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我国的绿茶资源十分丰富，茶多酚系指绿茶中富含的多种酚类化合物，在绿茶中含量约为15%~30%[1]，具有降低血压、调血脂、抗菌消炎、治疗放射损伤、预防骨质疏松、减肥、抗癌、抗氧衰老等广泛的药理作用[2-7]。
随着大众对天然健康产品需求日益增长，茶多酚市场展现出强劲的发展动力，茶多酚的提取工艺仍是影响茶多酚制品深加工和跨界开发利用的重要环节[8]。溶剂萃取法、超声提取法、微波提取法、生物酶提取法和超临界萃取法(SFE)等是业内常用的茶多酚提取方式[9]。传统有机溶剂萃取操作简便但存在提取得率及纯度低、溶剂残留、耗时长等缺点；超临界萃取法效率高但设备投资高因而推广性不强；酶辅助提取条件温和、环境友好，但成本较高，酶制剂易残留；超声提取法具有高效、快速的优点，常与溶剂萃取法结合，以提高茶多酚得率并提升企业经济效益，但提取时间过长会影响提取效果[9-12]；微波提取法以穿透力强、可供选择溶剂较多且用量少、产物活性优良等为优势，适用于耐热成分的提取[13-16]。常见的提取工艺优化方法有均匀试验、正交试验(OED)、响应面优化(RSM)等[17]，均匀试验适用于多因素、多水平情况但追求最大化均匀性、忽略部分正交性导致了结果的不稳定性[18-20]，正交试验具有试验量少的优点但最佳参数仅局限于已设水平的组合[21]，在更加广泛的范围内考察各因素间的交互作用并希望得到高精确度的回归方程则多采用响应面优化法[22]。
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高级绿茶，实验前置于50 ℃烘箱干燥，研磨至细粉；茶多酚标准品(含量≥98%，乐美天医药科技有限公司)。
试剂: 无水乙醇、KH2PO4、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O (分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；没食子酸(纯度≥ 98%)、四水合酒石酸钠钾（分析纯，德国Ehrenstorfer公司）。
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仪器: IS09001电子分析天平(德国Sartorius公司)；G70D20CN1P-D2(S0)微波炉(广东格兰仕有限公司)；ANPEL 2300TH超声波清洗器(上海安谱有限公司)；UV2310 紫外-可见分光光度计[天美(中国)科学仪器有限公司]；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
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⑴精密称取0.252 5 g FeSO4·7H2O、1.251 3 g 四水合酒石酸钠钾，置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水充分溶解后稀释定容，摇匀即得酒石酸亚铁溶液。
⑵精密称取2.268 2 g KH2PO4置于250 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L Na2HPO4水溶液；精密称取23.876 0 g Na2HPO4·12H2O置于1000 ml容量瓶中，加入适量的蒸馏水并用超声波辅助溶解，蒸馏水稀释定容，摇匀即得0.066 67 mol/L KH2PO4水溶液。将上述磷酸二氢钾水溶液和磷酸氢二钠水溶液以3∶17的配比混合，搅匀，即得pH=7.5的磷酸盐缓冲液[16]。
⑶精密称取没食子酸0.050 0 g于50 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.0 mg/ml的没食子酸标准溶液。
⑷精密称取茶多酚标准品0.015 0 g于10 ml容量瓶，加入适量的蒸馏水充分溶解后，蒸馏水稀释定容，摇匀即得1.5 mg/ml茶多酚标准品母液。
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没食子酸标准曲线绘制: 取25 ml棕色容量瓶，分别加入0.00、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25ml的没食子酸标准溶液，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/ml没食子酸系列标准溶液。以0.00 μg/ml没食子酸溶液作为参比溶液，测定波长为540 nm对应的吸光度，绘制没食子酸标准曲线并计算线性回归方程[23, 24]。
茶多酚标准品校正因子f测定: 精密量取茶多酚标准品母液0.50 ml于25 ml容量瓶，照上述没食子酸标准曲线绘制中的溶液配制方法，即得30.00 μg/ml茶多酚标准品溶液。测定540 nm波长对应吸光度，将此数据代入没食子酸标准曲线回归方程求算ρ没食子酸，按下列公式即可求得f。
$${f}\text=\frac{{\rho}_{\text{茶多酚标准品}}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}}\text=\frac{\text{30.00}}{{\rho}_{\text{没食子酸}}} $$ -
准确称取1.0 g高级绿茶粉末于250 ml锥形瓶，以不同提取条件微波辅助提取，提取液减压抽滤并弃去茶饼，准确量取澄清提取液的体积后保存适量提取液，精密量取0.30 ml于25 ml棕色容量瓶，再加入4.00 ml蒸馏水和5.00 ml酒石酸亚铁溶液，最后加入磷酸盐缓冲液稀释定容，摇匀即得提取液样品溶液。在波长540 nm处测定吸光度，茶多酚提取得率按下列公式计算:
$$\text{茶多酚提取得率}=\frac{{nf\rho V}}{{m}{×}{\text{10}}^{{-6}}}\times {100\%} $$ 式中：n为稀释倍数；f为校正因子；ρ为没食子酸质量浓度( μg/ml)；m为茶叶质量(g)；V为提取液体积( ml) [24]。
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以提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数、料液比为4项考察因素，设计相应的5个适宜水平进行茶多酚提取(见表1)，按“1.3.3”项下方法进行吸光度测定，计算茶多酚提取得率。
表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 -
依据单因素实验数据，选定各单因素的适宜水平，使用Design Expert 12.0.3.0统计软件下Box-Behnken方法[25]，把茶多酚提取得率作为响应值，设计四个因素三种水平优化提取工艺进行响应面实验，得到各因素与响应值的二次多项回归方程及方差分析模型，预测最佳提取工艺并进行验证。
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如图1，在没食子酸0.00 ~50.00 μg/ml浓度范围内，没食子酸标准曲线方程: A=0.015 9ρ+0.003 7(r=0.999 7)，吸光度A和没食子酸浓度ρ线性关系良好。
图 1 没食子酸标准曲线
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如图2所示，固定微波输出功率、料液比、乙醇体积分数，提取时间在10~90 s范围内，随着提取时间延长，茶多酚提取得率先增大后减小，提取时间为50 s时，茶多酚提取得率最大值为24.93%。原因推测由于时间过长，茶叶中除了茶多酚的其他易溶于乙醇的成分被提取出来，导致茶多酚的醇提液饱和[26]。因此最佳提取时间为50 s。
图 2 提取时间对茶多酚提取得率的影响
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如图3所示，固定提取时间、料液比、乙醇体积分数，微波输出功率在70~630 w范围内，茶多酚提取得率随微波功率的增加先上升后小幅降低，在提取时间为350 w时，茶多酚提取得率达到24.27%，为70~630 w范围内的最大值。原因推测为微波输出功率过低无法有效破碎细胞使其释放茶多酚，过高导致茶多酚被氧化破坏[27]。因此最佳微波输出功率为350 w。同时，当微波输出功率为210 w和490 w时，茶多酚提取得率相对于其他功率下较高，提示我们考察微波输出功率影响时，其范围可适当拓宽。
图 3 微波输出功率对茶多酚提取得率的影响
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如图4所示，固定提取时间、微波输出功率、乙醇体积分数的条件下，料液比在1∶20 (g/ml) ~1∶100 (g/ml)范围内，茶多酚提取得率随料液比增加先增加，后逐渐稳定，在料液比为 1∶40 (g/ml)和1∶60 (g/ml)时，茶多酚提取得率分别达到24.95%和24.96%（最大值）。原因推测为料液比过低时溶剂量不足，导致提取不完全，由于料液比过高，茶多酚已经达到了较大溶出度、其他杂质溶出部分竞争茶多酚溶出空间[28]。因此最佳料液比为1∶60 (g/ml)。
图 4 料液比对茶多酚提取得率的影响
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如图5所示，固定提取时间、微波输出功率、料液比，乙醇体积分数在0%~80%范围内，随着乙醇体积分数增加，茶多酚提取得率先增大后减小，乙醇体积分数为60%时，茶多酚提取得率最大值24.59%。因此，最佳乙醇体积分数为60%。同时，把乙醇体积分数为0%与其他水平时对应的提取得率做对比，我们可以发现乙醇提取茶多酚效率远高于纯水提取。
图 5 乙醇体积分数对茶多酚提取得率的影响
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根据单因素实验中各因素水平对茶多酚提取得率的影响结果，按照表2的响应面设计方案并进行实验，结果如表3所示。
表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80 表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49 -
把提取时间(A)、微波输出功率(B)、料液比(C)、乙醇体积分数(D)作为自变量，茶多酚提取得率(%)Y作为因变量，进行回归方程拟合和方差分析，得回归方程如下：
Y=+25.58−1.36A−0.896 2B+2.52C−1.09D−1.97AB+0.604 3AC+0.929 6AD+1.28BC+1.33BD+0.868 1CD−1.23A2−2.70B2−3.96C2−2.99D2
回归模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，r=0.967 0，结果表明优化条件下茶多酚提取得率的实际值与二次回归方程的预测值吻合良好（表4），说明该数学模型适用于高级绿茶中茶多酚提取工艺的预测。其中，A、C、D、AB、B2、C2、D2对响应值茶多酚提取得率的影响极显著(P<0.01)，B、A2对响应值茶多酚提取得率的影响显著(P<0.05)。
表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28 -
将提取时间A、微波输出功率B、料液比C、乙醇体积分数D中任意两个因素作为X1、X2，将茶多酚提取得率设为响应值Z，创建两个因素相互作用的响应平面图。3D曲线单因素方向坡度越陡即斜率越大，反映出该单因素对茶多酚提取得率的影响越具显著性； 3D曲线越陡、等高线轮廓呈椭圆形，反映两个因素交互作用对茶多酚的提取得率有更显著的影响[29-32]。结合方差分析表，各因素对茶多酚提取得率的影响如下: 料液比(C)>提取时间(A)>乙醇体积分数(D)>微波输出功率(B)。同时，图6直观显示提取时间A和微波输出功率B交互作用对茶多酚提取得率的影响极为显著，其余因素间交互作用不显著，各交互作用对茶多酚提取得率的影响如下: AB>BD>BC>AD>CD>AC。
图 6 各因素交互作用对茶多酚提取得率响应面和等高线图
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利用所得二次回归方程模型预测绿茶中茶多酚的最佳提取工艺为: 提取时间37.41 s、微波输出功率369.28 w、料液比1∶45.13 (g/ml)、乙醇体积分数55.44%，该优化条件下茶多酚预测提取得率为26.42%。从实际实验条件出发，将最佳提取条件修改为: 微波提取时间37s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，并进行三次平行重复实验验证，茶多酚平均提取得率为25.56%。
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茶多酚是绿茶中的一类多酚活性物质，本实验通过建立没食子酸标准曲线、引入校正因子测算茶多酚提取得率。从支持绿色工艺和溶剂常用性角度，本实验采用常见的食品级溶剂乙醇萃取技术取代传统的有害有机溶剂萃取技术[12]。基于响应面优化法试验次数少、周期短优势[14]，为解决前期文献中有关微波提取茶多酚的报道大多局限于单因素实验研究而缺乏优化的系统实验方案[33]、各因素水平选取范围参差不齐[13, 34]以及其他工艺优化方法低精度、预测差等问题，本实验考察了微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4个单因素对茶多酚提取得率的影响，并确定各单因素适宜范围，在此基础上采用响应面优化方法预测了最佳提取条件，考虑到实际生产所需调整茶多酚最佳提取条件，并进行三次平行重复实验验证。
实验结果表明响应面设计茶多酚提取得率实际值与理论值相差不大，证明响应面实验设计在优化茶多酚提取工艺方面具有可靠性。综上，响应面优化微波辅助茶多酚的提取工艺具有操作性强、生产周期短、生产成本较低、准确度高、稳定性强的优势，能同步考察较多因素对工艺的综合影响，为茶多酚的实际生产领域提供技术支撑，在茶多酚大规模工业化生产方面具有较大的应用潜力[35, 36]。
Optimization of microwave-assisted extraction of green tea polyphenols by response surface methodology
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摘要:
目的 优化微波辅助绿茶茶多酚的提取工艺。 方法 建立没食子酸标准曲线，通过引入校正因子测定绿茶提取液中茶多酚浓度以计算茶多酚提取得率；重点研究微波提取时间、微波输出功率、料液比、乙醇体积分数4项单因素水平对茶多酚提取得率的影响，初步确定4项单因素水平的适宜范围，并采用响应面法进一步提高绿茶茶多酚提取工艺。 结果 最佳提取工艺为：提取时间37 s、微波输出功率350 w、料液比1∶45 (g/ml)、乙醇体积分数55%，茶多酚实际提取得率为25.65%，与理论值相差不大。 结论 响应面优化的微波辅助绿茶茶多酚提取工艺省时可行、提取得率较高。 Abstract:Objective To optimize the microwave-assisted extraction process of green tea polyphenols. Methods The extraction yield of tea polyphenols was figured up by building the standard curve of gallic acid and examining the concentration of tea polyphenols in green tea extract with the introduction of a correction factor. The effects of four single factor levels of microwave extraction time, microwave output power, liquid-to-material yield, and ethanol volume fraction on the extraction yield of tea polyphenols were primarily studied in this experiment. The response surface was applied to further optimize the extraction process of green tea polyphenols after exploring the appropriate range of four single factor levels. Results The optimal extraction process was as follows: extraction time 37 s, microwave output power 350 w, material - liquid yield 1∶45 (g/ml), ethanol volume fraction 55%, and the actual extraction yield of tea polyphenols was 25.65%, which was not much different from the theoretical value. Conclusion The microwave-assisted green tea polyphenol extraction process optimized by response surface methodology is time-saving and practicable, and the extraction yield is high. -
Key words:
- green tea /
- tea polyphenols /
- content determination /
- response surface optimization /
- extraction process
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 单因素实验条件
因素 水平 提取条件 提取时间(t/s) 10 30 50 70 90 350 w，60% 乙醇，料液比1:60 微波输出功率(w) 70 210 350 490 630 50 s，60% 乙醇，料液比1:60 料液比(g/ml) 1∶20 1∶40 1∶60 1∶80 1∶100 50 s，350 w，60% 乙醇 乙醇体积分数(%) 0 20 40 60 80 50 s，350 w，料液比1:60 
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表 2 响应面设计各因素及水平
因素 编号 水平 −1 0 1 提取时间(t/s) A 30 60 90 微波输出功率(w) B 70 350 630 料液比(g/ml) C 1∶20 1∶40 1∶60 乙醇体积分数(%) D 40 60 80
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表 3 响应面实验条件及结果
序号 A B C D 提取得率(%) 1 0 1 1 0 21.24 2 0 1 −1 0 15.86 3 0 0 −1 1 12.67 4 0 1 0 −1 19.55 5 0 0 1 −1 21.63 6 1 0 0 1 20.58 7 1 0 −1 0 16.50 8 1 0 0 −1 20.61 9 0 −1 −1 0 19.76 10 −1 0 0 −1 24.61 11 −1 0 1 0 23.69 12 0 −1 0 −1 23.53 13 0 0 0 0 25.61 14 0 0 0 0 25.52 15 0 0 0 0 24.22 16 1 0 1 0 23.04 17 0 −1 1 0 20.01 18 1 −1 0 0 22.29 19 0 0 0 0 25.67 20 −1 1 0 0 23.71 21 −1 0 0 1 20.85 22 0 −1 0 1 18.21 23 −1 0 −1 0 19.57 24 0 0 0 0 26.86 25 0 1 0 1 19.55 26 0 0 1 1 21.40 27 0 0 −1 −1 16.37 28 1 1 0 0 15.62 29 −1 −1 0 0 22.49
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表 4 回归方程模型显著性分析表
分析项 平方和 自由度 均方 F值 P值 回归模型 321.40 14 22.31 14.41 <0.0001 A 22.10 1 22.10 14.28 0.0020 B 9.64 1 9.64 6.23 0.0257 C 76.35 1 76.35 49.32 <0.0001 D 14.14 1 14.14 9.14 0.0091 AB 15.57 1 15.57 10.06 0.0068 AC 1.46 1 1.46 0.9436 0.3478 AD 3.46 1 3.46 2.23 0.1573 BC 6.60 1 6.60 4.26 0.0580 BD 7.09 1 7.09 4.58 0.0504 CD 3.01 1 3.01 1.95 0.1846 A2 9.83 1 9.83 6.35 0.0245 B2 47.31 1 47.31 30.56 <0.0001 C2 101.70 1 101.70 65.70 <0.0001 D2 57.82 1 57.82 37.35 <0.0001 残差 21.67 14 1.55 失拟项 18.18 10 2.08 0.2497 净误差 3.49 4 总差 334.08 28
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