的蚯蚓用清水冲去体表的泥沙，分批放入草木灰中2 min，蚯蚓即失去活动能力。取出后用清水冲去表面草木灰，逐条加入到蚯蚓剖切机内。经全剖切后的蚯蚓用清水淘洗2～3次，除去泥沙。逐条挂在竹杆上至室外晒干。也可将洗净的蚯蚓放在挂空的尼龙网或不锈钢网上晒干。如遇下雨天，则可分摊放入具细孔的不锈钢盘内，置60 ℃烘房中烘8 h至干。
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地龙药材的标准按《中华人民共和国药典》一部地龙项记载的要求执行[1]。内容包括检查杂质不得过6%、水分不得过12.0%、总灰分不得过10.0%、酸不溶性灰分不得过5.0%、重金属不得过30 mg/kg、每1000 g中含黄曲霉素B1不得过5 µg，黄曲霉素G2、黄曲霉素G1、黄曲霉素B2和黄曲霉素B1的总量不得过10 µg。水溶性浸出物不得少于16.0%。该基地地龙药材经上海市食品药品检验院检测（报告书编号：YW202105450），杂质为0.2%，水分为10.3%，总灰分为5.9%，酸不溶性灰分为1.0%，重金属符合规定。黄曲霉素B1小于检出限0.5 µg/kg，黄曲霉素B20.2 µg/kg、黄曲霉素G10.5 µg/kg、黄曲霉素G20.2 µg/kg，和黄曲霉素B1的总量小于10 µg/kg。水溶性浸出物为25.9%。
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干燥后的地龙药材在包装前应仔细检查是否已充分干燥，并清除杂质和异物。后置药用级的塑料包装中，包装袋表面贴上药材的溯源码。溯源码包括生产企业、地龙基源、栽培方式和环境、养殖管理、采收加工的时间和方法。
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地龙药材应储存于阴凉干燥的仓库里，仓库的地面应有木质或塑料堆放架。库房注意防虫防鼠。
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地龙的运输应遵循及时、准确、安全、经济的原则。将固定的运输工具清洗干净，每件地龙捆扎好，遮盖严密，及时运往贮藏地点。不得雨淋、日晒，长时间滞留在外，不得与其他有毒、有害物质混装，避免污染。
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中药的规范化种植和管理是确保中药质量安全有效的重要环节。国家药品监督局等4部委今年再次颁布了《中药材生产质量管理规范（GAP）》的要求[7]，说明中药材规范化种植和管理的重要性。动物类药材养殖往往较植物类药材的种植更具复杂性。本课题组数年来对沪地龙的养殖不断的进行探索，在此基础上提出了沪地龙规范养殖的新方法，为解决沪地龙规模化和可持续的人工养殖、缓解沪地龙的资源紧缺提供了可行的途径。
Study on the good agricultural practice for Shanghai Pheretima
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摘要:
目的 制定沪地龙生产质量管理规范（GAP）。 方法 按照我国中药材GAP规范化生产的综合技术要求，在上海市崇明区三星镇开展规范化养植和加工关键技术研究。 结果 明确规范了沪地龙的产地环境、品种特征、养殖技术、病虫害防治、采收加工、包装储藏运输、质量监测等技术环节。 结论 为沪地龙的标准化和现代化质量管理提供操作依据。 -
关键词:
- 沪地龙 /
- 中药材生产质量管理规范 /
- 人工养殖 /
- 标准操作规程
Abstract:Objective To establish the Good Agricultural Practice（GAP）for standard operation procedure of Shanghai Pheretima. Methods According to the comprehensive technical requirements of GAP standardized production of Chinese herbal medicine, the key technologies of standardized cultivation and processing were studied in Sangxin Town, Chongming District, Shanghai. Results The production area environment, variety characteristics, breeding technology, pest control, harvesting and processing, packaging, storage and transportation, quality monitoring and other technical links of Shanghai Pheretima were clearly defined and standardized. Conclusion This study provides practical basis for the standardization and modernization quality management of Shanghai Pheretima. -
Key words:
- Shanghai Pheretima /
- GAP /
- artificial culture /
- standard operating procedure
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 
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表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800
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