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我国的绿茶资源十分丰富，茶多酚系指绿茶中富含的多种酚类化合物，在绿茶中含量约为15%~30%[1]，具有降低血压、调血脂、抗菌消炎、治疗放射损伤、预防骨质疏松、减肥、抗癌、抗氧衰老等广泛的药理作用[2-7]。
随着大众对天然健康产品需求日益增长，茶多酚市场展现出强劲的发展动力，茶多酚的提取工艺仍是影响茶多酚制品深加工和跨界开发利用的重要环节[8]。溶剂萃取法、超声提取法、微波提取法、生物酶提取法和超临界萃取法(SFE)等是业内常用的茶多酚提取方式[9]。传统有机溶剂萃取操作简便但存在提取得率及纯度低、溶剂残留、耗时长等缺点；超临界萃取法效率高但设备投资高因而推广性不强；酶辅助提取条件温和、环境友好，但成本较高，酶制剂易残留；超声提取法具有高效、快速的优点，常与溶剂萃取法结合，以提高茶多酚得率并提升企业经济效益，但提取时间过长会影响提取效果[9-12]；微波提取法以穿透力强、可供选择溶剂较多且用量少、产物活性优良等为优势，适用于耐热成分的提取[13-16]。常见的提取工艺优化方法有均匀试验、正交试验(OED)、响应面优化(RSM)等[17]，均匀试验适用于多因素、多水平情况但追求最大化均匀性、忽略部分正交性导致了结果的不稳定性[18-20]，正交试验具有试验量少的优点但最佳参数仅局限于已设水平的组合[21]，在更加广泛的范围内考察各因素间的交互作用并希望得到高精确度的回归方程则多采用响应面优化法[22]。
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高级绿茶，实验前置于50 ℃烘箱干燥，研磨至细粉；茶多酚标准品(含量≥98%，乐美天医药科技有限公司)。
试剂: 无水乙醇、KH2PO4、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O (分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；没食子酸(纯度≥ 98%)、四水合酒石酸钠钾（分析纯，德国Ehrenstorfer公司）。
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仪器: IS09001电子分析天平(德国Sartorius公司)；G70D20CN1P-D2(S0)微波炉(广东格兰仕有限公司)；ANPEL 2300TH超声波清洗器(上海安谱有限公司)；UV2310 紫外-可见分光光度计[天美(中国)科学仪器有限公司]；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
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⑴精密称取0.252 5 g FeSO4·7H2O、1.251 3 g 四水合酒石酸钠钾，置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水充分溶解后稀释定容，摇匀即得酒石酸亚铁溶液。
⑵精密称取2.268 2 g KH2PO4置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L Na2HPO4水溶液；精密称取23.876 0 g Na2HPO4·12H2O置于1000 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L KH2PO4水溶液。将上述磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钠水溶液以3∶17的配比混合，搅匀，即得pH=7.5的磷酸盐缓冲液[16]。
⑶精密称取没食子酸0.050 0 g于50 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.0 mg/ml的没食子酸标准溶液。
⑷精密称取茶多酚标准品0.015 0 g于10 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.5 mg/ml茶多酚标准品母液。
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没食子酸标准曲线绘制: 取25 ml棕色容量瓶，分别加入0.00、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25ml的没食子酸标准溶液，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/ml没食子酸系列标准溶液。以0.00 μg/ml没食子酸溶液作为参比溶液，测定波长为540 nm对应的吸光度，绘制没食子酸标准曲线并计算线性回归方程[23, 24]。
茶多酚标准品校正因子f测定: 精密量取茶多酚标准品母液0.50 ml于25 ml容量瓶，照上述没食子酸标准曲线绘制中的溶液配制方法，即得30.00 μg/ml茶多酚标准品溶液。测定540 nm波长对应吸光度，将此数据代入没食子酸标准曲线回归方程求算ρ没食子酸，按下列公式即可求得f。
$${f}\text=\frac{{\rho}_{\text{茶多酚标准品}}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}}\text=\frac{\text{30.00}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}} $$ -
准确称取1.0 g高级绿茶粉末于250 ml锥形瓶，以不同提取条件微波辅助提取，提取液减压抽滤并弃去茶饼，准确量取澄清提取液的体积后保存适量提取液，精密量取0.30 ml于25 ml棕色容量瓶，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得提取液样品溶液。在波长540 nm处测定吸光度，茶多酚提取得率按下列公式计算:
$$\text{茶多酚提取得率}=\frac{{nf\rho V}}{{m}{×}{\text{10}}^{{-6}}}\times {100\%} $$ 式中：n为稀释倍数；f为校正因子；ρ为没食子酸质量浓度( μg/ml)；m为茶叶质量(g)；V为提取液体积( ml) [24]。
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以提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数、料液比为4项考察因素，设计相应的5个适宜水平进行茶多酚提取(见表1)，按“1.3.3”项下方法进行吸光度测定，计算茶多酚提取得率。
表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 -
依据单因素实验数据，选定各单因素的适宜水平，使用Design Expert 12.0.3.0统计软件下Box-Behnken方法[25]，把茶多酚提取得率作为响应值，设计四个因素三种水平优化提取工艺进行响应面实验，得到各因素与响应值的二次多项回归方程及方差分析模型，预测最佳提取工艺并进行验证。
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如图1，在没食子酸0.00 ~50.00 μg/ml浓度范围内，没食子酸标准曲线方程: A=0.015 9ρ+0.003 7(r=0.999 7)，吸光度A和没食子酸浓度ρ线性关系良好。
图 1 没食子酸标准曲线
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如图2所示，固定微波输出功率、料液比、乙醇体积分数，提取时间在10~90 s范围内，随着提取时间延长，茶多酚提取得率先增大后减小，提取时间为50 s时，茶多酚提取得率最大值为24.93%。原因推测由于时间过长，茶叶中除了茶多酚的其他易溶于乙醇的成分被提取出来，导致茶多酚的醇提液饱和[26]。因此最佳提取时间为50 s。
图 2 提取时间对茶多酚提取得率的影响
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如图3所示，固定提取时间、料液比、乙醇体积分数，微波输出功率在70~630 w范围内，茶多酚提取得率随微波功率的增加先上升后小幅降低，在提取时间为350 w时，茶多酚提取得率达到24.27%，为70~630 w范围内的最大值。原因推测为微波输出功率过低无法有效破碎细胞使其释放茶多酚，过高导致茶多酚被氧化破坏[27]。因此最佳微波输出功率为350 w。同时，当微波输出功率为210 w和490 w时，茶多酚提取得率相对于其他功率下较高，提示我们考察微波输出功率影响时，其范围可适当拓宽。
图 3 微波输出功率对茶多酚提取得率的影响
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如图4所示，固定提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数的条件下，料液比在1∶20 (g/ml) ~1∶100 (g/ml)范围内，茶多酚提取得率随料液比增加先增加，后逐渐稳定，在料液比为 1∶40 (g/ml)和1∶60 (g/ml)时，茶多酚提取得率分别达到24.95%和24.96%（最大值）。原因推测为料液比过低时溶剂量不足，导致提取不完全，由于料液比过高，茶多酚已经达到了较大溶出度、其他杂质溶出部分竞争茶多酚溶出空间[28]。因此最佳料液比为1∶60 (g/ml)。
图 4 料液比对茶多酚提取得率的影响
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如图5所示，固定提取时间、微波输出功率、料液比，乙醇体积分数在0%~80%范围内，随着乙醇体积分数增加，茶多酚提取得率先增大后减小，乙醇体积分数为60%时，茶多酚提取得率最大值24.59%。因此，最佳乙醇体积分数为60%。同时，把乙醇体积分数为0%与其他水平时对应的提取得率做对比，我们可以发现乙醇提取茶多酚效率远高于纯水提取。
图 5 乙醇体积分数对茶多酚提取得率的影响
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根据单因素实验中各因素水平对茶多酚提取得率的影响结果，按照表2的响应面设计方案并进行实验，结果如表3所示。
表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80 表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49 -
把提取时间(A)、微波输出功率(B)、料液比(C)、乙醇体积分数(D)作为自变量，茶多酚提取得率(%)Y作为因变量，进行回归方程拟合和方差分析，得回归方程如下：
Y=+25.58−1.36A−0.896 2B+2.52C−1.09D−1.97AB+0.604 3AC+0.929 6AD+1.28BC+1.33BD+0.868 1CD−1.23A2−2.70B2−3.96C2−2.99D2
回归模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，r=0.967 0，结果表明优化条件下茶多酚提取得率的实际值与二次回归方程的预测值吻合良好（表4），说明该数学模型适用于高级绿茶中茶多酚提取工艺的预测。其中，A、C、D、AB、B2、C2、D2对响应值茶多酚提取得率的影响极显著(P<0.01)，B、A2对响应值茶多酚提取得率的影响显著(P<0.05)。
表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28 -
将提取时间A、微波输出功率B、料液比C、乙醇体积分数D中任意两个因素作为X1、X2，将茶多酚提取得率设为响应值Z，创建两个因素相互作用的响应平面图。3D曲线单因素方向坡度越陡即斜率越大，反映出该单因素对茶多酚提取得率的影响越具显著性； 3D曲线越陡、等高线轮廓呈椭圆形，反映两个因素交互作用对茶多酚的提取得率有更显著的影响[29-32]。结合方差分析表，各因素对茶多酚提取得率的影响如下: 料液比(C)>提取时间(A)>乙醇体积分数(D)>微波输出功率(B)。同时，图6直观显示提取时间A和微波输出功率B交互作用对茶多酚提取得率的影响极为显著，其余因素间交互作用不显著，各交互作用对茶多酚提取得率的影响如下: AB>BD>BC>AD>CD>AC。
图 6 各因素交互作用对茶多酚提取得率响应面和等高线图
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利用所得二次回归方程模型预测绿茶中茶多酚的最佳提取工艺为: 提取时间37.41 s、微波输出功率369.28 w、料液比1∶45.13 (g/ml)、乙醇体积分数55.44%，该优化条件下茶多酚预测提取得率为26.42%。从实际实验条件出发，将最佳提取条件修改为: 微波提取时间37s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，并进行三次平行重复实验验证，茶多酚平均提取得率为25.56%。
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茶多酚是绿茶中的一类多酚活性物质，本实验通过建立没食子酸标准曲线、引入校正因子测算茶多酚提取得率。从支持绿色工艺和溶剂常用性角度，本实验采用常见的食品级溶剂乙醇萃取技术取代传统的有害有机溶剂萃取技术[12]。基于响应面优化法试验次数少、周期短优势[14]，为解决前期文献中有关微波提取茶多酚的报道大多局限于单因素实验研究而缺乏优化的系统实验方案[33]、各因素水平选取范围参差不齐[13, 34]以及其他工艺优化方法低精度、预测差等问题，本实验考察了微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4个单因素对茶多酚提取得率的影响，并确定各单因素适宜范围，在此基础上采用响应面优化方法预测了最佳提取条件，考虑到实际生产所需调整茶多酚最佳提取条件，并进行三次平行重复实验验证。
实验结果表明响应面设计茶多酚提取得率实际值与理论值相差不大，证明响应面实验设计在优化茶多酚提取工艺方面具有可靠性。综上，响应面优化微波辅助茶多酚的提取工艺具有操作性强、生产周期短、生产成本较低、准确度高、稳定性强的优势，能同步考察较多因素对工艺的综合影响，为茶多酚的实际生产领域提供技术支撑，在茶多酚大规模工业化生产方面具有较大的应用潜力[35, 36]。
Optimization of microwave-assisted extraction of green tea polyphenols by response surface methodology
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摘要:
目的 优化微波辅助绿茶茶多酚的提取工艺。 方法 建立没食子酸标准曲线，通过引入校正因子测定绿茶提取液中茶多酚浓度以计算茶多酚提取得率；重点研究微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4项单因素水平对茶多酚提取得率的影响，初步确定4项单因素水平的适宜范围，并采用响应面法进一步提高绿茶茶多酚提取工艺。 结果 最佳提取工艺为：提取时间37 s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，茶多酚实际提取得率为25.65%，与理论值相差不大。 结论 响应面优化的微波辅助绿茶茶多酚提取工艺省时可行、提取得率较高。 Abstract:Objective To optimize the microwave-assisted extraction process of green tea polyphenols. Methods The extraction yield of tea polyphenols was figured up by building the standard curve of gallic acid and examining the concentration of tea polyphenols in green tea extract with the introduction of a correction factor. The effects of four single factor levels of microwave extraction time, microwave output power, liquid-to-material yield, and ethanol volume fraction on the extraction yield of tea polyphenols were primarily studied in this experiment. The response surface was applied to further optimize the extraction process of green tea polyphenols after exploring the appropriate range of four single factor levels. Results The optimal extraction process was as follows: extraction time 37 s, microwave output power 350 w, material - liquid yield 1∶45 (g/ml), ethanol volume fraction 55%, and the actual extraction yield of tea polyphenols was 25.65%, which was not much different from the theoretical value. Conclusion The microwave-assisted green tea polyphenol extraction process optimized by response surface methodology is time-saving and practicable, and the extraction yield is high. -
Key words:
- green tea /
- tea polyphenols /
- content determination /
- response surface optimization /
- extraction process
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 
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表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80
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表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49
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表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28
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[1] 陈峰, 尹鹏, 郭桂义, 等. 响应面法优化提取绿茶茶多酚工艺研究[J]. 茶叶通讯, 2020, 47(4):659-664. [2] DENG G Y, WU Y, SONG Z Y, et al. Tea polyphenol liposomes overcome gastric mucus to treat Helicobacter pylori infection and enhance the intestinal microenvironment[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2022,14(11):13001-13012. doi: 10.1021/acsami.1c23342 [3] WANG D X, WANG T T, LI Z M, et al. Green tea polyphenols upregulate the Nrf2 signaling pathway and suppress oxidative stress and inflammation markers in D-galactose-induced liver aging in mice[J]. Front Nutr,2022,9:836112. doi: 10.3389/fnut.2022.836112 [4] YE Y S, WARUSAWITHARANA H, ZHAO H Y, et al. Tea polyphenols attenuates inflammation via reducing lipopolysaccharides level and inhibiting TLR4/NF-κB pathway in obese mice[J]. Plant Foods Hum Nutr,2022,77(1):105-111. doi: 10.1007/s11130-021-00937-0 [5] 李露, 吕佳倩, 江承佳, 等. 茶多酚对心血管保护作用的研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(19):283-288. [6] 叶晴, 刘毅, 陈金鹏, 等. 绿茶化学成分及药理作用研究进展[J]. 药物评价研究, 2021, 44(12):2711-2719. [7] RAJAN L, RADHAKRISHNAN A, ALAGARSAMY K N, et al. Green tea polyphenols in cardiometabolic health: a critical appraisal on phytogenomics towards personalized green tea[J]. PharmaNutrition,2022,20:100296. doi: 10.1016/j.phanu.2022.100296 [8] 左小博, 孔俊豪, 杨秀芳, 等. “十三五”期间我国茶叶深加工科技发展报告[J]. 中国茶叶加工, 2021(3):5-11. [9] 杨新, 陈莉, 卢红梅, 等. 茶多酚提取与纯化方法及其功能活性研究进展[J]. 食品工业科技, 2019, 40(5):322-328,332. [10] 郝治华, 李颖, 张唐伟, 等. 响应曲面法优化复合酶提取林芝绿茶中茶多酚工艺[J]. 河北师范大学学报(自然科学版), 2021, 45(1):53-60. [11] 李文婷, 车振明, 罗梦莹. 超临界CO2萃取绿茶中茶多酚工艺的研究[J]. 食品工业, 2011, 32(7):22-24. [12] 左小博, 孔俊豪, 杨秀芳, 等. 茶多酚产业现状与发展展望[J]. 中国茶叶加工, 2019(4):14-20. [13] 李刚凤, 汪辉喜, 陈仕学, 等. 微波法提取低档绿茶多酚工艺研究[J]. 粮食与油脂, 2015, 28(1):60-62. [14] 李石敬敏, 许军, 高颖洁, 等. 超声-离子沉淀法提取茶多酚及茶多酚还原修饰石墨烯研究[J]. 化工技术与开发, 2018, 47(6):14-18. [15] 王凯博, 逄涛, 陶丽红, 等. 废弃茶叶中茶多酚的超声波辅助提取及纯化工艺研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学), 2016, 31(5):959-966. [16] 张龙笛. 南丰蜜桔果皮精油和果胶的分离提取研究[D]. 南昌: 江西科技师范大学, 2021. [17] 赵少甫, 韩伟. 试验设计与优化方法在中药提取中的应用[J]. 机电信息, 2016(20):38-45. [18] 孙丽娜, 杨源涛, 王雪怡, 等. 响应面优化法在药学领域的应用[J]. 科技创新与应用, 2017(23):36-37. [19] 魏佳宁, 郝昊, 常衢通, 等. 基于演化算法的约束区域均匀仿真实验设计方法[J]. 系统仿真学报, 2021, 33(7):1591-1599. [20] 杨晓丽, 徐云惠, 陈静. 应用MATLAB实现茶多酚提取均匀试验设计数据的高效拟合[J]. 昭通学院学报, 2014, 36(5):32-35. [21] 王跃生, 欧阳旭, 王丹辉, 等. 数学模式试验设计方法的优缺点比较及其在中药研究应用中的适宜性分析[J]. 中药新药与临床药理, 2010, 21(2):207-210. [22] BETTIN F, COUSSEAU F, MARTINS K, et al. Effects of pH, temperature and agitation on the decolourisation of dyes by laccase-containing enzyme preparation from Pleurotus sajor-caju[J]. Braz Arch Biol Technol,2019,62(03):e19180338-e19180359. [23] 曾光远, 王飞. 影响酒石酸铁比色法测定结果的因素[J]. 监督与选择, 2008(S1):67-69. [24] 邓祥, 韩伟. 酒石酸亚铁-标准曲线法检测绿茶提取物中茶多酚含量[J]. 南京工业大学学报(自然科学版), 2020, 42(5):677-682. [25] 张小荣, 耿广琴, 赵沙沙, 等. Box-Behnken响应面法优化红芪多糖水提醇沉工艺研究[J]. 中兽医医药杂志, 2022, 41(2):7-14. [26] SANG S M, LAMBERT J D, HO C T, et al. The chemistry and biotransformation of tea constituents[J]. Pharmacol Res,2011,64(2):87-99. doi: 10.1016/j.phrs.2011.02.007 [27] 蒋丽, 王雪梅, 全学军, 等. 不同提取方法对茶多酚理化性质的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(14):136-139. [28] DRUZYNSKA B, STEPNIEWSKA A, WOLOSIAK R. The influence of time and type of solvent on efficiency of the extraction of polyphenols from green tea and antioxidant properties obtained extracts[J]. Acta Sci Pol Technol Aliment,2007,6(1):87-99. [29] 兰林, 汪晟羽, 张晋森, 等. 响应面法优化竹叶青茶末中茶氨酸的提取工艺[J]. 茶叶通讯, 2021, 48(4):701-706,711. doi: 10.3969/j.issn.1009-525X.2021.04.017 [30] 叶文斌, 马应丽, 李娜, 等. 响应面法优化陇南黄樱桃低糖保健酱配方研究[J]. 保鲜与加工, 2021, 21(12):51-58. [31] 赵滢, 刘利娥, 韩萍, 等. 响应面法优化超声辅助提取蔓菁多糖工艺及其体外抗氧化性研究[J]. 食品工业科技, 2020, 41(7):139-145. [32] 朱莹, 陈红名, 白雅芝, 等. 响应面法优化超声辅助提取芒果多糖工艺[J]. 吉林医药学院学报, 2021, 42(2):90-93. [33] 谢小花, 戴缘缘, 陈静, 等. 微波法从绿茶中提取茶多酚的工艺研究[J]. 佳木斯大学学报(自然科学版), 2019, 37(3):443-446. [34] 徐方祥, 郑博文, 苏袁宁, 等. 微波辅助双水相提取绿茶中茶多酚的研究[J]. 食品工业科技, 2017, 38(17):188-192,201. [35] 成荣敏, 詹从红, 夏婷婷, 等. 响应面分析法及其在大学化学实验中的应用研究[J]. 化学教育(中英文), 2021, 42(2):30-33. [36] 张扬, 钱磊, 訾惠君, 等. 响应面分析法在食用菌领域的应用[J]. 中国食用菌, 2021, 40(5):1-4. -
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