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西红花为名贵药材，来源于鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。原产于地中海地区、希腊、小亚细亚和伊朗，后经西藏传入国内，故又名藏红花[1]。《本草纲目》中记载番红花“主治心忧郁积、气闷不散，活血，亦治惊悸”[2]。2020版《中国药典》描述西红花具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[3]。越来越多的现代药理研究表明，西红花具有抗肿瘤、抗血小板聚集与凋亡、抗心血管细胞凋亡、降血脂和降血糖等活性[4–6]，在健康和医疗领域具有重要作用。
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据，2020年全球癌症新发患者病例数超过1 930万例，癌症死亡患者接近1 000万例[7]。天然活性成分是抗肿瘤药物研发的重要来源[8]。有研究表明，西红花中特有的西红花酸、西红花苷等具有抗肿瘤活性[9]，已有学者在西红花治疗结直肠癌、乳腺癌等的抗肿瘤作用方面进行了相关研究[10-11]，但其主要活性成分及抗肿瘤作用机制仍需进一步探索。
网络药理学[12]将系统生物学、生物信息学、计算生物学、网络科学和靶向药理学相结合，从系统层次和生物网络的整体角度探讨成分—靶标—通路的相互作用关系，为中药多靶点、多成分、系统性、整体性的作用机制研究提供了有力的技术支撑，从而指导新药研发和临床诊疗。因此，本研究应用网络药理学结合反向分子对接的方法，对西红花的抗肿瘤作用成分及靶点机制进行研究，为深入探索西红花抗肿瘤药效物质基础及作用机制提供参考。
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利用TCMSP平台获取西红花化学成分，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL) 是药物筛选的关键参数，一般设置OB≥30%和DL≥0.18的化学成分作为候选药效成分，并结合文献报道[13–15]补充4个西红花化学成分。
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应用TCMSP平台和PharmMapper[16]工具获取西红花活性成分的作用靶点，并借助UniProt数据库将靶点转换为对应基因。以“tumor”、“cancer”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）和TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行检索。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，作为药物作用于疾病的预测靶点。
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根据预测的西红花药效成分、交集靶点，使用Cytoscape 3.9.1软件建立“成分-靶点”的网络图。
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将药物疾病交集靶点输入String数据库构建PPI网络进行初步筛选，再将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1中，以半数degree为参考标准，选取关键靶点。
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将筛选获得的37个核心靶点录入Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html），物种设置为人，选择Custom Analysis，设置P<0.01，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
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将筛选出的西红花主要活性成分通过PubChem下载SDF格式；利用RCSB PDB数据库下载关键蛋白靶点，优先选择有配体、结构相对完整的晶体结构，并采用AutoDock Tools对获取的PDB蛋白分子进行除水、加氢、计算电荷预处理；使用AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能；选取最优构象，使用PyMOL软件做出3D结合模式图。
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通过TCMSP获得70个西红花化学成分，设置OB≥30%且DL≥0.18进行筛选，再添加文献检索相关成分，共获得9个西红花活性成分，见表1。
表 1 西红花活性成分
序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 -
将TCMSP平台和PharmMapper获取结果进行整理，并借助UniProt数据库进行靶基因匹配，获得201个潜在靶点。以“tumor”和“cancer”为关键词，在GeneCards、OMIM和TTD数据库进行预测整理，剔除重复，筛选得到5896个潜在疾病靶点。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，共得到可作为药物作用于疾病的179个预测靶点。
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将西红花的9个活性成分与预测到的179个潜在靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络（图1），网络中绿色代表药物作用于疾病的靶点，蓝色代表西红花活性成分，全图包括189个节点、299条边，其中degree值排名靠前的活性成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ，这些可能是西红花发挥抗肿瘤作用的潜在活性成分。
图 1 西红花抗肿瘤“化学成分-靶点”网络
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将疾病与活性成分的潜在靶点导入String数据库，采用Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，依据degree值进行排序，以大于半数degree值为标准进行两次筛选，获取核心靶点37个（图2）。度值排名前5的靶点分别为EGF、MMP9、NFKBIA、IL-1B和IL-10，提示这些靶点可能是西红花发挥抗肿瘤作用的关键潜在靶点。
图 2 基于PPI分析的核心靶点筛选
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GO分析常用于注释基因和基因产物生物功能，分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）三部分。此次GO富集分析共得到BP富集结果193个、CC富集结果83个和MF富集结果123个，选取排名前10的条目绘制GO功能分析图（图3）。如图3所示，BP主要涉及对激素的反应、对脂质的反应、对异源刺激的反应等；CC主要涉及膜筏、膜微区、囊腔、细胞质囊泡腔等；MF主要涉及转录因子结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等。通过比较发现，细胞生物过程富集的基因数较多，说明西红花可能主要通过调节生物过程发挥抗肿瘤作用。
图 3 GO富集分析结果（前10）
KEGG分析共富集到194条信号通路，其中34条癌症相关通路，并对前20条通路绘制气泡图（图4）。依据KEGG分析，西红花可能通过p53信号通路、TNF通路发挥抗肿瘤作用,可能对膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤具有治疗作用，西红花靶点-通路相互作用网络见图5，红色三角形代表与肿瘤相关的信号通路，蓝色矩形代表关键靶点。其中，西红花通过膀胱癌信号通路调控EGF、MMPs、Raf、VEGF、ERK等基因发挥抗肿瘤作用（图6），红色矩形代表西红花可能干预的关键靶点。
图 4 KEGG富集分析气泡图（前20）
图 5 西红花“靶点-通路”相互作用网络
图 6 西红花与膀胱癌信号通路的相关靶点作用关系
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将前15个潜在核心靶点与西红花活性成分进行分子对接。结合能(affinity)<0表明配体分子能够与受体蛋白自发结合，结合能≤−17.78 kJ/mol表明配体与受体有一定的结合活性，结合能≤−20.92 kJ/mol 表明配体与受体有较好的结合活性，结合能≤−29.29 kJ/mol 表明配体与受体有强的结合活性[17],且结合能越低,表明对接的效果越好，结合的构象越稳定[18]。经AutoDock Vina对接，将得到的结合能数据使用热图展示（图7）。本研究结合自由能小于−20.92kJ/mol 的活性成分有102个，占75.6%；小于−29.29kJ/mol 的活性成分有73个，占54.1%，可见这些核心化合物与受体结合活性较高，结构相对稳定。选取结合能力最好的4个组合用Pymol软件进行可视化处理（图8）。
图 7 分子对接分数热图分析
图 8 西红花苷Ⅱ与核心靶点分子对接可视化 (结合能<−48 kJ/mol)
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肿瘤的发生和发展是多基因、多步骤的结果。中药多成分、多靶点的特点使其在肿瘤治疗方面有独特的优势。大量的临床实践表明，中药在治疗肿瘤中能够改善症状、提高患者生存质量、延长生存期等，有着其他治疗药物及手段不可替代的作用[19-20]。以中药黄芪为例，不仅可以通过Wnt5/β-catenin信号通路抑制肿瘤生长[21]，同时具有通过PD-L1下调诱导耐药黑色素瘤的干性抑制和化疗敏感性增强的作用，可以减少化疗药物用量[22]，还能充当免疫佐剂，提高患者免疫力，改善生存质量[23]。网络药理学最大的优势在于可以运用系统生物学的分析，为中药多成分、多靶点、多通路的机制研究提供有力的技术支撑[12]，其分析理念和技术路径又与中医药治疗疾病的整体观相契合，已用于多种中药和中药复方作用机制的研究，如灯盏细辛、半枝莲等中药和茵陈蒿汤、桃红四物汤等中药复方，利用网络药理学的方法得到治疗机制的详细阐述和证明[24–27]，为中药药理作用机制的探索提供了很好的参考。
本研究发现西红花中多种成分，如西红花酸、西红花苷等可与IL-6、AKT1、CCND1、IL-1β、MMP9、EGFR、TP53靶点产生适度结合，提示这些靶点可能是西红花中活性成分发挥抗肿瘤作用的关键靶点。研究发现，AKT1是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的重要靶点，被磷酸化激活后可以促进细胞的增殖与存活，与肿瘤细胞的生长密切相关[28]。多项研究表明，通过抑制AKT1可以治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种实体癌[29]。EGFR与一些全球发病率和致死率高的癌症发病机制直接或间接相关，包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌等[30]。当EGFR过度表达时，细胞表面会出现过量的受体，诱导正常的细胞转化为癌细胞，并为癌细胞持续生存提供条件[31]。CCND1是细胞周期家族的一员[32]，公认的原癌基因,在甲状旁腺瘤、乳腺癌、肝癌及食管、肺、头颈部鳞状细胞癌的发生、发展过程中均起着重要作用[33-34]。西红花苷是由西红花酸和龙胆二糖或葡萄糖结合形成的二萜苷类化合物，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的差别在于分子中糖苷基数目的多少 [35]。西红花酸已具有抗肿瘤作用，以其为苷元形成的西红花苷同样也表现出较好的抗肿瘤活性，其中西红花苷Ⅱ的表现最好。西红花苷可以通过P53途径下调细胞周期蛋白d1和p21的表达，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，从而抑制肿瘤生长[36]。分子对接的结果与GO富集分析、KEGG通路富集分析结果一致，验证了网络药理学分析结果的正确性。
Buyun等学者在肝癌Hep3B和HepG2细胞中使用西红花苷抑制了IL-6对STAT3以及细胞周期蛋白D1的激活，验证了西红花对肝癌细胞的抗增殖，凋亡和阻断入侵作用[37]。在转移性乳腺癌的研究中，Ali等研究人员在体内和体外实验中均证明了西红花苷可以通过VEGF和MMP9下调发挥抗肿瘤作用，而且对乳腺癌的转移扩散有较好的抑制作用[38]。这些研究成果在一定程度上验证了利用网络药理学探究发现的西红花抗肿瘤作用机制的可行性。
综上所述，本研究利用网络药理学结合分子对接技术，探究西红花抗肿瘤作用的活性成分、作用靶点及信号通路。发现西红花抗肿瘤的作用具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，其中以西红花苷为代表的西红花特有化学成分显示出了良好的抗肿瘤活性，可以在多条肿瘤发生通路中发挥作用，为西红花治疗肿瘤的深入研究提供了理论基础。但这些结果受限于各个数据库信息的片面性，而且只关注了成分，没有考量到成分的含量及其之间是否存在相互作用，预测的结果存在一定的片面性和局限性，需要进一步进行体内、外实验验证。
Anti-tumor mechanism study on saffron by network pharmacology and reverse molecular docking
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摘要:
目的 运用网络药理学和反向分子对接技术探讨西红花抗肿瘤的作用机制。 方法 通过检索文献和从中药系统药理学数据库（TCMSP）获取西红花的主要化学成分，利用PharmMapper服务器预测西红花活性成分的潜在靶点，通过UniProt数据库将西红花潜在靶点转换为对应的靶标基因，与GeneCards、OMIM和TTD数据库获得的肿瘤相关靶点进行映射分析，得到西红花抗肿瘤的潜在作用靶点。采用Cytoscape软件构建西红花“活性成分-靶点-疾病”相互作用网络，通过String数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析，并利用Metascape平台进行GO功能和KEGG通路富集分析。使用AutoDock、Pymol软件对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。 结果 共筛选出西红花中槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ等9个活性成分，可能作用于AKT1、CCND1、MMP9、EGFR、TP53等37个关键靶点，涉及P53信号通路及TNF信号通路等。分子对接显示可通过氢键、疏水作用等产生稳定结合。 结论 初步探讨了西红花抗肿瘤的主要活性成分、关键靶点及通路，提示可通过诱导细胞凋亡等方式发挥抗肿瘤作用，为后续实验验证提供参考依据。 Abstract:Objective To explore the anti-tumor mechanism of saffron (Crocus sativus L.) by network pharmacology and reverse molecular docking techniques. Methods The main chemical components of saffron were obtained by searching published literature and TCMSP database. The potential targets of these components were predicted using PharmMapper server. The corresponding target genes were identified from UniProt database. The underlying anti-tumor targets of saffron were obtained by mapping the disease genes of cancer or tumor with GeneCards, OMIM and TTD databases. Cytoscape software was used to construct the action target network of saffron active components. The protein-protein interaction analysis was performed by String database, and the GO function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by Metascape platform. Finally, molecular docking was performed to evaluate the binding of main components with their potential targets. Results A total of 9 active ingredients in saffron including quercetin, kaempferol, isorhamnetin, picrocrocin and crocin I, were identified, which might act on 37 key targets including AKT1, CCND1, MMP9, EGFR, TP53, involved in P53, TNF and other signaling pathways. Molecular docking indicated modest binding potency through hydrogen bonding, and hydrophobic interactions. Conclusion The anti-tumor effect of saffron was evaluated via the network of components-targets-pathways, which might provide a foundation for further research. -
Key words:
- saffron /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- anti-tumor mechanism
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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表 1 西红花活性成分
序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 
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