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感染性休克是由感染和脓毒症逐渐发展所致宿主反应失调以及多器官功能障碍，因此又称脓毒性休克，常见于长期慢性病或大型手术之后，基本病理生理改变为感染引起全身性炎症反应，并造成血管内皮细胞损伤和通透性改变，进而引起微循环障碍，导致各器官组织水肿和损伤，因此感染性休克在常规抗感染、补充血容量及保护脏器功能等治疗基础上还需积极改善微循环，维持血流动力学稳定[1-2]。文献报道显示乌司他丁用于感染性休克治疗在抗炎、免疫调节以及重要脏器保护方面均具有积极作用，可明显改善复苏质量和预后[3]。本文主要研究乌司他丁对感染性休克患者炎症反应、血流动力学参数、PaO2/FiO2和预后的影响，旨在进一步探讨其药理作用及相关机制，为推广其在感染性休克治疗中的应用提供参考依据。
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选取2017年1月至2019年12月我院感染性休克患者临床资料127例进行回顾性分析，根据治疗中是否应用乌司他丁分为观察组和常规组，观察组73例，男性38例、女性35例，年龄47~68岁，平均（58.13±7.94）岁，体质量指数（BMI）19.7~30.4 kg/m2，平均（25.31±2.87） kg/m2，其中重症肺炎23例、急性腹膜炎16例、急性胰腺炎15例、胆道感染9例、其他10例；常规组54例，男性29例、女性25例，年龄43~67岁，平均（56.92±8.36）岁，BMI 20.3~29.8 kg/m2，平均（25.06±2.74） kg/m2，其中重症肺炎18例、急性腹膜炎14例、急性胰腺炎9例、胆道感染7例、其他6例；两组临床基本资料差异均无统计学意义（P>0.05）。纳入标准：①符合美国胸科医师协会（ACCP）/欧洲危重病医学会（SCCM）联合制定的诊断标准 ；②年龄≤70岁；③临床相关资料保存完整；④患者及家属知晓本研究并签署同意书。排除标准：①入院时已发生脏器功能障碍或衰竭者；②伴其他致死性疾病或严重创伤；③伴精神疾病或神经系统病变；④伴免疫功能障碍或此前1月内应用激素或免疫调节治疗者；⑤未遵医嘱完成治疗或随访。
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两组入院后均按感染性休克相关指南[4]常规进行抗感染和抗休克治疗，包括补液、给氧及营养管理等对症支持治疗，并应用血管活性药物改善血管功能和微循环障碍，同时密切监测和保护重要脏器功能；观察组在此基础上加用乌司他丁注射液（国药准字H19990134，10万U，广东天普生化医药股份有限公司）+0.9%生理盐水100 ml静脉滴注10万U/次，2次/d，连续用药7 d。
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①炎症因子：采集两组患者治疗前和治疗7 d时外周静脉血3 ml，采用ELISA法（试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司）检测白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；采用电化学发光法检测降钙素原（PCT）水平，所有操作均严格按照说明书要求完成。②血流动力学参数：左锁骨下静脉和股动脉置管并连接PiCCO监护仪，监测两组患者治疗期间平均动脉压(MAP)、心脏指数(CI)、血管外肺水指数(EVLWI)及外周血管阻力指数(SVRI)等指标变化情况。③组织灌注水平：分别于两组治疗前和治疗7 d时行动脉血气分析监测动脉血氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）并计算氧合指数（PaO2/FiO2）。④患者恢复情况：比较两组治疗7 d时APACHE-Ⅱ评分变化，并观察两组机械通气时间、ICU住院时间以及器官功能障碍综合征（MODS）和死亡发生率。
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数据分析采用SPSS19.0软件，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法，计量资料以（
$\bar x$ ±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，两组治疗前后比较行重复测量方差分析，有统计学意义者采用SNK-q检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
治疗7 d时，两组IL-6、TNF-α及PCT水平均明显降低（P<0.05），且观察组IL-6、TNF-α及PCT水平低于常规组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表 1 两组治疗前后感染标志物变化
组别 例数（n） IL-6（ng/L） TNF-α（μg/L） PCT（μg/L） 治疗前 治疗7 d 治疗前 治疗7 d 治疗前 治疗7 d 观察组 73 213.76±40.92 143.58±26.45* 6.02±1.28 2.16±0.47* 3.94±0.82 1.25±0.31* 常规组 54 209.53±41.27 164.05±29.14 5.89±1.24 2.73±0.51 4.06±0.79 1.68±0.42 t 0.533 3.829 0.532 6.044 0.769 6.152 P 0.595 <0.001 0.596 <0.001 0.444 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较。 -
治疗12 h、24 h和72 h时，两组MAP和CI明显升高（P<0.05），EVLWI和SVRI明显降低（P<0.05），且同一时间观察组MAP高于常规组，EVLWI低于常规组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
表 2 两组治疗前后血流动力学参数变化
组别 时间 MAP（mmHg） CI
[L/(min·m2）]EVLWI（ml/kg） SVRI
(kPa·s/m3)观察组 治疗前 58.72±10.94 3.84±0.71 10.63±1.29 2491.85±387.46 治疗12 h 70.38±9.65*▲ 4.32±0.56* 8.15±1.07*▲ 2014.39±362.71* 治疗24 h 83.29±8.53*#▲ 4.68±0.49*# 7.24±0.86*#▲ 1746.50±329.08*# 治疗72 h 92.16±7.82*#△▲ 4.93±0.54*#△ 6.32±0.73*#△▲ 1502.63±312.79*#△ 常规组 治疗前 59.34±10.68 3.75±0.67 10.48±1.34 2513.42±385.94 治疗12 h 65.47±10.93* 4.19±0.60* 8.56±1.09* 2030.78±364.56* 治疗24 h 76.15±9.52*# 4.53±0.58*# 7.82±0.91*# 1754.35±326.81*# 治疗72 h 84.36±9.08*#△ 4.85±0.52*#△ 6.74±0.78*#△ 1523.86±314.07*#△ 统计值 F组间/P组间 2.791/0.026 1.028/0.372 3.829/<0.001 0.914/0.423 F组内/P组内 106.354/ 85.143/<0.001 76.451/<0.001 82.065/<0.001 F交互/P交互 8.462/<0.001 2.396/0.107 4.236/<0.001 2.137/0.149 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与同组治疗12 h比较；△P<0.05，与同组治疗24 h比较；▲P<0.05，与常规组比较。 -
治疗12、24、72 h时，两组PaO2/FiO2明显升高（P<0.05），且同一时间观察组PaO2/FiO2高于常规组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
表 3 两组治疗期间PaO2/FiO2变化情况
组别 例数（n） 治疗前 治疗12 h 治疗24 h 治疗72 h 观察组 73 71.98±6.45 79.53±5.26*▲ 87.45±5.08*#▲ 92.64±4.13*#△▲ 常规组 54 72.36±6.29 76.04±5.82* 83.92±5.37*# 89.21±4.75*#△ t 0.308 3.276 3.505 4.024 P 0.759 0.002 <0.001 <0.001 F组间/P组间=2.584/0.039；F组内/P组内=21.462/<0.001；F交互/P交互=3.029/0.005；*P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与同组治疗12 h比较；△P<0.05，与同组治疗24 h比较；▲P<0.05，与常规组比较。 -
治疗7 d时，两组APACHE-Ⅱ评分明显降低（P<0.05），且观察组APACHE-Ⅱ评分、机械通气时间及ICU住院时间均低于常规组，差异有统计学意义（P<0.05）。
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观察组和常规组多器官功能障碍综合征(MODS)发生率分别为4.11%和14.81%（P<0.05），病死率分别为1.37%和7.41%（P>0.05）。
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严重感染患者细菌及毒素入血导致大量炎性细胞激活和炎症介质释放，造成级联失控的免疫反应并引起各器官和系统灌注和代谢障碍，导致MODS发生甚至威胁患者生命安全[5]。感染性休克病情进展较快且诊疗难度大，预后情况目前仍不容乐观，文献报道患者病死率可达50%以上，且救治成功的患者也可能长期存在器官功能不全等问题，给患者、家庭和社会带来沉重负担，因此提升临床诊治水平势在必行，而微循环障碍是感染性休克核心环节，与患者预后情况关系密切，是现阶段国内外重点研究方向。
既往研究认为严重感染尤其是G−菌患者有较高风险发生感染性休克，因此检测炎症因子表达水平可反映病情严重程度。本研究结果显示，两组治疗前IL-6、TNF-α及PCT水平显著升高，其中IL-6可参与机体免疫反应并促进淋巴细胞增殖和分化；TNF-α是常见促炎因子，能进一步诱导炎症介质大量释放；PCT可准确反映机体炎症反应水平，在细菌或真菌等感染后明显升高。本研究中治疗第7天时两组IL-6、TNF-α及PCT水平均大幅度降低，且观察组降低效果更为显著，表明乌司他丁辅助治疗感染性休克有利于降低血清炎症因子水平，具有良好控制感染和炎症反应效果(见表4)，与王东等[6]研究结果相一致。乌司他丁是分布于人体血液、尿液或脑脊液中的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，可同时抑制多种水解酶活性并限制炎症介质释放，在机体受到感染后可快速进入炎症反应进程，近年来作为抗炎因子广泛用于胰腺炎、关节炎及脓毒症等病变治疗，以补充人体内源性乌司他丁消耗，有助于快速缓解症状[7]。
表 4 两组治疗后恢复情况
分组 例数（n） APACHE-Ⅱ评分（分） 机械通气
时间（d）ICU住院
时间（d）治疗前 治疗7 d 观察组 73 23.09±4.76 10.65±1.94* 5.06±1.42 5.47±1.28 常规组 54 21.87±5.02 12.58±2.43* 5.81±1.54 6.25±1.45 T 1.294 4.611 2.633 2.975 P 0.199 <0.001 0.010 0.004 *P<0.05，与同组治疗前比较。 2016年ACCP/SCCM感染性休克最新定义强调了微循环和细胞代谢障碍的重要性，要求在治疗过程中积极改善微循环功能。感染性休克血流动力学发生改变的基础为外周血管收缩功能异常，继而引起血管扩张和通透性改变，造成顽固性低血容量状态，且由于炎症反应和心肌细胞损伤，心输出量进一步下降，导致组织灌注不足和血流量重新分配，严重时可引起MODS发生。因此，感染性休克治疗期间常采用PiCCO严密监测心功能和外周循环状态，为评估病情和指导治疗提供参考依据[8]。明自强等[9]研究认为，乌司他丁对胆道感染性休克患者血流动力学参数具有明显改善效果，有利于患者病情好转，但乌司他丁对循环系统的作用机制目前尚未清楚，文献报道可能与抑制炎症因子释放和脂质过氧化[10]、清除氧自由基以及减轻内皮细胞损伤等作用有关。本研究结果显示，两组患者经过积极干预后MAP、CI和PaO2/FiO2均明显升高且EVLWI和SVRI明显降低，表明患者微循环状态和组织灌注水平获得改善，其中观察组各项指标改善效果存在较大优势，提示采用乌司他丁辅助治疗感染性休克可促进微循环改善，有助于恢复各器官系统血流量，为改善预后创造有利条件。本研究中观察组治疗7 d时APACHE-Ⅱ评分、机械通气时间、ICU住院时间及MODS发生率均明显低于常规组，表明乌司他丁治疗感染性休克可提升患者康复速度，这与其抑制炎症反应和改善微循环的功能均有密切联系，同时本研究显示观察组患者死亡率较低，但与常规组比较未见明显差异，不同于方向明等[11]报道结果，其原因可能与不同研究样本类型和医疗条件等均存在一定差异有关，也可能是本研究样本容量偏小所致，具体情况还需更多研究进行证实。
综上所述，乌司他丁治疗感染性休克有利于减轻炎症反应，改善血流动力学指标和微循环灌注，对促进患者康复和改善预后具有积极作用。
Effects of Ulinastatin on inflammatory response, hemodynamics, PaO2/FiO2 and prognosis in patients with septic shock
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摘要:
目的 研究乌司他丁注射液对感染性休克患者炎症反应、血流动力学、氧合指数（PaO2/FiO2）及预后的影响。 方法 回顾性分析2017年1月至2019年12月感染性休克患者127例临床资料，按照治疗方案分为观察组73例以及常规组54例，两组均按相关指南给予抗休克治疗，观察组另加用乌司他丁治疗，比较两组治疗前后炎症因子、血流动力学参数和PaO2/FiO2变化及恢复情况。 结果 治疗7 d时两组IL-6、TNF-α以及PCT水平明显降低（P<0.05），且观察组IL-6、TNF-α及PCT水平低于常规组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗12 h、24 h和72 h时，两组MAP、CI及PaO2/FiO2明显升高（P<0.05），EVLWI和SVRI明显降低（P<0.05），且同一时间观察组MAP和PaO2/FiO2高于常规组，EVLWI低于常规组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组治疗7 d时APACHE-Ⅱ评分、机械通气时间及ICU住院时间均低于常规组，两组MODS发生率分别为4.11%和14.81%（P<0.05），病死率分别为1.37%和7.41%（P>0.05）。 结论 乌司他丁治疗感染性休克有利于减轻炎症反应，改善血流动力学指标和微循环灌注，对促进患者康复和改善预后具有积极作用。 Abstract:Objective To evaluate the effect of Ulinastatin injection on inflammation, hemodynamics, oxygenation index (PaO2/FiO2) and prognosis in patients with septic shock. Methods A retrospective analysis was performed on clinical data of 109 patients with septic shock from January 2017 to December 2019. Patients were divided into observation group (n=73) and routine group (n=54) according to the treatment regimens. The two groups were given anti-shock treatment according to the relevant guidelines, and observation group was additionally given Ulinastatin. The inflammatory factors, hemodynamic parameters and PaO2/FiO2 and recovery were compared between the two groups before and after treatment. Results The levels of IL-6, TNF-α and PCT at 7 d of treatment were significantly decreased in the two groups (P<0.05), and the levels of IL-6, TNF-α and PCT of observation group were lower than that of routine group (P<0.05). At 12 h, 24 h and 72 h of treatment, the MAP, CI and PaO2/FiO2 were significantly increased in the two groups (P<0.05) while the EVLWI and SVRI were significantly decreased (P<0.05), and the MAP and PaO2/FiO2 of observation group at the same time were higher than that of routine group while the EVLWI was lower than that routine group (P<0.05). At 7 d of treatment, the APACHE-II score, mechanical ventilation time and ICU stay time of observation group were lower than that of routine group, and the incidence rates of MODS in the two groups were 4.11% and 14.81% respectively (P<0.05), and the mortality rates were 1.37% and 7.41% respectively (P>0.05). Conclusion Ulinastatin could be beneficial in septic shock, which could reduce inflammatory response, improve hemodynamic parameters and microcirculation perfusion, and put a positive effect on promoting rehabilitation and improving prognosis. -
Key words:
- septic shock /
- Ulinastatin injection /
- hemodynamics /
- mortality rates
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中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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表 1 两组治疗前后感染标志物变化
组别 例数（n） IL-6（ng/L） TNF-α（μg/L） PCT（μg/L） 治疗前 治疗7 d 治疗前 治疗7 d 治疗前 治疗7 d 观察组 73 213.76±40.92 143.58±26.45* 6.02±1.28 2.16±0.47* 3.94±0.82 1.25±0.31* 常规组 54 209.53±41.27 164.05±29.14 5.89±1.24 2.73±0.51 4.06±0.79 1.68±0.42 t 0.533 3.829 0.532 6.044 0.769 6.152 P 0.595 <0.001 0.596 <0.001 0.444 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较。 
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表 2 两组治疗前后血流动力学参数变化
组别 时间 MAP（mmHg） CI
[L/(min·m2）]EVLWI（ml/kg） SVRI
(kPa·s/m3)观察组 治疗前 58.72±10.94 3.84±0.71 10.63±1.29 2491.85±387.46 治疗12 h 70.38±9.65*▲ 4.32±0.56* 8.15±1.07*▲ 2014.39±362.71* 治疗24 h 83.29±8.53*#▲ 4.68±0.49*# 7.24±0.86*#▲ 1746.50±329.08*# 治疗72 h 92.16±7.82*#△▲ 4.93±0.54*#△ 6.32±0.73*#△▲ 1502.63±312.79*#△ 常规组 治疗前 59.34±10.68 3.75±0.67 10.48±1.34 2513.42±385.94 治疗12 h 65.47±10.93* 4.19±0.60* 8.56±1.09* 2030.78±364.56* 治疗24 h 76.15±9.52*# 4.53±0.58*# 7.82±0.91*# 1754.35±326.81*# 治疗72 h 84.36±9.08*#△ 4.85±0.52*#△ 6.74±0.78*#△ 1523.86±314.07*#△ 统计值 F组间/P组间 2.791/0.026 1.028/0.372 3.829/<0.001 0.914/0.423 F组内/P组内 106.354/ 85.143/<0.001 76.451/<0.001 82.065/<0.001 F交互/P交互 8.462/<0.001 2.396/0.107 4.236/<0.001 2.137/0.149 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与同组治疗12 h比较；△P<0.05，与同组治疗24 h比较；▲P<0.05，与常规组比较。
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表 3 两组治疗期间PaO2/FiO2变化情况
组别 例数（n） 治疗前 治疗12 h 治疗24 h 治疗72 h 观察组 73 71.98±6.45 79.53±5.26*▲ 87.45±5.08*#▲ 92.64±4.13*#△▲ 常规组 54 72.36±6.29 76.04±5.82* 83.92±5.37*# 89.21±4.75*#△ t 0.308 3.276 3.505 4.024 P 0.759 0.002 <0.001 <0.001 F组间/P组间=2.584/0.039；F组内/P组内=21.462/<0.001；F交互/P交互=3.029/0.005；*P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与同组治疗12 h比较；△P<0.05，与同组治疗24 h比较；▲P<0.05，与常规组比较。
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表 4 两组治疗后恢复情况
分组 例数（n） APACHE-Ⅱ评分（分） 机械通气
时间（d）ICU住院
时间（d）治疗前 治疗7 d 观察组 73 23.09±4.76 10.65±1.94* 5.06±1.42 5.47±1.28 常规组 54 21.87±5.02 12.58±2.43* 5.81±1.54 6.25±1.45 T 1.294 4.611 2.633 2.975 P 0.199 <0.001 0.010 0.004 *P<0.05，与同组治疗前比较。
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