下载:
下载:
-
西红花为名贵药材，来源于鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。原产于地中海地区、希腊、小亚细亚和伊朗，后经西藏传入国内，故又名藏红花[1]。《本草纲目》中记载番红花“主治心忧郁积、气闷不散，活血，亦治惊悸”[2]。2020版《中国药典》描述西红花具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[3]。越来越多的现代药理研究表明，西红花具有抗肿瘤、抗血小板聚集与凋亡、抗心血管细胞凋亡、降血脂和降血糖等活性[4–6]，在健康和医疗领域具有重要作用。
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据，2020年全球癌症新发患者病例数超过1 930万例，癌症死亡患者接近1 000万例[7]。天然活性成分是抗肿瘤药物研发的重要来源[8]。有研究表明，西红花中特有的西红花酸、西红花苷等具有抗肿瘤活性[9]，已有学者在西红花治疗结直肠癌、乳腺癌等的抗肿瘤作用方面进行了相关研究[10-11]，但其主要活性成分及抗肿瘤作用机制仍需进一步探索。
网络药理学[12]将系统生物学、生物信息学、计算生物学、网络科学和靶向药理学相结合，从系统层次和生物网络的整体角度探讨成分—靶标—通路的相互作用关系，为中药多靶点、多成分、系统性、整体性的作用机制研究提供了有力的技术支撑，从而指导新药研发和临床诊疗。因此，本研究应用网络药理学结合反向分子对接的方法，对西红花的抗肿瘤作用成分及靶点机制进行研究，为深入探索西红花抗肿瘤药效物质基础及作用机制提供参考。
-
利用TCMSP平台获取西红花化学成分，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL) 是药物筛选的关键参数，一般设置OB≥30%和DL≥0.18的化学成分作为候选药效成分，并结合文献报道[13–15]补充4个西红花化学成分。
-
应用TCMSP平台和PharmMapper[16]工具获取西红花活性成分的作用靶点，并借助UniProt数据库将靶点转换为对应基因。以“tumor”、“cancer”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）和TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行检索。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，作为药物作用于疾病的预测靶点。
-
根据预测的西红花药效成分、交集靶点，使用Cytoscape 3.9.1软件建立“成分-靶点”的网络图。
-
将药物疾病交集靶点输入String数据库构建PPI网络进行初步筛选，再将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1中，以半数degree为参考标准，选取关键靶点。
-
将筛选获得的37个核心靶点录入Metascape平台（http://metascape.org/gp/index.html），物种设置为人，选择Custom Analysis，设置P<0.01，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。
-
将筛选出的西红花主要活性成分通过PubChem下载SDF格式；利用RCSB PDB数据库下载关键蛋白靶点，优先选择有配体、结构相对完整的晶体结构，并采用AutoDock Tools对获取的PDB蛋白分子进行除水、加氢、计算电荷预处理；使用AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能；选取最优构象，使用PyMOL软件做出3D结合模式图。
-
通过TCMSP获得70个西红花化学成分，设置OB≥30%且DL≥0.18进行筛选，再添加文献检索相关成分，共获得9个西红花活性成分，见表1。
表 1 西红花活性成分
序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 -
将TCMSP平台和PharmMapper获取结果进行整理，并借助UniProt数据库进行靶基因匹配，获得201个潜在靶点。以“tumor”和“cancer”为关键词，在GeneCards、OMIM和TTD数据库进行预测整理，剔除重复，筛选得到5896个潜在疾病靶点。将得到的疾病靶点和药物靶点取交集，共得到可作为药物作用于疾病的179个预测靶点。
-
将西红花的9个活性成分与预测到的179个潜在靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络（图1），网络中绿色代表药物作用于疾病的靶点，蓝色代表西红花活性成分，全图包括189个节点、299条边，其中degree值排名靠前的活性成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ，这些可能是西红花发挥抗肿瘤作用的潜在活性成分。
图 1 西红花抗肿瘤“化学成分-靶点”网络
-
将疾病与活性成分的潜在靶点导入String数据库，采用Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，依据degree值进行排序，以大于半数degree值为标准进行两次筛选，获取核心靶点37个（图2）。度值排名前5的靶点分别为EGF、MMP9、NFKBIA、IL-1B和IL-10，提示这些靶点可能是西红花发挥抗肿瘤作用的关键潜在靶点。
图 2 基于PPI分析的核心靶点筛选
-
GO分析常用于注释基因和基因产物生物功能，分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）三部分。此次GO富集分析共得到BP富集结果193个、CC富集结果83个和MF富集结果123个，选取排名前10的条目绘制GO功能分析图（图3）。如图3所示，BP主要涉及对激素的反应、对脂质的反应、对异源刺激的反应等；CC主要涉及膜筏、膜微区、囊腔、细胞质囊泡腔等；MF主要涉及转录因子结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等。通过比较发现，细胞生物过程富集的基因数较多，说明西红花可能主要通过调节生物过程发挥抗肿瘤作用。
图 3 GO富集分析结果（前10）
KEGG分析共富集到194条信号通路，其中34条癌症相关通路，并对前20条通路绘制气泡图（图4）。依据KEGG分析，西红花可能通过p53信号通路、TNF通路发挥抗肿瘤作用,可能对膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤具有治疗作用，西红花靶点-通路相互作用网络见图5，红色三角形代表与肿瘤相关的信号通路，蓝色矩形代表关键靶点。其中，西红花通过膀胱癌信号通路调控EGF、MMPs、Raf、VEGF、ERK等基因发挥抗肿瘤作用（图6），红色矩形代表西红花可能干预的关键靶点。
图 4 KEGG富集分析气泡图（前20）
图 5 西红花“靶点-通路”相互作用网络
图 6 西红花与膀胱癌信号通路的相关靶点作用关系
-
将前15个潜在核心靶点与西红花活性成分进行分子对接。结合能(affinity)<0表明配体分子能够与受体蛋白自发结合，结合能≤−17.78 kJ/mol表明配体与受体有一定的结合活性，结合能≤−20.92 kJ/mol 表明配体与受体有较好的结合活性，结合能≤−29.29 kJ/mol 表明配体与受体有强的结合活性[17],且结合能越低,表明对接的效果越好，结合的构象越稳定[18]。经AutoDock Vina对接，将得到的结合能数据使用热图展示（图7）。本研究结合自由能小于−20.92kJ/mol 的活性成分有102个，占75.6%；小于−29.29kJ/mol 的活性成分有73个，占54.1%，可见这些核心化合物与受体结合活性较高，结构相对稳定。选取结合能力最好的4个组合用Pymol软件进行可视化处理（图8）。
图 7 分子对接分数热图分析
图 8 西红花苷Ⅱ与核心靶点分子对接可视化 (结合能<−48 kJ/mol)
-
肿瘤的发生和发展是多基因、多步骤的结果。中药多成分、多靶点的特点使其在肿瘤治疗方面有独特的优势。大量的临床实践表明，中药在治疗肿瘤中能够改善症状、提高患者生存质量、延长生存期等，有着其他治疗药物及手段不可替代的作用[19-20]。以中药黄芪为例，不仅可以通过Wnt5/β-catenin信号通路抑制肿瘤生长[21]，同时具有通过PD-L1下调诱导耐药黑色素瘤的干性抑制和化疗敏感性增强的作用，可以减少化疗药物用量[22]，还能充当免疫佐剂，提高患者免疫力，改善生存质量[23]。网络药理学最大的优势在于可以运用系统生物学的分析，为中药多成分、多靶点、多通路的机制研究提供有力的技术支撑[12]，其分析理念和技术路径又与中医药治疗疾病的整体观相契合，已用于多种中药和中药复方作用机制的研究，如灯盏细辛、半枝莲等中药和茵陈蒿汤、桃红四物汤等中药复方，利用网络药理学的方法得到治疗机制的详细阐述和证明[24–27]，为中药药理作用机制的探索提供了很好的参考。
本研究发现西红花中多种成分，如西红花酸、西红花苷等可与IL-6、AKT1、CCND1、IL-1β、MMP9、EGFR、TP53靶点产生适度结合，提示这些靶点可能是西红花中活性成分发挥抗肿瘤作用的关键靶点。研究发现，AKT1是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的重要靶点，被磷酸化激活后可以促进细胞的增殖与存活，与肿瘤细胞的生长密切相关[28]。多项研究表明，通过抑制AKT1可以治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种实体癌[29]。EGFR与一些全球发病率和致死率高的癌症发病机制直接或间接相关，包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌等[30]。当EGFR过度表达时，细胞表面会出现过量的受体，诱导正常的细胞转化为癌细胞，并为癌细胞持续生存提供条件[31]。CCND1是细胞周期家族的一员[32]，公认的原癌基因,在甲状旁腺瘤、乳腺癌、肝癌及食管、肺、头颈部鳞状细胞癌的发生、发展过程中均起着重要作用[33-34]。西红花苷是由西红花酸和龙胆二糖或葡萄糖结合形成的二萜苷类化合物，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的差别在于分子中糖苷基数目的多少 [35]。西红花酸已具有抗肿瘤作用，以其为苷元形成的西红花苷同样也表现出较好的抗肿瘤活性，其中西红花苷Ⅱ的表现最好。西红花苷可以通过P53途径下调细胞周期蛋白d1和p21的表达，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，从而抑制肿瘤生长[36]。分子对接的结果与GO富集分析、KEGG通路富集分析结果一致，验证了网络药理学分析结果的正确性。
Buyun等学者在肝癌Hep3B和HepG2细胞中使用西红花苷抑制了IL-6对STAT3以及细胞周期蛋白D1的激活，验证了西红花对肝癌细胞的抗增殖，凋亡和阻断入侵作用[37]。在转移性乳腺癌的研究中，Ali等研究人员在体内和体外实验中均证明了西红花苷可以通过VEGF和MMP9下调发挥抗肿瘤作用，而且对乳腺癌的转移扩散有较好的抑制作用[38]。这些研究成果在一定程度上验证了利用网络药理学探究发现的西红花抗肿瘤作用机制的可行性。
综上所述，本研究利用网络药理学结合分子对接技术，探究西红花抗肿瘤作用的活性成分、作用靶点及信号通路。发现西红花抗肿瘤的作用具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，其中以西红花苷为代表的西红花特有化学成分显示出了良好的抗肿瘤活性，可以在多条肿瘤发生通路中发挥作用，为西红花治疗肿瘤的深入研究提供了理论基础。但这些结果受限于各个数据库信息的片面性，而且只关注了成分，没有考量到成分的含量及其之间是否存在相互作用，预测的结果存在一定的片面性和局限性，需要进一步进行体内、外实验验证。
Anti-tumor mechanism study on saffron by network pharmacology and reverse molecular docking
-
摘要:
目的 运用网络药理学和反向分子对接技术探讨西红花抗肿瘤的作用机制。 方法 通过检索文献和从中药系统药理学数据库（TCMSP）获取西红花的主要化学成分，利用PharmMapper服务器预测西红花活性成分的潜在靶点，通过UniProt数据库将西红花潜在靶点转换为对应的靶标基因，与GeneCards、OMIM和TTD数据库获得的肿瘤相关靶点进行映射分析，得到西红花抗肿瘤的潜在作用靶点。采用Cytoscape软件构建西红花“活性成分-靶点-疾病”相互作用网络，通过String数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析，并利用Metascape平台进行GO功能和KEGG通路富集分析。使用AutoDock、Pymol软件对活性成分与关键靶点进行分子对接验证。 结果 共筛选出西红花中槲皮素、山柰酚、异鼠李素、苦番红花素和西红花苷Ⅰ等9个活性成分，可能作用于AKT1、CCND1、MMP9、EGFR、TP53等37个关键靶点，涉及P53信号通路及TNF信号通路等。分子对接显示可通过氢键、疏水作用等产生稳定结合。 结论 初步探讨了西红花抗肿瘤的主要活性成分、关键靶点及通路，提示可通过诱导细胞凋亡等方式发挥抗肿瘤作用，为后续实验验证提供参考依据。 Abstract:Objective To explore the anti-tumor mechanism of saffron (Crocus sativus L.) by network pharmacology and reverse molecular docking techniques. Methods The main chemical components of saffron were obtained by searching published literature and TCMSP database. The potential targets of these components were predicted using PharmMapper server. The corresponding target genes were identified from UniProt database. The underlying anti-tumor targets of saffron were obtained by mapping the disease genes of cancer or tumor with GeneCards, OMIM and TTD databases. Cytoscape software was used to construct the action target network of saffron active components. The protein-protein interaction analysis was performed by String database, and the GO function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by Metascape platform. Finally, molecular docking was performed to evaluate the binding of main components with their potential targets. Results A total of 9 active ingredients in saffron including quercetin, kaempferol, isorhamnetin, picrocrocin and crocin I, were identified, which might act on 37 key targets including AKT1, CCND1, MMP9, EGFR, TP53, involved in P53, TNF and other signaling pathways. Molecular docking indicated modest binding potency through hydrogen bonding, and hydrophobic interactions. Conclusion The anti-tumor effect of saffron was evaluated via the network of components-targets-pathways, which might provide a foundation for further research. -
Key words:
- saffron /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- anti-tumor mechanism
-
花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。
大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MSE）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。
1. 材料
1.1 样品
花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。
1.2 仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。
HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。
2. 方法
2.1 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立
2.1.1 溶液的配制
称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。
取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。
对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。
2.1.3 线性关系
取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。
2.1.4 精密度
取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。
2.1.5 稳定性
取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。
2.1.6 重复性
按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。
2.1.7 加样回收率
精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。
2.2 大孔树脂纯化富集工艺优化
2.2.1 树脂类型
95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。
2.2.2 上样量
湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。
2.2.3 单因素实验考察上样条件
除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。
2.2.4 正交试验考察除杂、洗脱条件
在单因素实验的基础上，采用L9（33）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。
表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表条件 水平 因素 A因素溶剂 B因素体积（BV） C因素流速（BV/h） 除杂 1 蒸馏水 1 2 2 10%乙醇 2 3 3 20%乙醇 3 5 洗脱 1 55%乙醇 3 2 2 70%乙醇 5 3 3 80%乙醇 8 5 2.3 花椒生物碱的化学成分分析
2.3.1 样品制备
精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
2.3.2 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。
2.3.3 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×105 Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~
1500 。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]−）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]+）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。
3. 结果与分析
3.1 HPLC图与方法学实验结果
3.1.1 花椒生物碱的HPLC图
供试品HPLC图如图1所示，该色谱条件下，HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于
30000 、峰形稳定、无干扰，能够满足样品分析检测要求。3.1.2 线性关系考察结果
以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到HAS的回归方程Y=
3312.7 X−8.887，r=0.999；HBS的回归方程Y=33030 X+12.061，r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。3.1.3 精密度实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%，仪器精密度良好，符合定量测定要求。
3.1.4 稳定性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
3.1.5 重复性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%，表明方法重复性良好。
3.1.6 加样回收率实验结果
计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为（103.66±0.62）%、（100.22±3.10）%、（102.47±1.24）%；HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为（101.35±0.89）%、（98.58±2.48）%、（98.86±1.02）%。结果表明该测定方法准确性好，可用于样品中HAS、HBS的含量测定。
3.2 大孔树脂纯化富集工艺
3.2.1 树脂类型的确定
使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时，HAS、HBS两成分的总含量（X）最高且结果稳定，结果见表2。因此，优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。
表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）树脂类型 HAS、HBS
总浓度（mg/ml）HAS、HBS
总含量（%）$ \bar{X} $±SD（%） APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17 NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76 宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09 AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28 HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98 三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62 3.2.2 上样量的确定
由图2可知，当上样液体积为90 ml时，花椒生物碱开始少量泄漏；随着上样体积增加，流出液中生物碱浓度呈现上升趋势；当上样液为210 ml时，累计泄漏率为9.61%，接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml，即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。
3.2.3 上样条件的确定
由图3可知，当上样液浓度为0.2 g生药/ml时，HAS和HBS的得率最高；随着浓度升高，杂质增多，与生物碱竞争吸附活性位点，得率下降；此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时，HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱，动态吸附流速为4 BV/h。
3.2.4 除杂、洗脱条件的确定
如表3所示，以HAS、HBS总得率为指标时，影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂（A）>除杂流速（C）>除杂体积（B）。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV，结果差异并不明显，为节约溶剂、提高效率，优选2 BV为除杂体积。
表 3 除杂条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率（%） 除杂溶剂（A） 除杂体积（B） 除杂流速（C） 1 1 1 1 7.87 2 1 2 2 9.09 3 1 3 3 9.31 4 2 1 2 10.33 5 2 2 3 10.42 6 2 3 1 10.67 7 3 1 3 11.82 8 3 2 1 10.73 9 3 3 2 11.66 k1 8.75 10.06 9.71 − k2 10.44 10.07 10.34 − k3 11.37 10.48 10.52 − R 2.62 0.64 0.81 − 由表4可知，洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂（A）>洗脱流速（C）>洗脱体积（B）；最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇，洗脱体积为5 BV，洗脱流速5 BV/h。
表 4 洗脱条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率
（%）洗脱溶剂（A） 洗脱体积（B） 洗脱流速（C） 1 1 1 1 2.55 2 1 2 2 5.38 3 1 3 3 7.15 4 2 1 2 5.75 5 2 2 3 8.11 6 2 3 1 9.57 7 3 1 3 9.20 8 3 2 1 8.28 9 3 3 2 6.36 k1 5.03 5.83 6.80 − k2 7.81 7.26 5.83 − k3 7.95 7.69 8.15 − R 2.92 1.86 2.32 − 3.2.5 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证
实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10，溶剂为50%乙醇，95℃水浴加热，每次回流提取1 h，提取3次，过滤后合并滤液；45℃减压浓缩至无醇味，纱布过滤，加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液；按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml，上样于三菱HP-20型大孔树脂，树脂柱径高比1∶7，动态吸附流速4 BV/h，静置1 h后，2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂；80%乙醇洗脱，体积5 BV，流速5 BV/h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得花椒生物碱提取物。
由表5可知，三次重复实验花椒生物碱得膏率相近，富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%，证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠，重复性高。此外，经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，与富集纯化前相比，花椒生物碱的含量得到明显升高。
表 5 最佳工艺验证结果编号 得膏率
（%）富集前
总含量（%）富集后
总含量（%）富集后
总含量RSD（%）1 6.88 0.82 5.73 0.87 2 6.91 0.81 5.72 0.87 3 6.95 0.82 5.64 0.87 3.3 生物碱类化合物的鉴定
通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献，收集花椒的化学成分信息，包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等，建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。
由图4可知，在正离子模式下，生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收，并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析，共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物，包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等（见表6）。
表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果峰号 保留时
间（t/min）化合物 分子式 离子模式 理论值
（m/z）实测值
（m/z）误差
（ppm）碎片离子
（m/z）参考
文献1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17] 2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18] 4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20] 7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18] 10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21] 11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22] 12* 22.701 羟基-α−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23] 13* 23.113 羟基-β−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23] 14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24] 15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 16 26.379 羟基-γ−
异山椒素C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23] 20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25] *：为与对照品比对的化合物。 4. 讨论
实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。
HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。
本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。
-
表 1 西红花活性成分
序号 化合物编号 化合物英文名 中文名 OB (%) DL 1 MOL001389 n-heptanal 庚醛 79.74 0.59 2 MOL001406 crocetin 西红花酸 35.3 0.26 3 MOL000354 isorhamnetin 异鼠李素 49.6 0.31 4 MOL000422 kaempferol 山柰酚 41.88 0.24 5 MOL000098 quercetin 槲皮素 46.43 0.28 6 MOL001405 crocin Ⅰ 西红花苷Ⅰ 2.54 0.12 7 MOL001407 crocin Ⅱ 西红花苷Ⅱ 1.65 0.21 8 MOL000720 safranal 藏红花醛 39.56 0.04 9 MOL001409 picrocrocin 苦番红花素 33.71 0.04 
下载: 导出CSV
-
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京: 科学出版社, 2020: 122 [2] 李时珍. 本草纲目[M]. 天津: 天津科学技术出版社, 2019: 368. [3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典-一部: 2020年版[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020. [4] 邓颖, 郭志刚, 曾兆麟, 等. 藏红花的药理研究进展[J]. 中国中药杂志, 2002, 27(8):565-568. doi: 10.3321/j.issn:1001-5302.2002.08.002 [5] 张娜, 李林森. 藏红花药理作用研究进展[J]. 药物评价研究, 2013, 36(5):394-396. [6] 何美莲, 陈家宽, 周铜水. 番红花化学成分及生物活性研究进展[J]. 中草药, 2006, 37(3):466-470. doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2006.03.054 [7] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660 [8] HUANG M, LU J J, DING J. Natural products in cancer therapy: past, present and future[J]. Nat Prod Bioprospect,2021,11(1):5-13. doi: 10.1007/s13659-020-00293-7 [9] BAI X, MU S, ZHANG W, et al. Mechanism of natural product crocin in the treatment of lung adenocarcinoma targeting TMEM16A ion channel[J]. SCIENTIA SINICA Vitae,2021,51(9):1299-1307. doi: 10.1360/SSV-2021-0268 [10] XU Q X, YU J S, JIA G W, et al. Crocin attenuates NF-κB-mediated inflammation and proliferation in breast cancer cells by down-regulating PRKCQ[J]. Cytokine,2022,154:155888. doi: 10.1016/j.cyto.2022.155888 [11] GÜLLÜ N, KOBELT D, BRIM H, et al. Saffron crudes and compounds restrict MACC1-dependent cell proliferation and migration of colorectal cancer cells[J]. Cells,2020,9(8):1829. doi: 10.3390/cells9081829 [12] World Federation of Chinese Medicine Societies;. 网络药理学评价方法指南[J]. 世界中医药, 2021, 16(4):527-532. doi: 10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.001 [13] 江雪, 刘梦璠, 刘华, 等. 西红花的资源分布及抗肿瘤研究进展[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2021, 23(9):3251-3263. [14] COLAPIETRO A, MANCINI A, D'ALESSANDRO A M, et al. Crocetin and crocin from saffron in cancer chemotherapy and chemoprevention[J]. Anticancer Agents Med Chem,2019,19(1):38-47. doi: 10.2174/1871520619666181231112453 [15] BOLHASSANI A, KHAVARI A, BATHAIE S Z. Saffron and natural carotenoids: biochemical activities and anti-tumor effects[J]. Biochim Biophys Acta BBA Rev Cancer,2014,1845(1):20-30. doi: 10.1016/j.bbcan.2013.11.001 [16] LIU X F, OUYANG S S, YU B, et al. PharmMapper server: a web server for potential drug target identification using pharmacophore mapping approach[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(Web Server issue): W609-W614. [17] TROTT O, OLSON A J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. J Comput Chem,2010,31(2):455-461. [18] PINZI L C, RASTELLI G. Molecular docking: shifting paradigms in drug discovery[J]. Int J Mol Sci,2019,20(18):4331. doi: 10.3390/ijms20184331 [19] HOU J, SHI K, LIU Y, et al. Effects of traditional Chinese medicine adjuvant therapy on the survival of patients with primary liver cancer[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2022,2022:9810036. [20] LIU L, WEI Y, TENG Y, et al. Health-related quality of life and utility scores of lung cancer patients treated with traditional Chinese medicine in China[J]. Patient Prefer Adherence,2022,16:297-306. doi: 10.2147/PPA.S344622 [21] BIAN Y, WANG G, ZHOU J, et al. Astragalus membranaceus (Huangqi) and Rhizoma curcumae (Ezhu) decoction suppresses colorectal cancer via downregulation of Wnt5/β-Catenin signal[J]. Chin Med,2022,17(1):11. doi: 10.1186/s13020-021-00564-6 [22] GONG Q Y, YU H, DING G Q, et al. Suppression of stemness and enhancement of chemosensibility in the resistant melanoma were induced by Astragalus polysaccharide through PD-L1 downregulation[J]. Eur J Pharmacol,2022,916:174726. doi: 10.1016/j.ejphar.2021.174726 [23] 王超楠, 程东岩, 王健, 等. 黄芪及复方黄芪制剂双向免疫调节作用研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2021, 39(5):126-129. doi: 10.13193/j.issn.1673-7717.2021.05.031 [24] CHEN Z Q, LIN T, LIAO X Z, et al. Network pharmacology based research into the effect and mechanism of Yinchenhao Decoction against Cholangiocarcinoma[J]. Chin Med,2021,16(1):13. doi: 10.1186/s13020-021-00423-4 [25] ZHAO J, LV C, WU Q L, et al. Computational systems pharmacology reveals an antiplatelet and neuroprotective mechanism of Deng-Zhan-Xi-Xin injection in the treatment of ischemic stroke[J]. Pharmacol Res,2019,147:104365. doi: 10.1016/j.phrs.2019.104365 [26] 杨沙, 段灿灿, 晏仁义, 等. 基于网络药理学的半枝莲抗肿瘤活性成分及整合作用机制研究[J]. 中草药, 2018, 49(15):3471-3482. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2018.15.003 [27] 王伟军, 段雪云, 汪伟. UPLC-Q-TOF-MS联合网络药理学和实验验证分析桃红四物汤治疗软组织损伤的作用机制[J]. 中国中药杂志, 2021, 46(12):3043-3051. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20210311.403 [28] 赵家义, 韩一平. PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂与肿瘤免疫治疗[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2017, 24(12):1424-1430. doi: 10.3872/j.issn.1007-385X.2017.12.015 [29] YAP T A, YAN L, PATNAIK A, et al. First-in-man clinical trial of the oral pan-AKT inhibitor MK-2206 in patients with advanced solid tumors[J]. J Clin Oncol,2011,29(35):4688-4695. doi: 10.1200/JCO.2011.35.5263 [30] WEE P, WANG Z X. Epidermal growth factor receptor cell proliferation signaling pathways[J]. Cancers,2017,9(5):52. doi: 10.3390/cancers9050052 [31] CHENG Y, MA L X, LIU Y, et al. Comprehensive characterization and clinical impact of concomitant genomic alterations in EGFR-mutant NSCLCs treated with EGFR kinase inhibitors[J]. Lung Cancer,2020,145:63-70. doi: 10.1016/j.lungcan.2020.04.004 [32] LIAO Y M, SONG Y, LI Y K, et al. SOX17, β-catenin and CyclinD1 expression in the endometrioid adenocarcinoma and influence of 5-AZA on expression[J]. Cancer Gene Ther,2020,27(3-4):256-263. doi: 10.1038/s41417-019-0135-5 [33] XI J B, SUN Y C, ZHANG M T, et al. GLS1 promotes proliferation in hepatocellular carcinoma cells via AKT/GSK3β/CyclinD1 pathway[J]. Exp Cell Res,2019,381(1):1-9. doi: 10.1016/j.yexcr.2019.04.005 [34] GUO F, XUE J. microRNA-628-5p inhibits cell proliferation and induces apoptosis in colorectal cancer through downregulating CCND1 expression levels[J]. Mol Med Rep,2020,21(3):1481-1490. [35] ALAVIZADEH S H, HOSSEINZADEH H. Bioactivity assessment and toxicity of crocin: a comprehensive review[J]. Food Chem Toxicol,2014,64:65-80. doi: 10.1016/j.fct.2013.11.016 [36] ASHRAFI M, BATHAIE S Z, ABROUN S, et al. Effect of crocin on cell cycle regulators in N-nitroso-N-methylurea-induced breast cancer in rats[J]. DNA Cell Biol,2015,34(11):684-691. doi: 10.1089/dna.2015.2951 [37] KIM B, PARK B. Saffron carotenoids inhibit STAT3 activation and promote apoptotic progression in IL-6-stimulated liver cancer cells[J]. Oncol Rep,2018,39(4):1883-1891. [38] FARAHI A, ABEDINI M R, JAVDANI H, et al. Crocin and Metformin suppress metastatic breast cancer progression via VEGF and MMP9 downregulations: in vitro and in vivo studies[J]. Mol Cell Biochem,2021,476(9):3341-3351. doi: 10.1007/s11010-020-04043-8 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 6709
- HTML全文浏览量: 2625
- PDF下载量: 57
- 被引次数: 0
