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心力衰竭具有高发病率和病死率，是绝大多数终末期心脏病的最终归宿[1]。近几十年来，HF的治疗在医疗和设备方面有了很大的创新，但其发病率仍在不断增加，HF患者的生活质量和预期寿命依然出现不同程度的损害[2]。心脏能量需求是非常高的，需要源源不断消耗ATP来维持收缩舒张的功能。研究发现，HF患者会出现严重的能量代谢紊乱，包括底物吸收和利用、氧化磷酸化和ATP穿梭障碍，最终，导致心脏能量供应不足[3]。目前，关于HF疗法主要是通过降低心率、前负荷和后负荷来减轻心脏负荷，从而治疗和延缓疾病进展。关于影响心脏能量代谢的药物有很多基础研究，而能用于临床治疗的却少之又少。本综述将简单概述健康心脏和HF期间的心脏能量代谢，及通过调节能量代谢降低HF的潜在药物。
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心脏可利用葡萄糖、脂质、氨基酸和酮体等各种底物来提供能量以维持正常的工作，它对底物的利用随生命周期生理、病理和外部环境的变化而变化[4]。胎儿由于在缺氧和低脂肪酸的环境中生存，此时，心肌主要依靠葡萄糖和乳酸代谢来产能[5]。出生后的新生儿不仅心脏血流动力学负荷和氧分压增加，且线粒体数量也在快速增加，这样会显著提高心脏的氧化能力。此时，心脏对葡萄糖的依赖减少，血乳酸水平开始下降。随着三酰甘油含量的增加，脂肪酸氧化成为心脏能量的主要来源[6]。脂肪酸是成人心脏主要的能量来源，占60%~90%，其余10%~40%来源于葡萄糖、氨基酸、丙酮酸、乳酸、酮体等[7]。其中，线粒体的氧化磷酸化可供给约95%的心肌所需的ATP，剩下的5%由糖酵解提供[8]。
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在正常情况下，脂肪酸和葡萄糖能否得到充分利用，取决于代谢底物和氧气的浓度。1 mol的20碳脂肪酸完全氧化产生的ATP量（约134 mol）远大于1 mol葡萄糖产生的ATP量（约30 mol）。研究发现，当它们产生相同数量的ATP时，脂肪酸氧化比葡萄糖氧化需要更多的氧气。而在氧气缺少的情况下，脂肪酸氧化的生产效率明显低于葡萄糖氧化[9]。HF后的低氧环境将心脏的能量代谢逆转为胎儿期的能量代谢，葡萄糖代谢将是主要的能量来源[10]。在HF期间，葡萄糖摄入量和糖酵解速率显著增加，以补偿脂肪酸氧化以提供能量。由于HF期间，心肌细胞对游离脂肪酸的利用显著降低，血浆中游离脂肪酸浓度升高，这样可能会进一步加重能量代谢紊乱和心肌损伤[11]。
正常成人心脏中90%的能量是由线粒体的氧化磷酸化提供的。许多研究证实，心血管疾病，如心律失常、心肌病和HF，与线粒体功能和结构的改变有关[12]。研究表明，HF时心肌细胞线粒体基因突变率显著增加，引起线粒体畸变，从而影响线粒体氧化呼吸链相关酶复合物的活性和线粒体蛋白的合成[13]。这些变化导致线粒体功能障碍，影响线粒体能量代谢，耗尽心肌细胞中的能量，加快HF的进程。
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激素是人体必需的物质，在调节新陈代谢、生长、发育、繁殖等过程中发挥着重要作用。一些激素类药物，包括甲状腺素、松弛肽和雌激素，已被用于治疗心脑血管疾病。甲状腺素是体内不可或缺的激素，与生长、细胞凋亡和能量代谢息息相关。最近的研究表明，甲状腺素可通过LKB1/AMPK/mTOR 通路来减少心肌细胞凋亡、减少能量损失和预防多柔比星引起的心脏损伤[14]。因此，甲状腺素有望成为临床预防多柔比星化疗所致心脏损害的新药。临床研究表明，怀孕期间给予松弛肽-2，可以延长急性HF患者的生存期[15]。松弛肽抗HF的分子机制目前尚不清楚，可能与内源性长链多不饱和脂肪酸的合成、氨基酸修饰中的能量代谢和心血管结构调节有关[16]。雌激素促进女性副性器官的发育、成熟和第二性征的出现，帮助维持正常的性欲和生殖功能。研究表明，雌激素可以通过保护线粒体含量和氧化能力来保护肺动脉高压模型小鼠的右心室功能。
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有临床观察表明，二甲双胍可提高非糖尿病HF患者的心肌效率，降低耗氧量，改善心功能[17]。研究表明，二甲双胍可在一定程度上恢复左心室舒张功能，并降低免疫和炎症反应[18]。它还可以增加梗死后心力衰竭小鼠的收缩功能，同时减少心肌细胞的凋亡[19]。二甲双胍改善心功能的机制可能与调节葡萄糖吸收、线粒体功能和氧化应激有关。二甲双胍通过刺激活化 PI3K–PKB/AKT和AMPK的通路来增加葡萄糖摄取，这种积极作用已在胰岛素抵抗心肌细胞和正常胰岛素敏感心肌细胞中得到了验证[20]。二甲双胍还可以通过调节SIRT3降低PGC-1α乙酰化水平、降低受损的线粒体膜电位和增加线粒体呼吸功能来改善小鼠的心脏功能[19]。
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钠-葡萄糖转运蛋白2(SGLT2)抑制剂是最近研发的一类抗糖尿病药物，如达格列净、卡格列净和恩格列净。有研究发现SGLT2抑制剂是潜在的心血管保护药物，在临床评估心血管安全性时可用于治疗HF[21]。临床研究表明，达格列净可降低2型糖尿病和HF患者的糖尿病性心肌病的风险，并有利于改善左心室功能。此外，达格列净还可以减轻HF患者的症状，改善身体功能和生活质量，降低心血管疾病HF进展和病死率[22]。此外，还观察到卡格列净和恩格列净也可改善HF患者的状况[23]。
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吡格列酮是一种胰岛素增敏的噻唑烷二酮和PPARγ激动剂。研究发现，吡格列酮可逆转严重肺动脉高压和血管重构，预防右心室HF，这与通过 miRNA/mRNA 网络调节心脏肥大、纤维化、心肌收缩力、脂肪酸转运/氧化和转化生长因子信号转导有关[24]。
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辛伐他汀是一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂，常用于高血脂的治疗，主要用于降低胆固醇。临床观察发现，服用辛伐他汀20 d可显着降低慢性HF患者的促炎标志物IL-6和C反应蛋白水平[25]。它还可以诱导脂滴积累，为维持线粒体功能提供能量，并抑制线粒体损伤和心肌细胞凋亡[26]。此外，辛伐他汀还通过降低心房诱导的一氧化氮合酶、钠钙交换剂来降低缺血性HF大鼠的氧化应激、内皮血栓形成和心房颤动[27]。
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非诺贝特属于苯氧芳酸类降脂药，主要用于降低三酰甘油。它是一种高度选择性PPARα配体，可降低低密度脂蛋白、总胆固醇和三酰甘油的水平，并增加高密度脂蛋白[28]。研究发现，非诺贝特可防止HF模型犬心脏代谢底物的转化，并适度改善心脏功能[29]。还有研究发现，在异丙肾上腺素诱导的HF大鼠身上，非诺贝特可增加线粒体中的脂肪酸氧化，增加心肌能量代谢和氧化应激，从而保护心脏功能[30]。
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曲美他嗪常用于治疗心绞痛，是代谢治疗中研究最广泛的药物之一。临床研究发现，它可以改善 HF患者的心脏功能、运动耐量、生活质量、左心室射血分数和心脏容量[31]。它还可以通抑制脂肪酸氧化，促进葡萄糖代谢，并维持细胞中的 PCr/ATP 比率[32]。
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卡维地洛是一种α 1和β受体阻断剂，具有扩张血管的作用。常用于治疗轻度或中度高血压，或肾功能不全和糖尿病患者。一项临床研究表明，长期使用卡维地洛可以提高非缺血性HF患者的生存率，而更高剂量（7.5 mg/d）的卡维地洛可以提高低心率和低射血分数HF患者的生存率，但对射血分数保留的患者无效[33]。卡维地洛可降低充血性HF患者的心肌脂肪酸利用，但对葡萄糖利用没有影响[34]。它还可以增加射血分数，降低纽约心脏协会的心脏分级，增加PCr/ATP比率和代谢当量，并维持心肌高能磷酸盐水平[35]。此外，它可以增加心肌缺血模型大鼠的线粒体能量电荷，减少磷酸化滞后阶段的长度，改善心肌缺血期间的线粒体功能[36]。
已经发现这些治疗HF的合成药物在治疗其他疾病时可以改善能量代谢并保护心肌，而不是专门开发用于改善HF的能量代谢。这表明我们可以通过这些药物在体内的作用机制找到新的或最佳的HF治疗靶点，为临床药物开发治疗HF的药物提供了可能。同时，需要进一步研究这些合成药物及其衍生物治疗不同因素所致HF的特异性和安全性，为其临床应用提供更多参考。
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多酚是一大类植物化学物质，存在于各种食物中，例如，水果、蔬菜、豆类、谷物、可可或巧克力，以及红酒、咖啡和茶等饮料。按其结构特点，大致可分为黄酮类、酚酸类、木脂素类和芪类。白藜芦醇、槲皮素、姜黄素和表没食子儿茶素没食子酸酯等多酚类物质对动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死、蒽环类药物引起的心肌病、血管生成和HF有明显的保护作用[37]。大量多酚已被证明可有效通过能量代谢减少心血管疾病，但只有白藜芦醇进入了系统化、标准化的临床试验。此外，一些富含多酚的提取物值得关注。例如，长期使用绿茶提取物可以改善正常心肌细胞的细胞力学性能和细胞内钙动力学，提高能量利用率，并消除受磷蛋白对肌浆网Ca2+依赖性ATPase 2a的抑制作用。
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目前，人参皂苷是用于治疗HF的主要皂苷，又称三萜皂苷。人参总皂苷通过激活TCA循环中的特定蛋白来增加心脏能量代谢[38]。阿江榄仁酸是一种天然存在的手性三萜皂苷，可以降低心肌细胞中的氧化磷酸化活性、活性氧水平和氧化应激，以减少线粒体功能障碍和增加糖酵解速率。此外，它还可以上调PPARα，降低TAK1的磷酸化水平，抑制p38 MAPK和NF-κB P65的活化，减少胶原合成和心脏肥大，从而保护心脏[39]。黄芪甲苷是黄芪提取物。它可以增加PPARα、中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)和肌肉肉碱棕榈酰转移酶-1(MCP1)的表达，并增加慢性HF大鼠对游离脂肪酸的利用，从而改善心脏功能和抑制心室重构[40]。同时，它还能刺激脂肪酸β氧化并改善HF动物的线粒体功能，是一种抑制HF进展的潜在药物[41]。
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从植物中提取的多糖对心血管疾病具有治疗作用，这与其抗炎和抗氧化作用有关[42]。但关于多糖是否调节心脏能量代谢的报道有限，仅有麦冬多糖、枸杞多糖和黄芪多糖有报道。麦冬多糖可显著降低转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶水平，提高ATP酶活性，对缺血性心肌损伤具有保护作用[43]。枸杞的提取物枸杞多糖可以通过上调线粒体生物基因调节因子促进肌肉分化和能量代谢，通过减少HF小鼠的炎性细胞因子和脂质过氧化来发挥心脏保护作用[44]。有报道，黄芪多糖可以调节TNF -α/PGC-1信号通路介导的能量生物合成，降低ANP的mRNA和蛋白表达，增加ATP/ADP和ATP/AMP的比值，降低游离脂肪酸含量和抑制心肌细胞肥大[45]。
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猪毛菜酚是一种来自乌头植物的生物碱。它可降低多柔比星诱导的慢性HF，降低血清心肌损伤标志物水平，减少对心脏的组织损伤，并增加TCA循环下游关键酶的mRNA 表达水平，从而增加心脏能量代谢[46]。和乌胺是一种典型的β2-肾上腺素选择性受体激动剂，也是乌头植物中的一种生物碱，可显着增加心肌收缩力[47]。川芎嗪又名四甲基吡嗪，是从川芎中分离得到的生物碱。它可以促进BCL-2向线粒体的转移，改善线粒体功能，从而防止脂多糖引起的心肌损伤[48]。它还可以通过下调miR-499a、上调SIRT1和激活 PI3K/AKT通路来减轻缺氧诱导的H9c2细胞凋亡[49]。
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中药中，不同机制的天然产物，甚至几种药材，按照一定的规律进行组合，可以最大限度地发挥药效，减少毒副作用。这种做法即为临床补充和替代疗法。临床研究发现，口服参附颗粒可显著改善慢性HF患者的生活质量[50]。参附注射液通过刺激抗氧化剂和改变磷脂水平、分布以及牛磺酸、谷胱甘肽和磷脂的水平来减少心肌梗死的面积并保护心肌[51]。此外，临床观察发现，由十一味草药（黄芪、人参、附子、丹参、葶苈子、泽泻、玉竹、桂枝、红花、香加皮、陈皮）提取物组成的芪苈强心胶囊可以改善HF患者的生活质量，降低了心血管疾病的发生率和再住院率[52]。目前，一些天然成分和草药的联合使用和安全性仍在研究中，但它们为HF的替代和补充治疗以及HF药物的开发提供了可能。
我们对上述激素、合成药物和天然药物（表1）研究发现，大多数药物或成分可以作用于多种途径或靶点，并调节多种底物代谢。这表明我们可以考虑不同药物的组合，特别是一些大剂量、安全窗口窄的药物，可以减少剂量、耐药性和副作用。这些组成部分应进一步研究，并为其开发和应用提供可靠的数据。此外，我们还应该专注于利用这些药物的体内机制来寻找新的或最佳的HF治疗靶点。然后，应将研究结果应用于临床实践，开发更有效的治疗HF的药物和合理的治疗策略。
表 1 药物的已知途径、靶点和代谢途径摘要
药物类别 药物名称 已知通路或靶点 已知的代谢途径 激素 甲状腺素 LKB1/AMPK/mTOR 脂肪酸代谢 松弛素 – 脂肪酸合成、氨基酸代谢 雌激素 – 线粒体功能 合成药物 二甲双胍 PI3K-PKB/AKT、AMPK、PGC-1α 葡萄糖代谢、线粒体功能、氧化应激 SGLT2抑制剂 AMPK、 Na+/H+ 交换剂、NLRP3 炎症小体 酮代谢、线粒体功能、细胞内钠稳态、胰岛素信号传导、氧化应激 吡格列酮 PPAR γ 脂肪酸氧化，线粒体功能 辛伐他汀 iNOSitol、INCX、Rac1 线粒体功能，氧化应激 非诺贝特 PPARα 脂肪酸代谢 曲美他嗪 长链3-酮酰基辅酶A硫溶酶 葡萄糖代谢、脂肪酸代谢 卡维地洛 α1、β受体 脂肪酸代谢，线粒体功能 天然药物 白藜芦醇 SIRT1、CYP1B2 葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、线粒体功能、胰岛素信号、钙2+浓度 人参皂苷Rb1 TGF-β1/SMAD ERK、AKT 葡萄糖代谢 人参皂苷Rb3 PPARα 脂肪酸代谢，线粒体功能 阿江榄仁酸 P47phox、ERK、PPARα、TAK1、p38 MAPK、NF-κB P65 葡萄糖代谢、线粒体功能、氧化应激 黄芪甲苷 PPARα、MCAD、MCP1 脂肪酸代谢，线粒体功能 麦冬多糖 AST、 LDH、CK、CK-MB、ATPase 线粒体功能 枸杞多糖 线粒体生物基因调控因子 脂肪酸代谢，线粒体功能 黄芪多糖 TNF-α/PGC-1 脂肪酸代谢 猪毛菜酚 – 线粒体功能 和乌胺 PPAR α/PGC-1α/SIRT3 线粒体功能 川芎嗪 miR-499a、SIRT1、PI3K/AKT 线粒体功能 -
大量证据表明，优化心肌能量代谢，尤其是调节底物代谢，可以保持或改善心肌机械功能，延缓HF进展，改善心功能分级、运动耐量、生活质量、左心室射血评分甚至存活率。然而，如何根据不同的病理情况选择合适的底物进行充分代谢，促进心肌代谢物的活性，增加整体供能，是HF药物的研究方向，也是亟待解决的问题。此外，大多数治疗HF的药物的开发通过能量代谢仍处于基础研究阶段，这些药物的疗效和应用变化也缺乏临床数据支持。研究人员应进一步探索HF发病机制与心肌能量代谢变化的关系，阐明影响HF能量代谢的信号通路和关键调控因素，研发有效的新方法，包括天然药物，以预防HF的发生和发展。
Advances in potential drugs for improvement of energy metabolism in heart failure
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摘要: 心力衰竭（HF）是一个全球性的公共卫生问题，发病率和死亡率都很高。研究表明，HF是由严重的能量代谢紊乱引起的，导致心脏能量供应不足。这种能量缺乏会导致心脏泵血功能障碍和全身其他器官能量代谢的衰竭。针对HF的疗法主要通过降低心率和心脏前负荷和后负荷、对症治疗或延缓疾病的发展来发挥作用。然而，针对心脏能量代谢的药物却尚未研发出来。本文概述健康心脏中能量代谢的主要特征、HF期间的代谢变化，并讨论通过能量代谢来改善心脏功能的药物，为治疗HF药物的研发和应用提供新的研究方向。Abstract: Heart failure (HF) is a global public health problem with high morbidity and mortality. Numerous studies have shown that HF is caused by severe disturbance of energy metabolism, resulting in insufficient cardiac energy supply. This lack of energy could lead to a failure of the heart to pump blood and a failure of energy metabolism in other organs throughout the body. Currently, therapeutics of HF work by reducing heart rate and cardiac preload and afterload, symptomatic treatment, or delaying the progression of the disease. However, drugs targeting heart energy metabolism have not been developed. the main characteristics of cardiac energy metabolism, metabolic changes during HF were summarized and drugs that improve cardiac function through energy metabolism were discussed, which could provide a new research direction for the development and application of drugs in treatment of heart failure.
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Key words:
- heart failure /
- energy metabolism /
- anti-heart failure drugs
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高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势[4]。
姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。
本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。
1.2 药品与试剂
姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。
2. 方法与结果
2.1 姜黄素纳米乳的制备
姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。
2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立
2.2.1 色谱质谱条件[8]
色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。
质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。
2.2.2 方法学考察
取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。
2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究
2.3.1 给药方案
18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。
2.3.2 药动学参数计算
药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的cmax为201.48 %，片剂组的cmax为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。
表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $ ±s，n=6)原料药组 片剂组 纳米乳组 cmax (ng/ml) 116.18±11.33 121.27±12.12 234.08±17.55 Tmax (t/h) 2.00±0.00 2.00±0.00 4.00±0.00 AUC0→36(ng·h/ml) 1151.12±125.77 1341.34±103.59 2914.42±323.15 AUC0→∞(ng·h/ml) 1202.71±115.28 1348.77±131.39 3770.15±333.28 t1/2 (t/h) 6.66±0.33 7.52±0.51 12.17±0.35 MRT(t/h) 9.89±0.59 11.77±0.31 18.15±0.38 2.4 药效学研究
2.4.1 动物分组、造模及给药
取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）[9,10]。
造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。
2.4.2 统计学处理
实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（
$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。2.4.3 肝脏指数
大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。
图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。
实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。
肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；
肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。
2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片
取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。
图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。
图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平
第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。
给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。
表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） HDL-c（mmol/L） LDL-c（mmol/L） TC/HDL 空白组 1.34±0.09 2.90±0.44 0.31±0.10 1.88±0.17 9.35±0.41 模型组 2.88±0.51 12.45±0.13 1.84±0.10 3.56±0.66 6.77±1.14 阳性药组 1.41±0.25## 10.81±0.36## 3.03±0.53# 2.87±0.20## 3.57±0.47 姜黄素片剂组 1.79±0.22## 11.24±1.21 3.42±0.42# 4.08±0.32 3.29±0.89 姜黄素纳米乳低剂量组 1.29±0.20## 8.88±0.73## 2.39±0.62## 2.85±0.33# 3.72±0.57# 姜黄素纳米乳中剂量组 1.44±0.04## 7.68±0.34## 1.94±0.78## 2.57±0.82 3.96±0.36# 姜黄素纳米乳高剂量组 1.38±0.28## 8.89±0.64## 1.83±0.34## 2.85±0.67 4.86±0.49## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平
将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。
给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。
表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $ ±s，n=8）组别 TG（mmol/L） TC（mmol/L） SOD（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot） 空白组 0.42±0.16 0.11±0.03 956.31±142.64 0.47±0.06 模型组 0.69±0.05** 0.09±0.02** 769.26±141.64**## 1.98±0.26** 阳性药组 0.50±0.11*## 0.7±0.01*## 988.25±168.90## 0.64±0.15*## 姜黄素片剂组 0.66±0.10**# 0.04±0.01*## 933.99±103.39# 0.79±0.11** 姜黄素纳米乳低剂量组 0.64±0.07**## 0.06±0.02*## 972.23±142.10## 0.80±0.03**# 姜黄素纳米乳中剂量组 0.58±0.05**## 0.07±0.02**## 916.55±117.32# 0.59±0.09## 姜黄素纳米乳高剂量组 0.54±0.13## 0.10±0.03** 799.81±121.85** 0.70±0.23*## *P<0.05， **P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.001，与模型组比较 超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。
给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。
3. 讨论
姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。
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表 1 药物的已知途径、靶点和代谢途径摘要
药物类别 药物名称 已知通路或靶点 已知的代谢途径 激素 甲状腺素 LKB1/AMPK/mTOR 脂肪酸代谢 松弛素 – 脂肪酸合成、氨基酸代谢 雌激素 – 线粒体功能 合成药物 二甲双胍 PI3K-PKB/AKT、AMPK、PGC-1α 葡萄糖代谢、线粒体功能、氧化应激 SGLT2抑制剂 AMPK、 Na+/H+ 交换剂、NLRP3 炎症小体 酮代谢、线粒体功能、细胞内钠稳态、胰岛素信号传导、氧化应激 吡格列酮 PPAR γ 脂肪酸氧化，线粒体功能 辛伐他汀 iNOSitol、INCX、Rac1 线粒体功能，氧化应激 非诺贝特 PPARα 脂肪酸代谢 曲美他嗪 长链3-酮酰基辅酶A硫溶酶 葡萄糖代谢、脂肪酸代谢 卡维地洛 α1、β受体 脂肪酸代谢，线粒体功能 天然药物 白藜芦醇 SIRT1、CYP1B2 葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、线粒体功能、胰岛素信号、钙2+浓度 人参皂苷Rb1 TGF-β1/SMAD ERK、AKT 葡萄糖代谢 人参皂苷Rb3 PPARα 脂肪酸代谢，线粒体功能 阿江榄仁酸 P47phox、ERK、PPARα、TAK1、p38 MAPK、NF-κB P65 葡萄糖代谢、线粒体功能、氧化应激 黄芪甲苷 PPARα、MCAD、MCP1 脂肪酸代谢，线粒体功能 麦冬多糖 AST、 LDH、CK、CK-MB、ATPase 线粒体功能 枸杞多糖 线粒体生物基因调控因子 脂肪酸代谢，线粒体功能 黄芪多糖 TNF-α/PGC-1 脂肪酸代谢 猪毛菜酚 – 线粒体功能 和乌胺 PPAR α/PGC-1α/SIRT3 线粒体功能 川芎嗪 miR-499a、SIRT1、PI3K/AKT 线粒体功能 
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