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舒肝宁注射液是在中国传统医学经典方剂——张仲景《伤寒杂病论》“茵陈蒿汤”基础上进一步研发的纯中药注射剂，由茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝等五味中药材的提取物组合而成，在临床上主要用于治疗急慢性病毒性肝炎、药物性肝炎、胆汁淤积性肝炎等肝脏疾病[1-2]。舒肝宁注射液所含中药种类繁多，化学成分复杂，其改善肝炎的有效成分及相应的作用机制尚不清楚，因此，研究舒肝宁注射液的有效活性成分、作用靶点及其抗炎保肝的作用机制具有重要的科学意义。
中药复方活性成分不明是中药复方药效物质基础研究的瓶颈之一，网络药理学通过将化学成分映射到疾病基因网络中来寻找潜在的生物活性成分，为筛选中药活性成分提供了一种方法。同时以中药成分、靶点和疾病等数据相关信息为基础，构建生物网络，通过网络分析阐释中药的作用机制，对中药复方在临床应用具有重要的意义。
本研究通过检索TCMSP数据库以及相关文献收集舒肝宁注射液的活性成分信息，并在此基础上利用药物靶点分析平台STITCH预测舒肝宁注射液可能的作用靶点，采用Cytoscape构建舒肝宁注射液抗肝炎作用的“活性成分-作用靶点”网络，对这些靶点进行蛋白-蛋白相互作用分析，利用DAVID数据库进行基因功能和信号通路分析，探讨舒肝宁注射液抗炎保肝作用可能的作用机制。
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通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以及相关文献，分别收集舒肝宁注射液中茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝的主要的化学成分，建立舒肝宁注射液化学成分数据库。在此基础上，考察化学成分生物利用度（OB>30%）、药物相似性（DL>0.18）[3]、化合物含量以及相关生物功能，通过文献筛选舒肝宁注射液中有效的活性成分。
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主要通过化合物与蛋白互作数据库（STITCH）进行分析，将活性成分输入，选择“人类”物种进行搜索。将搜索得到靶点结果以TSV格式进行保存，筛选结合得分大于0.7的靶点。以“hepatitis”作为疾病关键词，搜寻GeneCards数据库与OMIM数据库中与肝炎相关的靶点。将舒肝宁注射液活性成分作用靶点与肝炎相关疾病靶点取交集，靶点名称以靶点基因名称为准，用于后续靶点网络的构建、蛋白相互作用网络构建、基因功能和信号通路分析等工作。
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根据舒肝宁注射液中主要有效成分作用的肝炎相关靶点，建立活性成分-肝炎作用靶点之间的相互对应关系。将活性成分和肝炎靶点作为网络中的节点，两者之间的相互作用作为网络中的连接，导入Cytoscape 3.8.2软件中构建舒肝宁注射液“活性成分-作用靶点”网络。并应用内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度、介度、及紧密度等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。
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蛋白质相互作用数据库（String）是一种包含已知和预测的蛋白质−蛋白质相互作用的数据库, 其中收集了大量的蛋白质相互作用关系。将舒肝宁注射液与肝炎相关的靶点导入String数据库，获取蛋白间的相互作用关系，将结果保存成TSV格式，保留文件中节点1、节点2和结合得分信息，导入Cytoscape 3.8.2软件中绘制相互作用网络，并对网络进行分析，保存结果。使用Cytoscape 3.8.2软件设置节点大小和颜色反映度(Degree)值的大小，边的粗细用于反映结合得分的大小，获得舒肝宁注射液作用靶点蛋白-蛋白相互作用网络图。
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生物学信息注释数据库（DAVID）为基因和蛋白提供系统综合的生物功能注释信息，可以对差异基因进行功能和通路富集分析。将舒肝宁注射液作用与肝炎相关的蛋白靶点导入DAVID数据库，选择标识符为标准的基因名称，列表类型设置为基因列表，限定物种为人，对舒肝宁注射液作用靶点进行KEGG通路分析，阈值设置为P<0.01保存结果，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选排名靠前的信号通路，采用GraphPad Prism 5.0软件绘图。GO富集分析是指在某一功能层次上统计蛋白或者基因的数目组成的一个有向无环图，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）3个分支。使用Cytoscape 3.8.2软件中的插件对舒肝宁注射液中活性成分作用靶点进行GO分析，阈值设置为P<0.05，筛选靠前的条目，采用GraphPad Prism 5.0软件绘图。
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通过搜索中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP，从茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝中分别收集到53、98、87、169、242个主要的化学成分。对收集到的化学成分，以生物利用度>30%、药物相似性>0.18以及相关文献参考作为筛选标准，获得30个活性成分，黄芩10个、栀子8个、板蓝根7个、茵陈3个、灵芝2个。黄芩含有刺槐黄素、黄芩素、β-谷甾醇、黄连碱、千层纸素A、谷甾醇、黄芩黄酮I、豆甾醇、角鲨烯、汉黄芩素；栀子含有异欧前胡素、β-谷甾醇、藏红花酸、欧前胡素、山奈酚、槲皮素、豆甾醇、角鲨烯；板蓝根含有刺槐黄素、β-谷甾醇、半齿泽兰素、高车前素、甜橙黄酮、谷甾醇、豆甾醇；茵陈含有谷甾醇、芫花素和槲皮素；灵芝含有β-谷甾醇、过氧麦角甾醇。删除重复活性成分后，共得到活性成分20个。
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通过STITCH软件进行分析，预测舒肝宁注射液中20个活性成分的靶点，预测得到87个蛋白靶点。再通过GeneCards和OMIM数据库中与肝炎有关的基因进行比对，取交集得到83个与肝炎相关的靶点。其中肝炎相关性得分大于10分并且经文献证实的基因有15个，分别为：肿瘤蛋白P53（TP53）、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-6（IL-6）、载脂蛋白E（APOE ）、ATP 结合盒亚家族B成员11（ABCB11）、半胱氨酸蛋白酶-8（CASP8）、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1（SLCO1B1）、细胞色素 P450 2D6（CYP2D6）、UDP-葡萄糖醛酸转移酶 1A7（UGT1A7）、细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、UDP-葡萄糖醛酸转移酶 1A3（UGT1A3）、细胞色素 P450 1A2（CYP1A2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）。
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使用Cytoscape构建“活性成分-肝炎作用靶点”网络见图1。网络分析结果显示，度值排名靠前的活性成分有 ：刺槐黄素、谷甾醇、黄芩素、木蝴蝶素、汉黄芩素、槲皮素、山奈酚、角鲨烯，度值都为10。提示以上活性成分为舒肝宁注射液抗肝炎的主要活性成分。度值排名靠前的肝炎靶点有：CYP1B1、CYP1A2、CYP1A1、CASP3，度值分别为8、5、5、4；EGFA、NR1I2、ICAM1、PARP1 、CYP2D6、CYP3A4，度值都为2。图中可以看到刺槐黄素、甜橙黄酮、黄芩素、芫花素、异欧前胡素可共同作用于靶点CYP1A2；β-谷甾醇、谷甾醇、黄芩黄酮 I可共同作用于靶点CASP3；刺槐黄素、高车前素、可同时作用于靶点VEGFA，汉黄芩素、槲皮素可共同作用于MCL1，而豆甾醇可同时作用于ABCA1、ABCG8、ABCG5、SLCO1B1、TNF、IL-8、IL-10。同一靶点可对应不同的活性成分，不同靶点也可以对应相同的活性成分，充分体现了舒肝宁注射液多成分、多靶点的作用特点。
图 1 舒肝宁注射液的“活性成分-作用靶点”网络图
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将蛋白靶点导入STRING 数据库获取蛋白间的相互作用关系，构建的蛋白质相互关系网络详见图2。网络分析结果显示度值排名靠前的靶点有：TNF、TP53、IL-6、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、MAPK3、CXCL8、IL-10，度值分别为33、32、31、23、23、23、22、22、20、19。度值大的靶点提示在网络调控中起着关键作用，度值大的靶点很可能是舒肝宁注射液治疗肝炎的关键靶点。
图 2 舒肝宁注射液靶点蛋白相互作用网络
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GO富集分析的结果详见图3～图5。其中BP (图3)分析中排名靠前的生物过程依次为细胞过程、生物过程的调控、对化学刺激的反应、对应激的反应、细胞代谢过程调控、生物质量调控、基础代谢过程调控、大分子代谢过程的调控、细胞对刺激的反应、信号处理。CC分析（图4）中排名靠前的细胞组分依次为细胞质、膜结合细胞器、细胞质部分、细胞器部分、细胞内细胞器部分、不溶性组分、细胞器腔、膜封闭腔、细胞器膜、细胞内细胞器腔。 MF分析（图5）中排名靠前的分子功能依次为蛋白结合、催化活性、过度金属离子结合、核苷酸结合、转移酶活性、受体结合、腺苷酸结合、嘌呤核苷结合、核苷结合、嘌呤核苷酸结合。
图 3 舒肝宁注射液主要活性成分潜在作用靶点GO富集分析的生物过程结果
图 5 舒肝宁注射液主要活性成分潜在作用靶点GO富集分析的分子功能结果
图 4 舒肝宁注射液主要活性成分潜在作用靶点GO富集分析的细胞组分结果
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KEGG通路分析结果如图6所示，排名靠前的是TNF (15个靶点) 、IL-17（14个靶点）、MAPK（14个靶点）等信号通路。
图 6 舒肝宁注射液主要活性成分潜在作用靶点KEGG富集分析的通路结果
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舒肝宁注射液是茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝等五味中药材的提取物组合而成的一种纯中药注射剂，在临床上被广泛用于治疗急慢性病毒性肝炎、药物性肝炎、胆汁淤积性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭等肝脏疾病。研究发现舒肝宁注射液对于肝炎患者治疗效果显著，且不良反应较少，安全有效性高[4]，但其抗肝炎保肝的作用机制尚不清楚。
本研究中，通过检索TCMSP获得舒肝宁注射液中的活性成分，根据ADME值对活性成分进行筛选，绘制“活性成分-靶点”网络图，并经过网络分析获得度值排名靠前的活性成分，作为可能为舒肝宁注射中发挥抗炎作用的主要活性成分，结果显示其主要有刺槐黄素、谷甾醇、黄芩素、木蝴蝶素、汉黄芩素、槲皮素、山奈酚、角鲨烯。研究发现，黄芩中的黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A可以分别作用NF-κB信号通路的不同阶段发挥抗炎作用[5]；栀子中的异欧前胡素，可以通过下调肝纤维化指标，抑制炎症因子的释放，改善肝纤维化的进程[6]；山奈酚具有良好的抗炎镇痛作用[7]并且可以通过抑制CHOP分子改善内质网应激诱导的肝细胞损伤[8]；槲皮素能通过调控PI3K/AKT/NF-κB信号通路来改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织脂肪变性程度,减轻肝脏炎症[9]；板蓝根中的豆甾醇能明显抑制LPS诱导的环氧合酶-2、诱导型一氧化氮合酶mRNA和蛋白水平的提高，抑制前列腺素E2和一氧化氮的释放从而实现其抗炎作用[10]；茵陈中的芫花素具一定的清除自由基、抗炎、抑制肿瘤的作用[11]。舒肝宁注射液可能通过以上活性成分发挥其抗肝炎保肝作用。
本研究发现，舒肝宁注射液活性成分作用于83个肝炎靶点，成分靶点网络显示了舒肝宁注射液多成分、多靶点的抗炎保肝作用特点（图1）。蛋白作用网络显示了舒肝宁注射液靶蛋白间存在着相互关系（图2）。靶点的GO分析结果表明，舒肝宁注射液抗炎保肝作用涉及细胞、生物过程的调控、对化学刺激的反应、对应激的反应等过程的调控，涉及细胞质、膜结合细胞器、细胞内细胞器等细胞组分，以及蛋白结合、催化活性、过度金属离子结合、核苷酸结合、转移酶活性等分子功能，是一个复杂的过程（图3~图5）。靶点KEGG通路分析结果显示，舒肝宁注射液抗炎保肝的的靶点主要涉及TNF、IL-17、MAPK等信号通路（图6）。
舒肝宁注射液作用的肝炎靶点中， PPI 网络分析结果和“活性成分-靶点”网络分析结果中度值排名前十、肝炎相关性得分大于10分并且有文献证实的基因共有8个分别为：CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、IL-10、IL-6、TNF、TP53、VEGFA，提示以上靶点可能为舒肝宁注射液抗肝炎的主要靶点。TP53是一个抑癌基因，编码的蛋白质对各种细胞应激作出反应，以调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢变化。TP53突变与乙型肝炎相关的肝细胞癌密切相关[12]。也有研究发现TP53突变与肝细胞癌的免疫微环境失调有关，会导致肝细胞癌免疫应答下调[13]。IL-10编码的蛋白质是一种细胞因子，主要由单核细胞产生，少部分由淋巴细胞产生。该细胞因子在免疫调节和炎症中具有多效作用，被认为在乙型肝炎病毒感染的免疫学中起重要作用[14]。IL-6编码的细胞因子在炎症和B细胞成熟中起作用。该蛋白质主要在急性和慢性炎症的部位产生，在那里它被分泌到血清中，并通过IL-6受体α诱导转录炎症反应，其中包括经典的NF-κB信号通路，通过控制一系列生长因子和细胞因子的表达在肝脏炎症反应中起着至关重要的作用[15]。CYP1A2、CYP3A4 和CYP2D6基因编码的蛋白质属于细胞色素P450超家族酶的成员，可催化药物代谢、合成胆固醇、类固醇和其他脂类的许多反应。这类蛋白质定位于内质网，可代谢多达25%的常用处方药。有研究发现自身免疫性肝炎患者中，CYP2D6可作为LKM-1的主要靶自身抗原，在肝细胞质膜上异常表达，引发自身免疫性反应[16]。CYP1A2 则被发现其基因多态性在吸烟者和 HBsAg血清阴性个体中是与肝细胞癌易感性相关的[17]。VEGFA是PDGF/VEGF生长因子家族的成员，它编码一种肝素结合蛋白，以二硫键连接的同源二聚体形式存在。丙型肝炎病毒感染的主要并发症是诱发肝纤维化。有文献报道VEGFA的mRNA和蛋白质表达水平与丙型肝炎病毒相关肝纤维化进展之间相关，并且丙型肝炎病毒患者的VEGFA在mRNA和蛋白质的表达明显高于对照组，而且晚期肝纤维化阶段的患者表现出最高的VEGFA mRNA和蛋白质水平[18]。舒肝宁注射液的活性成分可能通过对以上靶点相互作用，实现其抗肝炎保肝的作用机制。
舒肝宁注射液筛选得到的肝炎靶点所富集的通路中，肿瘤坏死因子（TNF）通路参与多种生物过程的调节，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血过程。研究显示TNF通路相关基因的变异与乙型肝炎病毒的清除有关[19]，TNF-α/JNK信号通路也与孟鲁司特改善刀豆素A诱导的小鼠自身免疫性肝炎的作用相关[20]。IL-17介导的信号通路与自身免疫性肝病的治疗相关，通过影响组织微环境可促进肝脏炎症和自身免疫[21]。女性失代偿性急性乙型肝炎患者中，IFN-γ和IL-4下调的伴有增强的肝IL-17阳性细胞增多可以加速破坏性免疫，以增强病毒清除。靶向涉及IL-17的通路的治疗可预防肝移植或失代偿性急性乙型肝炎患者的死亡[22]。MAPK8、MAPK3编码的蛋白质是 MAP 激酶家族的成员，MAP激酶，也称为细胞外信号调节激酶，在信号级联反应中起作用，该级联调节响应各种细胞外信号的各种细胞过程，例如增殖、分化和细胞周期进程。有文献研究了宿主遗传因素在乙肝疫苗抗乙型肝炎病毒感染长期免疫中的作用，发现MAPK8的变异影响了宿主anti-HBs的峰值水平[23]。并且有研究发现micro RNA-155通过MAPK信号通路，通过靶向SOCS1，调节酒精性肝炎大鼠的肝星状细胞的增殖、凋亡和细胞周期进展[24]。舒肝宁注射液活性成分可能作用于以上靶点及信号通路实现其抗炎保肝作用。
综上所述，网络药理学分析显示舒肝宁注射液的20种活性成分作用于83个蛋白靶点，其中刺槐黄素、谷甾醇、黄芩素、木蝴蝶素、汉黄芩素、槲皮素、山奈酚、角鲨烯为舒肝宁注射液治疗肝炎的主要活性成分，CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、IL-10、IL-6、TNF、TP53、VEGFA为舒肝宁注射液治疗肝炎的主要靶点，舒肝宁注射液可能通过以上活性成分和蛋白靶点相互作用，实现其抗肝癌作用，并通过TNF、IL-17、MAPK等信号通路改善肝炎患者症状。本研究表明舒肝宁注射液作用机制涉及多种过程、分子和通路，体现了舒肝宁注射液多成分-多靶点-多途径的作用特点。本研究为舒肝宁注射液抗炎保肝作用分子机制的进一步研究提供了思路和方法。
Study on the mechanism of anti-inflammatory and hepatoprotective effects of Shuganning injection based on network pharmacology
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摘要:
目的 构建舒肝宁注射液活性成分-作用靶点和蛋白相互作用网络，探讨舒肝宁注射液抗炎保肝作用机制。 方法 通过TCMSP数据库获取舒肝宁注射液中茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝的主要活性成分；利用GeneCard和OMIM数据库筛选舒肝宁注射液活性成分对应靶点中与肝炎相关靶点；采用Cytoscape构建活性成分-作用靶点网络；应用String数据库和Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络；通过DAVID数据库对靶点进行GO及KEGG通路分析。 结果 筛选得到舒肝宁注射液活性成分20个，共83个作用靶点。GO分析表明，舒肝宁注射液主要影响细胞过程和生物过程的调控，以及对化学刺激和应激的反应等作用。KEGG通路分析显示，舒肝宁注射液抗炎保肝作用的靶点主要涉及TNF、IL-17、MAPK等信号通路。 结论 舒肝宁注射液的抗炎保肝作用具有多成分、多靶点、多通路的特点，可能通过调节TNF、IL-17、MAPK等通路发挥作用。 Abstract:Objective To explore the anti-inflammatory and hepatoprotective mechanism of Shuganning injection through establishing the active ingredients-targets network and protein interactions network. Methods The main active ingredients of Artemisiae scopariae, Fructus gardenia, Radix scutellariae, Radix isatidis and Ganoderma in Shuganning injection were obtained by TCMSP; GeneCards and OMIM were used to screen the hepatitis-related targets among the corresponding targets of the active ingredient of Shuganning injection; The Cytoscape software was used to construct the active ingredient-targets network of Shuganning injection. The protein interactions network was constructed using the String database and Cytoscape software. The GO and KEGG pathways involved in the targets were analyzed by DAVID database. Results The results showed that 20 active ingredients and 83 targets of Shuganning injection were involved. GO analysis showed that Shuganning injection mainly affected the regulation of cellular processes and biological processes, as well as the response to chemical stimulation and stress. KEGG pathway analysis showed that the targets of the anti-inflammatory and hepatoprotective effect of Shuganning injection mainly involved in signaling pathways such as TNF, IL-17, and MAPK. Conclusion The anti-inflammatory and hepatoprotective effect of Shuganning injection have the characteristics of multiple components, multiple targets and multiple pathways, which may play a role by regulating pathways such as TNF、IL-17 and MAPK . -
随着我国经济的发展以及居民生活水平的提高，越来越多的人来到高原生活、工作和旅游，但由于高原地区氧分压较低，高原病的发病率呈现逐年上升的趋势[1]。高原脑水肿（HACE）是高原病发生发展过程中最为严重的阶段，其临床表现为头痛、协调丧失、虚弱、意识水平降低[2]，并对机体造成不可逆的损伤。7-羟乙基白杨素（7-hydroxyethyl chrysin，7-HEC）是课题组前期筛选发现并合成的具有自主知识产权的抗高原缺氧化合物[3]，研究发现[4-5]，其对脑缺血再灌注大鼠和模拟高原低压性缺氧致脑组织损伤大鼠均具有明显的保护作用，并能够减轻低压低氧诱导的认知功能损伤[6]，在抗高原缺氧方面表现出优异的活性与前景。因此，本文主要从7-HEC对高原脑水肿的可能作用机制出发，探究其与自噬、周期、凋亡等通路之间的关系，为防治高原脑水肿的可能作用机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂与仪器
27只SPF级雄性Wistar大鼠（体重180～200 g），购自联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，合格证号：SCXX（军）2012-0029，动物伦理委员会编号：2021KYLL173。
7-HEC由实验室景林临副教授自行合成；MDA、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CDK2、CDK6、CyclinD1、CyclinE2、PARP、Bax、Bcl-2、P62、LC3B抗体（英国Abcom公司）；BCA蛋白试剂盒（Solarbio公司）；脱脂奶粉（美国BD公司）；Western Bright TM ECL（美国Advansta）。
IEC-Micromax高速离心机（美国ThermoElectron公司）；Tissuelyser快速研磨仪（上海净信科技公司）；BP210S电子天平（赛多利斯有限公司）；HP-8453紫外分光光度计（美国惠普公司）；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱（中航贵州风雷航空军械有限责任公司）。
1.2 动物分组及高原脑水肿模型的建立[7]
将27只SPF级雄性Wistar大鼠适应性饲喂3 d后，随机分为3组，正常对照组、缺氧模型组、7-HEC给药组。给药组连续灌胃7-HEC（350 mg/kg）7 d，对照组和模型组给予等量灭菌注射用水。第四天，模型组和给药组放入大型低压低氧动物实验舱中，以10 m/s速度减压上升至相当于海拔6000 m处，缺氧处理3 d后处死，取脑组织。缺氧处理期间，氧舱温度：8:00～20:00，12 ℃，20:00～次日8:00，2 ℃；动物自由摄食及饮水；给药组继续灌胃给药。
1.3 脑组织氧化应激指标的检测
每组分别取6只大鼠脑组织标本，准确称重后，按质量（g）∶体积（ml）=1∶9 加入生理盐水制成10 %组织匀浆，采用WST-1法检测SOD活性、采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，以上操作均按试剂盒说明书进行。
1.4 蛋白质印迹法测定凋亡、周期、自噬相关蛋白的表达
每组选取3只大鼠脑组织，称重后加入9倍量高效裂解液，使用组织研磨仪进行组织匀浆，于冰上裂解30 min，低温离心后吸取上清匀浆液10 μl，BCA法测蛋白含量，剩余上清与4×上样缓冲液按体积3∶1比例混匀，封口膜封口，95 ℃煮沸10 min进行蛋白变性，取等量蛋白样品上样，采用 SDS-PAGE 进行分离，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜上，含5 %脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次10 min。配制ECL发光液，按照A液和B液1∶1进行配制，涂抹发光液，放入ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。
1.5 统计学分析
实验结果以（
$ \bar x \pm s $ ）表示，采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，选用单因素方差分析法进行组间变量分析，LSD-t 法比较组间差异。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。2. 结果
2.1 氧化应激相关指标的测定
大鼠脑组织中氧化应激相关指标MDA与SOD的测定结果如图1所示，与对照组相比，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量显著性升高，SOD活力显著性下调（P<0.05），当给予7-HEC时，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量下调，SOD活力上调，且差异具有统计学意义（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与机体氧化应激的调节，起到防护高原脑水肿的效果。
2.2 凋亡相关蛋白的表达
如图2所示，大鼠脑组织中PARP与Bcl-2的蛋白表达在缺氧组下调，给药后显著上调（P<0.01），大鼠脑组织中Bax的蛋白表达在缺氧组上调，给药组显著下调（P<0.01），为进一步探讨Bcl-2与Bax对凋亡的易感性，对Bax/Bcl-2的比例进行比较，结果显示，与对照组相比，缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞凋亡从而防治高原脑水肿。
图 2 大鼠脑组织中凋亡相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.3 周期相关蛋白的表达
如图3所示，与对照组相比，大鼠脑组织中周期相关蛋白CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2的表达在缺氧组均下调（P<0.05）；与缺氧组相比，在给药组中，CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2蛋白的表达显著上调（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与细胞周期调控从而防治高原脑水肿。
图 3 大鼠脑组织中周期相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.4 自噬相关蛋白的表达
如图4所示，大鼠脑组织中P62的蛋白表达在缺氧组极显著上调，给药后显著下调（P<0.01）；与对照组相比，大鼠脑组织中LC3-B的蛋白表达在缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞自噬过程从而防治高原脑水肿。
图 4 大鼠脑组织中自噬相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较； **P<0.01，与模型组比较3. 讨论
氧化应激是一种有害事件，可导致活性氧大量产生或抗氧化防御功能不足，损害神经血管单元的完整性，造成神经元不可逆死亡，进而血脑屏障破坏形成脑水肿[8]。MDA是脂质过氧化的产物，其含量可以间接反映组织氧化应激的水平，SODs是一类具有催化超氧化物生成过氧化氢的抗氧化酶[9]，可以直接或间接地反映氧化应激的水平。本研究发现，经给药干预后，大鼠脑组织MDA含量显著降低，SOD活力显著提高，表明7-HEC可改善脑水肿大鼠的氧化损伤，从而对脑水肿起到一定的预防作用。
研究表明，缺氧与细胞周期、凋亡、自噬密切相关，细胞周期蛋白表达异常会引发细胞凋亡[10]。细胞周期失调的细胞有机会通过DNA损伤反应的各种机制来阻止DNA修复、细胞周期调节和DDR基因转录。目前研究认为，自噬是另一种DDR机制，它通过促进或防止细胞死亡来应对DNA损伤，从而发挥作用[11]。细胞周期从G1期到S期的调节因子是CDK2蛋白，自噬主要影响细胞周期的G1期和S期，因此自噬与周期也存在密不可分的关系。
细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡方式，是一种正常的生理变化。缺氧是细胞凋亡的诱导因子之一，细胞凋亡加剧是低氧环境诱发机体机能损伤的重要途径[12]。其受Bax和Bcl-2控制。Bcl-2蛋白的过表达在动物模型中被证明可以减轻肝和肾的损伤，而Bax的过度表达则可诱导细胞凋亡[13]。本实验的结果表明，缺氧组大鼠脑组织中Bax/Bcl2比值降低，诱导细胞凋亡，加重脑水肿，7-HEC可上调Bax/Bcl2比值，进而抑制细胞凋亡，起到抗高原脑水肿的作用。
细胞周期在细胞增殖和分裂中起着关键作用，其由两类蛋白精确调控，CDKs、cyclin作为关键的周期蛋白。这两类蛋白决定了细胞维持在停滞状态或继续进行细胞周期。细胞周期抑制已被证明可以提供神经保护，减少星形胶质细胞瘢痕形成和微胶质激活，并改善创伤性脑损伤后的运动和认知恢复[14]。在本实验中，缺氧环境可下调周期蛋白的表达，而7-HEC可上调周期蛋白的表达，对高原脑水肿起到一定的预防作用。
缺氧与自噬密切相关。缺氧条件下，会诱导自噬的发生。自噬是一种高度调控的连续过程，它是一种重要的程序性细胞死亡[15]。LC3蛋白与P62蛋白相互作用，是自噬的标志物。P62蛋白通常存在于自噬体中，并在自溶酶体形成时被降解[16]。LC3蛋白是哺乳动物自噬蛋白和自噬小体标记物，LC3B是自噬体标记的四种不同亚型中使用最广泛的一种。自噬受体包括P62等一系列连接泛素化底物和LC3的适配器，自噬体一旦形成，就会经历成熟阶段，然后与溶酶体融合，发生自噬。此外，P62还可调节细胞凋亡，主要通过选择性减少胞质中促凋亡蛋白来减轻细胞死亡，保护机体免受伤害[17]。在本实验中7-HEC可下调P62、上调LC3B的表达，从而促进自噬，保护机体免遭高原脑水肿损害。
凋亡、自噬、周期三种生物过程相互联系，相互影响，作用于机体，保障机体的正常运行。凋亡、自噬、周期相关因子的变化又会影响氧化应激通路的发生发展。在本实验中，7-HEC降低大鼠脑组织中MDA含量，上调SOD含量，从而抑制HACE引发的氧化应激；其还可上调周期和自噬蛋白的表达，从而增强大鼠脑神经元细胞的增殖活性，加速损伤细胞的自噬，保护机体免受HACE的损害。综上，7-HEC可抑制细胞凋亡和周期，增强自噬，进而抑制机体氧化应激，从而达到防护高原脑水肿的作用。
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图 2 舒肝宁注射液靶点蛋白相互作用网络
注：其中节点表示蛋白，节点的大小和颜色代表“度”值的大小，节点越大、颜色由白变黑代表“度”值逐渐增大；边代表蛋白之间的关联，边的粗细代表Coming score，边越粗表示Coming score值越大；图中字体突出靶点是肝炎疾病相关得分大于10的靶点。
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