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中药沪地龙为上海市的唯一道地药材，具有突出的定惊，通络，平喘和利尿功效。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少等证[1]。当前，心脑血管疾病的发病率增高，该药是治疗这类疾病的中成药组方中重要组成成分[2-3]。地龙药用市场需求量从2010年的400 t已上涨至2020年的1100 t，并仍呈上涨趋势。沪地龙主产于上海，20世纪60年代供应量占全国地龙销售量的2/3，自1995年起被历版《中国药典》收载[4]。然而，随着上海城市化进程的发展、农业上化肥和农药的大量使用以及蔬菜大棚面积的扩大，沪地龙的原动物蚯蚓的生存条件遭受严重破坏，以致可得蚯蚓的数量明显减少，从而导致沪地龙药材的产量也急剧下降。目前沪地龙药材的产量已无法满足市场需求，人工养殖技术尚未取得实质性进展[5]。而且地龙来源复杂，采收混乱，近年来伪品地龙大量混入市场[6]。为满足市场对沪地龙药材的需求，确保人民的用药安全，解决沪地龙资源紧缺的问题，开展沪地龙的人工养殖研究迫在眉睫。本课题参照中药材生产质量管理规范的要求[7-8]，对沪地龙药材原动物的品种来源和鉴定、养殖环境、养殖方法、采收加工和包装运输进行研究，提出了作物和蚯蚓套养的新方法，考察了养殖蚯蚓对土壤改善的作用，并制订了相关的操作规程。
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沪地龙的品种按药典规定原动物为3个种，分别为环节动物门、寡毛纲、钜蚓科动物威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen[1]（图1）。
图 1 药典规定的沪地龙3种原动物形态
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我国是蚯蚓种数的大国，现有蚯蚓记录已达9科28属640种[9]，陆续还有新物种被发现[10]。蚯蚓的外部形态，如大小、颜色和环节数有较多的相似之处，所以鉴定蚯蚓除了一般的外部形态鉴定外，还必须进行解剖，对其有重要鉴别特征的盲肠和受精囊的形态特征进行观察，从而获得正确的鉴定结果。
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体长96～150 mm，宽5～8 mm。体节数88～156，背面颜色青黄，或灰青色。背中线深青色。环带于14～16节，戒指状，无刚毛。身体上刚毛较细，前段腹面并不粗而疏。13～22（Ⅷ）在受精囊孔间，13～21在雄孔之间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内。陷入时呈纵裂缝（图2A-1），内壁有褶皱，褶皱间有刚毛2～3条，在腔底突起上为雄孔，突起前面常有一乳突。受精囊3对（图2A-2），在6/7～8/9节间，孔在一横裂中小突上。无受精囊腔。隔膜8/9，9/10缺失。盲肠简单（图2A-3）。受精囊的盲管内端2/3在平面上，左右弯曲，为纳精囊，与管分明（图2A-4）。
图 2 沪地龙解剖鉴别要点
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本种身体大小、色泽及内部构造和前种相似。体长130～150 mm，宽5～7 mm。环带位于14～16节，戒指状，无刚毛。体上刚毛环生，13～18（Ⅷ）在受精囊孔间，9～13在雄孔间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内（图2B-1）。唯受精囊腔较深广，前后缘均隆肿（图2B-2），外面可见腔内大小乳突各一。雄交配腔亦深广，内壁多皱纹，有平顶乳突3个。盲管内端2/3在同一平面上左右弯曲，与外端1/3的管状有明显区别（图2B-3）。受精囊在第9节呈一定角度的弯曲（图2B-4）。
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体长100～150 mm，宽5～9 mm，背面及侧面有深紫颜色或紫红色，刚毛圈不白。环带占3节，无刚毛。身体前部刚毛虽粗，在2～9节并不特殊粗。28～34（Ⅷ）在受精囊孔间，20～36在雄孔之间。雄生殖孔在一“十”字形突的中央，常由一浅囊状皮褶盖住（图2C-1），内侧有一个或多个乳头，其排列变化很大。受精囊孔3对，位6/7至8/9节间，孔常常陷入（图2C-2），孔的内侧腹面在刚毛圈前或后，有乳头突，排列较规则。盲肠复式，其腹侧有栉状小囊（图2C-3）。副性腺有索状短管。盲管较受精囊本体长，内端3/4稍粗，或直或稍弯曲（图2C-4）。以上特征符合蚯蚓分类的描述[11]。
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沪地龙长8～15 cm，宽0.5～1.5 cm。全体具环节，背部棕褐色至黄褐色，腹部浅黄棕色；受精囊孔3对，在6/7至8/9环节间。第14～16环节为生殖带，较光亮。第18环节有一对雄生殖孔。通俗环毛蚓的雄交配腔能全部翻出，呈花菜状或阴茎状；威廉环毛蚓的雄交配腔呈纵向裂缝状；栉盲环毛蚓的雄生殖孔内侧有1或多个小乳突[1]。沪地龙药材形态见图3。
图 3 沪地龙药材形态
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根据蚯蚓喜欢安静的生活习性，养殖蚯蚓的地点须选择在离公路50 m以远的地方，周围没有化工厂，没有噪声源、震动源等工厂企业。有自然水源。空气清新。土壤要求腐殖土，pH为6.5～7.5。
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饲养蚯蚓的土地四周需挖水沟，其中分成多个畦，每畦宽度根据需要可达1.5～2.0 m，两畦间挖一宽30～50 cm，深30 cm的沟。经常保持周围和中间沟内的水量达2/3高度（冬天需降至1/4高度）。土壤的湿度保持在60%～70%。水沟中可种植芹菜或养殖黄鳝和泥鳅。水质要求卫生安全无污染，可利用附近的河水及雨水。
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蚯蚓的投放选择在春秋二季，气温在15～20 ℃之间。在蚯蚓苗地里挖出蚯蚓，选取符合沪地龙3个种基原要求的蚯蚓，并挑选活动能力强、无损伤的蚯蚓，按每亩地放30～50 kg鲜蚯蚓，分撒在用水浇湿的土地里，蚯蚓将自动钻入泥土中。
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选用发酵至少6个月的牛粪、猪粪、鸡粪或人工有机肥。按每亩田4～6 t的量投放。可一次投放，也可分2次投放。在畦上适时投放菜叶和粉碎或切断的秸秆。
为摸索牛粪（上海光明奶牛场供）、猪粪（崇明新村乡饲养场供）、鸡粪（崇明西新村农家供）或人工有机肥（上海聚源有机肥有限公司）对蚯蚓生长和繁殖的效果，比较在同一块地（分隔3块）投放相同量的饲料，1年后蚯蚓的生长情况（图4），结果表明牛粪和猪粪作为养殖蚯蚓饲料的效果最好。
图 4 不同蚯蚓饲料对蚯蚓增长的影响
在上海4月间的崇明区三星镇西新村养殖地里按每亩地放入30 kg鲜活蚯蚓（经鉴定为威廉环毛蚓），随后按每亩地放4 t经发酵后的牛粪，田里种芋艿。次年4月分散选择3个1 m2的土地，挖取蚯蚓称重，并计算每亩地里蚯蚓的产量。第3年、第4年仍旧按该方法操作，3年后的蚯蚓生长情况见图5。结果表明，在牛粪作为蚯蚓饲料的养殖下，蚯蚓3年的繁殖量达到500 kg，可以进行收获。
图 5 蚯蚓养殖年度产量
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人工养殖蚯蚓必须与农作物套养，否则养殖地不能获得经济效益，农民也就会失去养殖的积极性。而植物的生长好坏又与土质的改善有密切的关系。不同蚯蚓饲料的投放对蚯蚓生长地土质的改善有不同的结果。土壤的容重的改变是土地质量变化的重要指标。土壤的容重降低，表示土壤的团粒结构更好，更有利于作物的良好生长。按照测定土壤容重通常使用的环刀法[12]，对不同蚯蚓饲料投放的蚯蚓生长土地进行容重的测定，土壤容重改变的测试结果如下（表1）。由此可见，虽然牛粪和猪粪做饲料使蚯蚓的生长达到近乎相同的效果，但对于土壤的改善作用牛粪较猪粪的效果更胜一筹。所以在猪粪和牛粪同时可得的情况下，使用牛粪效果更好。
表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 -
使用农作物套种养殖蚯蚓的方法是本课题的创新点。如在农田里单独养殖蚯蚓，不但浪费土地资源，而且不可能达到理想的经济效益，蚯蚓的人工养殖方法就无法推广。所以必须在蚯蚓地里套种农作物，以期获得蚯蚓和农作物双双得利的效果。由于使蚯蚓生长良好的土壤其湿度要求在60%～70%的程度，所以必须选择能在这一土壤湿度下也能生长良好的作物品种，以适应蚯蚓喜潮湿土地的特性。此外，在夏天能有叶大能遮阳的植物，则更能降低土壤表面的温度，有利于蚯蚓晚间外出觅食。经试验，花菜、芋艿、玉米和卷心菜等能符合这一要求，而地瓜、马铃薯和山药等作物因不宜在60%～70%的土地湿度中生长，故不宜作为和蚯蚓套种的作物。由于养殖蚯蚓能使土壤松软，蚯蚓排出的粪便能增加土壤的肥力，套种作物的产量也获得了提高，从而明显地提高农民获得的经济效益，见表2。
表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800 -
根据套种作物的生长习性，调节生长密度。经常除草。尽量不用杀虫药和除草剂，如作物生长的要求必须使用，应按国家的规定使用低毒和最小有效剂量。使用前一星期起降低水沟里的水量。蚯蚓养殖地内要经常灌水，其中水沟的水要经常保持在2/3的高度。盛夏土地的表面也要常喷水。在蚯蚓的养殖中要注意除去蚯蚓的天敌，如野鼠、家鼠、黄鼬、蜈蚣和蚂蚁等，防止他们进入养殖区造成对蚯蚓的损害。
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①利用插秧前稻田灌水后，蚯蚓自动游到田埂上避水，此时进行人工抓捕。②在养殖的蚯蚓田里，当一季作物收割后，在水沟里放水。此时蚯蚓自动爬到土埂上避水，可进行人工抓捕。③在一种作物收割后至另一种作物栽种前的间歇期内挖土捕捉蚯蚓。④选择在每年的4～5月或10月捕捉蚯蚓。⑤温和湿润的天气，在蚯蚓养殖地人工挖掘。⑥严格禁止用电击方法捕捉蚯蚓。
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将捕捉的蚯蚓用清水冲去体表的泥沙，分批放入草木灰中2 min，蚯蚓即失去活动能力。取出后用清水冲去表面草木灰，逐条加入到蚯蚓剖切机内。经全剖切后的蚯蚓用清水淘洗2～3次，除去泥沙。逐条挂在竹杆上至室外晒干。也可将洗净的蚯蚓放在挂空的尼龙网或不锈钢网上晒干。如遇下雨天，则可分摊放入具细孔的不锈钢盘内，置60 ℃烘房中烘8 h至干。
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地龙药材的标准按《中华人民共和国药典》一部地龙项记载的要求执行[1]。内容包括检查杂质不得过6%、水分不得过12.0%、总灰分不得过10.0%、酸不溶性灰分不得过5.0%、重金属不得过30 mg/kg、每1000 g中含黄曲霉素B1不得过5 µg，黄曲霉素G2、黄曲霉素G1、黄曲霉素B2和黄曲霉素B1的总量不得过10 µg。水溶性浸出物不得少于16.0%。该基地地龙药材经上海市食品药品检验院检测（报告书编号：YW202105450），杂质为0.2%，水分为10.3%，总灰分为5.9%，酸不溶性灰分为1.0%，重金属符合规定。黄曲霉素B1小于检出限0.5 µg/kg，黄曲霉素B20.2 µg/kg、黄曲霉素G10.5 µg/kg、黄曲霉素G20.2 µg/kg，和黄曲霉素B1的总量小于10 µg/kg。水溶性浸出物为25.9%。
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干燥后的地龙药材在包装前应仔细检查是否已充分干燥，并清除杂质和异物。后置药用级的塑料包装中，包装袋表面贴上药材的溯源码。溯源码包括生产企业、地龙基源、栽培方式和环境、养殖管理、采收加工的时间和方法。
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地龙药材应储存于阴凉干燥的仓库里，仓库的地面应有木质或塑料堆放架。库房注意防虫防鼠。
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地龙的运输应遵循及时、准确、安全、经济的原则。将固定的运输工具清洗干净，每件地龙捆扎好，遮盖严密，及时运往贮藏地点。不得雨淋、日晒，长时间滞留在外，不得与其他有毒、有害物质混装，避免污染。
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中药的规范化种植和管理是确保中药质量安全有效的重要环节。国家药品监督局等4部委今年再次颁布了《中药材生产质量管理规范（GAP）》的要求[7]，说明中药材规范化种植和管理的重要性。动物类药材养殖往往较植物类药材的种植更具复杂性。本课题组数年来对沪地龙的养殖不断的进行探索，在此基础上提出了沪地龙规范养殖的新方法，为解决沪地龙规模化和可持续的人工养殖、缓解沪地龙的资源紧缺提供了可行的途径。
Study on the good agricultural practice for Shanghai Pheretima
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摘要:
目的 制定沪地龙生产质量管理规范（GAP）。 方法 按照我国中药材GAP规范化生产的综合技术要求，在上海市崇明区三星镇开展规范化养植和加工关键技术研究。 结果 明确规范了沪地龙的产地环境、品种特征、养殖技术、病虫害防治、采收加工、包装储藏运输、质量监测等技术环节。 结论 为沪地龙的标准化和现代化质量管理提供操作依据。 -
关键词:
- 沪地龙 /
- 中药材生产质量管理规范 /
- 人工养殖 /
- 标准操作规程
Abstract:Objective To establish the Good Agricultural Practice（GAP）for standard operation procedure of Shanghai Pheretima. Methods According to the comprehensive technical requirements of GAP standardized production of Chinese herbal medicine, the key technologies of standardized cultivation and processing were studied in Sangxin Town, Chongming District, Shanghai. Results The production area environment, variety characteristics, breeding technology, pest control, harvesting and processing, packaging, storage and transportation, quality monitoring and other technical links of Shanghai Pheretima were clearly defined and standardized. Conclusion This study provides practical basis for the standardization and modernization quality management of Shanghai Pheretima. -
Key words:
- Shanghai Pheretima /
- GAP /
- artificial culture /
- standard operating procedure
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肾衰宁颗粒由太子参、黄连、制半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等十味中药制成；具有补气健脾，活血化痰，祛浊的功效[1]。有文献表明，肾衰宁在治疗慢性肾脏疾病中疗效较为显著[2]；在尿毒症腹膜透析患者的治疗过程中能够降低血清硫酸吲哚酯浓度[3]；对于慢性肾脏病的Ⅳ期患者，在西医基础治疗的同时服用肾衰宁颗粒，可以明显改善肾功能，同时提升患者的治愈率，具有较高的临床使用价值[4]。由于中药成分复杂[5]，使得如何控制中药的质量成为十分重要的问题。指纹图谱是在了解中药物质整体作用的基础上，通过光谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，以鉴别中药的真伪，评价质量的一致性和产品的稳定性，其具有信息量大、特征性强、完整性和模糊性等特点[6]。指纹图谱中的质量控制技术既能保证中药的功效，又在实现中药现代化过程中起关键性作用[7]。因此，本实验以10个批次的肾衰宁颗粒为研究对象，拟建立肾衰宁颗粒的指纹图谱，对肾衰宁颗粒进行质量评价。
肾衰宁颗粒是由十味中药组成的复方制剂，其化学成分十分复杂，且许多复方治疗疾病的药物基础并不明显，因此检测成分必须是发挥药效的有效成分[8]，本实验针对大黄中的大黄酚（chrysophanol）[9-10]、丹参中的丹酚酸B（salvianolic acid B）[11]、陈皮中的橙皮苷（hesperidin）[9, 12]3种指标性成分，进行HPLC法含量测定。在多成分的质量控制检测成本高而对照品紧缺的情况下，能较大程度地节约检验成本，又可较全面地控制该制剂的质量，保证临床用药的有效性和安全性，同时为肾衰宁颗粒的质量控制提供参考。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包含G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B-DAD二极管阵列检测器，Chemstation色谱工作站；光电分析天平（德国Sartorius公司，CPA 225D型），最大载荷220 g，分度值0.01 mg；冷冻真空浓缩仪（丹麦Labogene公司，ScanVac ScanSpeed 40型）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK7200H型）；涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，Vortex QL-901型）。
1.2 试剂
肾衰宁颗粒（德元堂制药集团，批号：51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、51103105、51103018 486、41103033 563、51103110、61103102、61103101）。蜕皮激素（ecdysterone，批号：P11N6F5706）、甘草苷（liquiritin，批号：2O1027BA14）、甘草酸（glycyrrhizic acid，批号：230A6B1）、大黄酚（chrysophanol，批号：T31O6F5345）、丹酚酸B（salvianolic acid B，批号：Y14M7H14804）、橙皮苷（hesperidin，批号：K02M3C1）对照品，均由上海源叶有限公司提供。大黄素（modin，批号：110756-200110）、盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，批号：09030522）对照品，由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸，均为德国Merck公司生产，色谱纯。二氯甲烷，色谱纯。水为纯净水，娃哈哈公司生产。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SunFire™ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱。流速：1 ml/min。柱温：25 ℃。进样量：10 μl。检测波长：254 nm。梯度洗脱条件见表1。
表 1 梯度洗脱条件时间（t/min） 乙腈（%） 0.1%甲酸溶液（%） 0 5 95 1 23 77 18 25 75 19 30 70 31 75 25 60 85 15 2.2 对照品溶液的制备
精密依次称取丹酚酸B、橙皮苷、大黄素标准品10.25、10.35、10.05 mg，分别置于10 ml容量瓶中，以纯甲醇定容至刻度，摇匀，得储备液并将其分装后储存于−20 ℃的冰箱中。精密称取10.10 mg大黄酚，置于10 ml容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，超声处理3 min，然后用纯甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品的储备液，置于−20 ℃冰箱保存。
2.3 供试品溶液的制备
取肾衰宁颗粒适量，研磨成细粉，混合均匀，精密称取0.10 g，加适量70%甲醇溶液使其溶解，超声45 min，再用70%甲醇溶液定容至2 ml，冷却，过0.45 μm微孔滤膜后，取续滤液进样分析。
2.4 肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱的建立
2.4.1 精密度试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样5次，通过大黄素（7号色谱峰）作为参照峰，确定相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD在1.0%以内，相对峰面积的RSD在2.0%以内，表明进样仪器的精密度良好。
2.4.2 重复性试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项平行制备5份供试品溶液，测定在“2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明该实验方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），并根据“2.3”项下平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别记录0、4、8、24、36 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明供试样品溶液在36 h内稳定性好。
2.5 指纹图谱结果与分析
分别称取10个批次的肾衰宁粉末，按照“2.3”项制备供试品溶液，每个批次平行制备3份供试品溶液，记录图谱，见图1。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008A版”的软件，将10批次肾衰宁颗粒的图谱导入，将批号为61103102的样品溶液用作针对相似性计算校正的参考图。结果显示，1～9批制剂间指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90，见表2，表明相似度良好。对保留时间0~60 min内的色谱峰进行分析，均有22个稳定的特征峰，确定其为肾衰宁的共有指纹峰，经过标准品比对，其中，6号峰为橙皮苷，14号峰为丹酚酸B，21号峰为大黄酚。
表 2 10批肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱相似度样品号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照指纹图谱 S1 1.000 0.980 0.910 0.941 0.934 0.948 0.916 0.941 0.950 0.874 0.965 S2 0.980 1.000 0.934 0.934 0.932 0.945 0.951 0.946 0.978 0.867 0.973 S3 0.910 0.934 1.000 0.952 0.947 0.937 0.972 0.940 0.945 0.914 0.973 S4 0.941 0.934 0.952 1.000 0.990 0.984 0.951 0.971 0.923 0.940 0.986 S5 0.934 0.932 0.947 0.990 1.000 0.978 0.938 0.976 0.910 0.910 0.979 S6 0.948 0.945 0.937 0.984 0.978 1.000 0.954 0.987 0.931 0.923 0.986 S7 0.916 0.951 0.972 0.951 0.938 0.954 1.000 0.949 0.966 0.913 0.979 S8 0.941 0.946 0.940 0.971 0.976 0.987 0.949 1.000 0.928 0.890 0.980 S9 0.950 0.978 0.945 0.923 0.910 0.931 0.966 0.928 1.000 0.892 0.969 S10 0.874 0.867 0.914 0.940 0.910 0.923 0.913 0.890 0.892 1.000 0.937 对照指纹图谱 0.965 0.973 0.973 0.986 0.979 0.986 0.979 0.980 0.969 0.937 1.000 2.6 肾衰宁颗粒中3种有效成分的含量测定
2.6.1 线性结果考察
按照“2.2”项下制备标准品溶液，得到混合对照品色谱图见图2。将标准品储备液用纯甲醇稀释，丹酚酸B浓度梯度为：10、20、40、80和100 μg/ml；橙皮苷浓度梯度为：40、80、160、320和400 μg/ml；大黄酚浓度梯度为：8、16、40、100和350 μg/ml。在“2.1”项色谱条件下，分别记录3种成分的峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，结果见表3。
表 3 各成分线性关系对照品 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 橙皮苷 Y=2.391 8X–2.798 3 0.999 7 40～400 丹酚酸B Y=10.689X–5.578 3 0.999 8 10～100 大黄酚 Y=58.983X+121.99 0.999 9 7～350 2.6.2 精密度试验
取同一对照品溶液，根据“2.1”项下色谱条件进行测定，重复进样5次，并记录峰面积。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚峰面积的RSD分别为0.17%、0.20%、0.15%，表明仪器精密度良好。
2.6.3 检测限和定量限
精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚对照品溶液适量，使用甲醇逐步稀释，至色谱图中上述3种成分的峰高分别为噪音的3倍和10倍，测得橙皮苷的检测限和定量限分别为0.18和1 μg/ml；丹酚酸B的检测限和定量限分别为0.3和1.2 μg/ml；大黄酚的检测限和定量限分别为1和5 μg/ml。
2.6.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（批号：41103033 563），并根据“2.1”项色谱条件在0、2、4、8、24、36 h测定。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为2.01%、2.22%、2.05%，结果表明：供试品在36 h内稳定。
2.6.5 重复性试验
取同一供试品溶液（批号：41103033 563），平行制备6份，并根据“2.1”项色谱条件进行测定，橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为0.67%、2.00%、2.02%，表明系统重复性良好。
2.6.6 加样回收率试验
精密量取肾衰宁溶液1 ml，分别加入100%含量橙皮苷对照品（理论值为192.02 μg），100%含量丹酚酸B对照品（理论值为62.66 μg），100%含量大黄酚对照品（理论值35.22 μg），按照“2.2”项平行制备6份，并根据“2.1”的色谱条件进行测量，按照下述公式计算加样回收率，平均加样回收分别为119.20%、84.69%、84.58%。结果见表4。
表 4 加样回收率试验结果成分 取样量（V/ml） 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） 橙皮苷 1.00 383.02 95.88 773.46 101.80 100.27 1.00 380.39 95.88 764.91 100.26 1.00 380.31 95.88 763.64 99.95 1.00 384.46 95.88 771.17 100.83 1.00 385.81 95.88 772.95 100.94 1.00 389.20 95.88 764.32 97.81 丹酚酸B 1.00 120.79 31.80 250.42 101.91 98.82 1.00 122.50 31.80 251.14 101.12 1.00 125.56 31.80 248.78 96.87 1.00 127.57 31.80 254.87 100.07 1.00 127.74 31.80 251.44 97.25 1.00 127.75 31.80 249.44 95.66 大黄酚 1.00 72.67 17.79 138.19 92.06 97.36 1.00 69.62 17.79 135.41 92.44 1.00 68.46 17.79 140.83 101.69 1.00 71.03 17.79 141.25 98.66 1.00 68.98 17.79 141.57 102.00 1.00 71.92 17.79 141.17 97.30 回收率=（实测量-样品含量）/加入量×100%。
2.6.7 样品含量测定
取10批肾衰宁颗粒，按“2.2”项制备试液，按“2.1”项色谱条件测定，结果见表5。
表 5 10批肾衰宁样品中3种成分的测定结果药品批号 橙皮苷(μg/ml) 丹酚酸B(μg/ml) 大黄酚(μg/ml) 61103102 66.99 42.29 44.65 51103110 83.41 39.34 42.89 51103111 94.75 41.36 44.51 51103009 346 80.57 43.21 43.44 51103011 593 83.51 42.04 42.58 51103018 486 79.94 41.94 42.96 51103010 471 90.03 41.88 44.03 41103033 563 83.48 43.01 43.94 61103101 85,92 42.93 43.85 51103105 88.04 41.76 42.94 3. 讨论
3.1 检测波长的选择
在190~400 nm处全波长扫描，盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚、丹酚酸B、蜕皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分别在345、254、254、286、250、237、237、283 nm处有最大吸收，通过对比分析，在波长254 nm处，上述8种成分具有良好的响应，样品中相邻色谱峰的基线分离可以满足含量检测的要求。因此，选择波长254 nm作为检测波长。
3.2 样品前处理的方法优化
将肾衰宁粉末直接用水溶解后进样，发现样品出峰很少，所测成分在色谱条件下没有吸收。后用50%、70%、80%的甲醇溶解样品，发现用70%甲醇溶解出峰数最多，且所测成分在此条件下均有吸收，故选择70%甲醇进行样品的前处理。
3.3 流动相的选择
有文献报道，肾衰宁含量测定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]进行90 min的大梯度洗脱，发现色谱峰分不开，且特征峰较少。经过反复实验，确定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脱的流动相，分离出样品中测得的特征峰，特征峰很多，峰形良好。
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表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 
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表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800
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