补骨脂二氢黄酮甲醚的药理活性及肝毒性研究进展

周容睿; 魏艳平; 陈威; 丁倩倩; 王金鑫; 祖先鹏

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202204031

补骨脂二氢黄酮甲醚的药理活性及肝毒性研究进展

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202204031

周容睿^1a,,
魏艳平²,
陈威^1b,
丁倩倩³,
王金鑫^1a, ,,
祖先鹏^1b, ,

1a.
海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433
1b.
海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433
2.
山东中医药大学药学院, 山东济南 250355
3.
安徽中医药大学药学院, 安徽合肥 230021

详细信息

作者简介:
周容睿, 本科生，E-mail: Zhourr9414@163.com

通讯作者: 王金鑫，讲师，研究方向：天然药物化学，Email：jxwang2013@126.com; 祖先鹏，副教授，研究方向：中药药效物质基础与系统生物学研究，Email：zuxianpeng@163.com

Progress on pharmacological activities and hepatotoxicity of bavachinin

ZHOU Rongrui^{1a
,},
WEI Yanping²,
CHEN Wei^1b,
DING Qianqian³,
WANG Jinxin^{1a
, ,},
ZU Xianpeng^{1b
, ,}

1a.
Basic Medicine School, b. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China
1b.
Basic Medicine School, b. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China
2.
School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
3.
School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

摘要: 补骨脂二氢黄酮甲醚是来源于豆科补骨脂属植物补骨脂Psoralea corylifolia L.干燥成熟果实的二氢黄酮类成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病、抗炎及神经保护等药理活性，有着良好的临床应用潜力。随着临床上对补骨脂用药安全的不断关注，补骨脂二氢黄酮甲醚已被证实会造成肝细胞损伤。本文综述了近20年来关于补骨脂二氢黄酮甲醚的药理活性及肝毒性研究概况，为补骨脂二氢黄酮甲醚的后续研究和临床应用提供参考。
- 补骨脂二氢黄酮甲醚 /
- 药理作用 /
- 抗肿瘤 /
- 抗病毒 /
- 抗糖尿病 /
- 神经保护 /
- 抗炎 /
- 肝毒性
Abstract: Bavachinin is a dihydroflavone isolated from dried ripe fruits of Psoralea corylifolia L., which has various pharmacological activities, such as anti-tumor, anti-virus, anti-diabetes, anti-inflammatory and neuroprotective, and good potential in clinical applications. With the increasing concern about the safety of P. corylifolia applications in clinical, the bavachinin has been found to be one of the main components causing liver injury. In this paper, the pharmacological activities and hepatotoxicity of bavachinin in the recent 20 years were reviewed, in order to provide reference for the further study and clinical application.
- bavachinin /
- pharmacological activity /
- anti-tumor /
- anti-virus /
- anti-diabetes /
- neuroprotective /
- anti-inflammatory /
- liver toxicity
骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏^[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程^[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素^[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%^[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。

骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激^[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化^[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症^[7]。

冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用^[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道^[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。

1.   材料

1.1   动物

SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。

1.2   试剂

α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。

1.3   仪器

371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。

2.   方法

2.1   CSE制备

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文^[12]。

2.2   BMMs分离与培养

选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×10⁶个^[13]。

2.3   CCK-8法检测BMMs细胞活性

在96孔板中，BMMs以8×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。

2.4   体外破骨细胞分化实验

在96孔板中，BMMs以6×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。

将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色^[14]。

2.5   F-actin环染色和骨吸收实验

在96孔板中，BMMs以6×10³个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。

骨吸收实验：BMMs以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×10³个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积^[15]。

2.6   q-PCR检测

在12孔板中，BMMs以5×10⁴个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文^[16]。

2.7   蛋白印迹法检测

在6孔板中，BMMs以5×10⁵个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。

2.8   动物造模、分组及给药

在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）^[14]。术后1周，按照文献报道方法^[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。

2.9   HE染色和TRAP染色

小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。

2.10   ELISA法检测血清生化指标

小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。

2.11   统计学方法

使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（$\bar x $±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

3.   结果

3.1   CSE对BMMs细胞活力的影响

CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。

图 1 CSE对BMMs细胞活力的影响（n=3）

A.CSE处理48 h 后的BMMs细胞相对存活率；B.CSE处理96 h 后的BMMs细胞相对存活率

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3.2   CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响

TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。

图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）

A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数^**P<0.01，与RANKL组比较

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在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。

3.3   CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响

鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。

图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）

A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比^**P<0.01，与RANKL组比较

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骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。

3.4   CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响

q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。

图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）

A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1^*P<0.05，^**P<0.01，与RANKL组比较

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3.5   CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响

Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。

图 5 CSE对p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38蛋白表达的影响

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3.6   CSE对卵巢切除小鼠的影响

HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。

图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）

A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；^**P<0.01，与OVX组比较；^##P<0.01，与假手术组比较

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3.7   CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响

ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。

图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）

A.TRAP；B.ALP；C.BGP；^*P＜0.05，^**P<0.01，与OVX组比较；^##P<0.01，与假手术组比较

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4.   讨论

骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因^[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径^[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。

研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞^[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标^[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。

F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能^[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。

我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性^[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性^[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环^[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。

总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。

表 1 补骨脂二氢黄酮甲醚的抗肿瘤作用及机制

药理作用	作用机制	模型	文献
抑制肿瘤血管生成	促进缺氧诱导因子-la(HIF-1a)的降解作用，抑制肿瘤血管生成	KB癌细胞（HeLa细胞衍生物） HOS人骨肉瘤细胞	[8]
抗淋巴管生成	抑制TR-LE细胞增殖和毛细血管样管形成	TR-LE细胞	[9]
抑制肿瘤细胞增殖	通过激活ATM/ATR-CHK2/CHK1信号通路，诱导DNA损伤和细胞周期阻滞于G2/M期	SCLC细胞株(H1688)	[10]
	通p38-MAPK介导的p21Waf1/cip1信号通路诱导细胞周期阻滞G2/M期	NSCLS细胞系(A549、H23、HCC827)	[11]
	抑制IL-6和STAT3通路	Hep3B细胞	[6]
诱导肿瘤细胞凋亡	剂量相关性上调Fas、FasL、caspase-8和 caspase-3表达	SCLC细胞株(H1688)	[10]
	上调促凋亡基因p53、caspase-3、caspase -8和caspase -9表达	MCF-7细胞	[12]
	激活PPARγ，ROS水平升高	NSCLC细胞系(A549)	[13]
	激活细胞凋亡相关p53、Bcl2、BAX信号通路	DMH+DSS诱导的大鼠结肠癌模型	[14]
逆转多药耐药	下调MDR1和ABCG2基因表达，减少药物外排	胃癌耐药细胞系(EPG85.257RDB) 乳腺癌耐药细胞系(MCF7/MX)	[15] [16]
免疫作用	诱导γδT细胞增殖	胃癌细胞(SGCA99)	[17]
注：SCLC：小细胞肺癌；NSCLC：非小细胞肺癌；DMH：二甲肼；DSS：葡聚糖硫酸钠

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期刊类型引用(1)
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1. 材料
1.1 动物
1.2 试剂
1.3 仪器
2. 方法
2.1 CSE制备
2.2 BMMs分离与培养
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
2.4 体外破骨细胞分化实验
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
2.6 q-PCR检测
2.7 蛋白印迹法检测
2.8 动物造模、分组及给药
2.9 HE染色和TRAP染色
2.10 ELISA法检测血清生化指标
2.11 统计学方法
3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
4. 讨论

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补骨脂是豆科补骨脂属植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，呈扁椭圆形，主要产地包括西双版纳、四川等地，印度、缅甸也有分布。其性味苦、辛、温，归肾、脾经，具有温肾助阳，温脾止泻等功效^[1]，外用可消风祛斑，民间常用于治疗白癜风^[2]。补骨脂还是经典方剂四神丸、二神丸等的主要组成。目前从补骨脂中分离出化合物为香豆素类、黄酮类及单萜酚类三大类^{[1- 2]}。补骨脂二氢黄酮甲醚是二氢黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗哮喘、神经保护等药理活性^[3]。近年来，中药用药的安全性越来越受到人们关注，补骨脂二氢黄酮甲醚已被证实长期使用会引起严重肝损伤。本文主要从补骨脂二氢黄酮甲醚的药理作用和肝毒性方面进行总结，以期为补骨脂二氢黄酮甲醚的进一步研究和临床合理使用提供参考。

1. 药理作用

1.1. 抗肿瘤

补骨脂二氢黄酮甲醚通过抑制肿瘤细胞增殖、抗淋巴管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转多药耐药等多个作用环节抑制乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤细胞。DNA聚合酶在有丝分裂过程中参与DNA复制、转录及重组，是癌症化疗药物的重要靶点，而补骨脂二氢黄酮甲醚对DNA聚合酶具有明显的抑制作用^[4]。普遍认为，雌激素及其受体在乳腺癌的发生发展中发挥了重要作用，而芳香化酶(AR)作为一种限速酶在雄激素转化为雌激素过程中也有重要作用，它在卵巢、胎盘、乳腺组织中高水平表达，特别是在肿瘤部位和周围的区域高表达。补骨脂二氢黄酮甲醚可以抑制AR活性从而减少雌激素依赖性肿瘤生长^[5]。此外，体外抗增殖实验表明，补骨脂二氢黄酮甲醚对于人肝癌细胞HepG2、Hep3B、人结肠腺癌细胞Caco-2、人结肠癌细胞HT-29均有抗增殖作用，IC₅₀分别为11.32±0.69 μmol/L、3.02±0.53 μmol/L、55.94±4.9 μmol/L、39.7±2.3 μmol/L^[6-7]。补骨脂二氢黄酮甲醚的抗肿瘤作用及机制见表1。

表 1 补骨脂二氢黄酮甲醚的抗肿瘤作用及机制

药理作用	作用机制	模型	文献
抑制肿瘤血管生成	促进缺氧诱导因子-la(HIF-1a)的降解作用，抑制肿瘤血管生成	KB癌细胞（HeLa细胞衍生物） HOS人骨肉瘤细胞	[8]
抗淋巴管生成	抑制TR-LE细胞增殖和毛细血管样管形成	TR-LE细胞	[9]
抑制肿瘤细胞增殖	通过激活ATM/ATR-CHK2/CHK1信号通路，诱导DNA损伤和细胞周期阻滞于G2/M期	SCLC细胞株(H1688)	[10]
	通p38-MAPK介导的p21Waf1/cip1信号通路诱导细胞周期阻滞G2/M期	NSCLS细胞系(A549、H23、HCC827)	[11]
	抑制IL-6和STAT3通路	Hep3B细胞	[6]
诱导肿瘤细胞凋亡	剂量相关性上调Fas、FasL、caspase-8和 caspase-3表达	SCLC细胞株(H1688)	[10]
	上调促凋亡基因p53、caspase-3、caspase -8和caspase -9表达	MCF-7细胞	[12]
	激活PPARγ，ROS水平升高	NSCLC细胞系(A549)	[13]
	激活细胞凋亡相关p53、Bcl2、BAX信号通路	DMH+DSS诱导的大鼠结肠癌模型	[14]
逆转多药耐药	下调MDR1和ABCG2基因表达，减少药物外排	胃癌耐药细胞系(EPG85.257RDB) 乳腺癌耐药细胞系(MCF7/MX)	[15] [16]
免疫作用	诱导γδT细胞增殖	胃癌细胞(SGCA99)	[17]
注：SCLC：小细胞肺癌；NSCLC：非小细胞肺癌；DMH：二甲肼；DSS：葡聚糖硫酸钠

1.2. 抗菌、抗病毒

木瓜蛋白酶(PLpro)是冠状病毒成熟和复制环节不可或缺的蛋白酶。补骨脂二氢黄酮甲醚通过结合PLpro上关键氨基酸残基抑制冠状病毒的木瓜蛋白酶样蛋白酶活性，从而阻止病毒复制、逃避宿主先天免疫反应，可能成为治疗冠状病毒的候选药物^[18]。Yoon等^[19]发现，在vero细胞中，天然补骨脂二氢黄酮甲醚和人工合成的外消旋体均有良好的抗MERS-COV活性，IC₅₀为6.6 μmol/L。此外，Zhao等^[20]通过一种新型神经氨酸酶固定化毛细管微反应器发现补骨脂二氢黄酮甲醚具有剂量依赖性地抑制神经氨酸酶的作用。

补骨脂二氢黄酮甲醚对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)和表皮葡萄球菌(S. epidermidis ATCC 12228)具有较强的抑菌活性^[21]。在浓度为10 μg/ml，补骨脂二氢黄酮甲醚对金黄色葡萄球菌有抑菌圈(8 mm)，但对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌(Beta lactamase positive S. aureus)无抑制作用^[22]。Cui等^[23]研究也发现，补骨脂二氢黄酮甲醚在浓度为32 μg/ml时对MRSA(OM481、OM584)仍无抑制活性，这提示补骨脂二氢黄酮甲醚可能对耐药性菌不敏感。

1.3. 抗糖尿病

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核受体超家族的一种，作为配体诱导的转录因子，控制多个靶基因的表达。PPAR共有α、β/δ和γ三种亚型。PPAR γ是脂肪细胞分化的主要调节因子，在糖脂代谢中发挥重要作用。体外实验证明，补骨脂二氢黄酮甲醚通过激活PPAR γ，调节糖代谢^[24]。同时补骨脂二氢黄酮甲醚作为一种天然的泛过氧化物酶体增殖物受体激活剂，通过调节PPAR等相关基因表达增强了葡萄糖的转运和利用，降低血糖水平，减轻药物肝毒性，提高胰岛素敏感性，调节脂质代谢^[25]。与噻唑烷二酮类降糖药物和贝特类调血脂药物合用，可以放大胰岛素增敏作用，降低肝毒性并在不影响食物摄入量的条件下减轻药物引起的体质量增加，这种联合用药可以作为代谢综合征和2型糖尿病的辅助治疗药物提高疗效和降低毒性^[26]。天然的补骨脂二氢黄酮甲醚是R/S构型的混合物，通过超临界流体色谱法分离得到R、S两种对映体，并且发现它们具有相似的PPAR γ激动剂活性^[27]。Du等^[28]还对补骨脂二氢黄酮甲醚的构效关系进行了研究，总结了补骨脂二氢黄酮甲醚的活性必需结构。

1.4. 神经保护作用

神经炎症会导致并加速成人及儿童的许多神经退行性疾病，主要是造成中枢神经系统细胞内的稳态紊乱，比如铁的积累通过增强小胶质细胞的促炎活性、改变线粒体功能和诱导活性氧的产生而促进疾病进展，这在阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等中枢神经系统疾病中得到证实^[29]。补骨脂二氢黄酮甲醚抑制BV-2小胶质细胞中脂多糖（LPS）诱导的NO、TNF-α、IL-6生成，对H₂O₂诱导的神经细胞（HT-22小鼠海马细胞）损伤起到保护作用，可以作为退行性神经疾病的潜在药物^[30]。

AD的发病机制尚不明确，目前认为与β-淀粉样堆积有关，称为“淀粉样蛋白联级假说”，即淀粉样前体蛋白APP经β-分泌酶等切割产生β-淀粉样蛋白（Aβ），Aβ聚集形成淀粉样斑块，同时诱发下级事件，如蛋白Tau过度磷酸化、氧化应激，进而导致细胞损伤及神经递质缺失^[31]。有研究表明，膳食中添加补骨脂果实中提取的总异戊二烯基黄酮可有效预防与年龄相关的AD小鼠的认知缺陷，其中补骨脂二氢黄酮甲醚和补骨脂乙素通过抑制Aβ聚集减少神经损伤^[32]。杨柳等^[33]研究表明补骨脂二氢黄酮甲醚提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛水平，减少由于氧化应激引起的神经元损害，降低炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量，减少白细胞聚集引起炎症反应，能有效抑制Aβ诱导的PC12细胞损伤，发挥对神经细胞的保护作用。此外，补骨脂二氢黄酮甲醚能够抑制Aβ纤维化，高浓度下使Aβ42生成大的“非途径”聚集体，显著降低Aβ42诱导的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞毒性，其机制可能与药物直接结合Aβ淀粉样变区，诱导Aβ构象变化，抑制“通路”聚集有关^[34]。BACE-1是导致Aβ聚集的关键酶，体外研究证明补骨脂二氢黄酮甲醚能抑制杆状病毒中BACE-1的表达，IC₅₀为3.8±0.2 μmol/L ^[35]。

PD的主要病理特征为在SNpc神经元中，多巴胺水平减少、多巴胺能神经元损失和神经元胞质内包涵体“路易小体”的产生。单胺氧化酶-B（MAO-B)是调节多巴胺重要代谢酶，有临床试验证明，单胺氧化酶-B抑制剂作为早期PD的单一治疗和晚期PD左旋多巴的辅助治疗都是有效的^[36]。补骨脂二氢黄酮甲醚可竞争抑制人单胺氧化酶-B，分子对接结果显示7位C上的甲氧基在特异性抑制中起到关键作用，可用于PD的治疗^[37]。

1.5. 雌激素样作用

植物雌激素的化学结构与哺乳动物雌激素类似，可以结合雌激素受体，影响特定基因表达^[38]。雌激素经典的核受体分为ER-α和ER-β两类，ER-α主要促进细胞增殖而ER-β使细胞凋亡。补骨脂二氢黄酮甲醚对ER-α有微弱的抑制作用，IC₅₀为1.11×10⁻⁴ mol/L，而对ER-β没有抑制活性^[39]。绝经后骨质疏松症(PMOP)指绝经后女性雌激素水平下降、骨稳态改变的一种代谢性疾病。有研究发现植物雌激素可用于改善围绝经期的女性骨质疏松，减少PMOP患者的雌激素用量，提高生活质量^[40]。这提示补骨脂二氢黄酮甲醚作为一种植物雌激素，可用于治疗ER异常表达引起的骨质疏松。

1.6. 抗色素沉着

黄褐斑是一种色素沉着病，与黑素细胞合成过量黑素蓄积于皮肤有关，机体内雌激素参与黑素形成，可影响黑素细胞增殖、黑素合成中限速酶酪氨酸酶(TYR)活性，从而影响黑素合成，导致色素沉着。补骨脂二氢黄酮甲醚能够下调人黑素瘤细胞（A375细胞）中TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达，进而抑制黑素形成^[41]。与雌激素受体结合，通过第二信使激活ERK、JNK信号通路，而减少相关mRNA的表达，抑制TYR活性，减少细胞中黑素含量，用于治疗色素沉着^[42]。

1.7. 抗炎

白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，通过不同的信号传导通路激活各种生化功能。IL-6的失调在慢性炎症和自身免疫发挥病理作用。STAT-3被发现是IL-6激活的急性期反应因子(APRF)复合物的组成部分，共同参与炎症反应^[43]。在Hep3B细胞中，补骨脂二氢黄酮甲醚抑制IL-6诱导的STAT3依赖的启动子活性并且抑制其磷酸化，已知STAT3通过两个单体之间的SH2结构域磷酸化相互作用形成同型二聚体是功能激活的关键^[6]。Matsuda等^[44]发现，补骨脂二氢黄酮甲醚在26 μmol/L 浓度下能够抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞中NO的生成，这些发现提示补骨脂二氢黄酮甲醚可作为先导化合物用于开发治疗炎症性疾病的药物。

1.8. 抗哮喘

补骨脂二氢黄酮甲醚有免疫调节活性，在具有正常免疫功能的小鼠体内，可增强绵羊红细胞(SRBC)诱导的初次和二次体液免疫，轻微降低SRBC诱导的迟发型超敏反应^[45]。哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，常与气道高反应性、可变气流阻塞有关。根据世界卫生组织的数据，现有患哮喘患者的数量为3亿，预计到2025年将增加到4亿^[46]。研究发现，哮喘与2型辅助T细胞(Th2)的免疫反应有关，Th2细胞产生的细胞因子包括白介素IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和IL-33，这些细胞因子驱动嗜酸性炎症和组织损伤，导致气道高反应性和气道浸润^[47]。因此，阻断Th2细胞因子已成为治疗哮喘的新策略。补骨脂二氢黄酮甲醚能显著抑制细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的产生，阻断卵清蛋白致敏的动物哮喘模型中的炎症反应^[47]。锌指转录因子GATA-3不仅是Th2细胞分化的主调控因子控制相关白介素的表达，还是过敏性炎症的关键转录因子，因此它成为一个对抗炎症的抑制靶点^[48]。最近研究发现，补骨脂二氢黄酮甲醚通过降低GATA-3 mRNA的稳定性，选择性抑制GATA-3的表达^[47]。然而，补骨脂二氢黄酮甲醚的水溶性极低（<30 ng/ml），限制了其临床应用。Wang等^[49]制备了一种装载补骨脂二氢黄酮甲醚的纳米颗粒(PEG5000-PLGA NPs)，这些纳米颗粒的生物相容性好，并对有炎症的肺组织表现出特异性的靶向能力，在小鼠过敏性哮喘模型中表现出非常好的抗哮喘治疗效果。

1.9. 抑制人羧酸酯酶

羧酸酯酶(CEs)是α/β水解酶折叠酶的一个保守的多基因家族，广泛分布于哺乳动物多种组织中。CEs负责多种内源性和外源性物质的水解，包括脂肪酸酯、环境毒素和含酯药物等，是哺乳动物重要的Ⅰ相代谢酶^[50]。人体内CEs主要分为两类，人羧酸酯酶1(hCE1)和人羧酸酯酶2(hCE2)。hCE1主要在肝脏中表达，参与肝内物质代谢如药物的生物转化、调节脂质代谢、参与体内胆固醇的转运代谢等。研究表明，补骨脂二氢黄酮甲醚竞争性抑制hCE1活性^[51]，减少了心血管药物氯吡格雷水解，提高氯吡格雷的疗效，这提示补骨脂二氢黄酮甲醚可作为辅助药物，降低治疗药物副作用^[52]。hCE2主要在胃肠道和肿瘤组织中表达，在肝脏中表达相对较低，因此对口服药物的生物利用以及酯类抗癌药物的治疗起着重要作用。Li等^[53]发现，补骨脂二氢黄酮甲醚是hCE2的天然抑制剂，通过非竞争性抑制hCE2活性，IC₅₀为4.31 μmol/L，在缓解化疗药物所致的胃肠道副作用方面具有良好的应用前景。

1.10. 其他作用

研究发现，补骨脂二氢黄酮甲醚通过抑制人单核细胞中IL-1诱导的组织因子的表达从而减缓血液凝固，减少血栓形成^[54]。陈瑞战等^[55]通过二苯基三硝基苯肼法发现，补骨脂二氢黄酮甲醚具有抗氧化活性，但活性较弱。补骨脂提取物（PCE）主要通过NO/cGMP通路介导的内皮依赖性发挥血管舒张作用，补骨脂二氢黄酮甲醚可能与PCE中的补骨脂酚产生协同作用，增强PCE的血管平滑肌放松作用^[56]。此外，Dong等^[57]报道，补骨脂二氢黄酮甲醚未来可能成为代替他汀类药物治疗非酒精性脂肪性肝病的潜在药物，通过抑制Akt/mTOR/SPEBP通路抑制FDFT1的转录及翻译，抑制胆固醇合成的关键因子角鲨烯合成酶，进而抑制胆固醇合成。

2. 肝毒性机制

肝脏是机体的物质代谢中枢，不仅是糖、脂肪、蛋白质的代谢中心，还具有生物转化功能，进入体内的非营养物质比如药物经生物转化可增加水溶性，使其易于从胆汁或者尿液中排出。药物性肝损伤(DILI)是指在药物使用过程中，由于药物或其代谢产物所导致的肝细胞损害或特殊体质对药物及其代谢产物超敏感性或耐受性降低所致的疾病。现已发现补骨脂二氢黄酮甲醚具有肝细胞毒性，不利于新药的开发，因此明确其肝毒性机制非常重要。

DILI能改变肝重要细胞器——线粒体的功能和能量状态，因此线粒体被认为是介导肝细胞损伤和凋亡的中心环节，介导肝细胞死亡的多种途径^[58]。补骨脂二氢黄酮甲醚作用于HepaRG细胞，Bax/Bcl2蛋白比值、caspase-3活性增强，线粒体膜通道开放孔打开，伴随线粒体膜电位、ATP水平下降、细胞色素C活性增强，诱导细胞凋亡和坏死^[59]。Wang等^[60]发现，补骨脂二氢黄酮甲醚通过激活p38/JNK MAPK信号通路，在不同时间段内刺激ROS生成，包括早期p38的激活刺激ROS产生以及后期JNK激活维持生成ROS，进而诱导HepaRG细胞死亡。最新研究发现，补骨脂二氢黄酮甲醚提高ROS水平，会伴随线粒体膜电位降低，推测ROS异常增加引起的线粒体损伤可以诱导肝细胞凋亡和坏死，同时通过破坏L02和HepG2细胞中脂质合成和代谢之间的平衡，造成肝细胞中脂质积累^[61]。Label-free高通量蛋白质组学分析技术发现，补骨脂二氢黄酮甲醚可诱导HepaRG细胞蛋白表达差异化，表达差异的蛋白涉及30条信号通路，多数差异蛋白与氨基酸降解途径相关，推测补骨脂二氢黄酮甲醚通过影响细胞代谢通路的基因表达而诱导肝毒性^[62]。

人尿苷5’-二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）负责胆红素的代谢消除，补骨脂二氢黄酮甲醚是UGT1A1的天然抑制剂（IC₅₀为1.27 μmol/L），可能会造成胆红素升高，诱发急性肝损伤^[63]。CYP1A1是一种只要分布于肝脏的细胞色素P450酶，它通过结构中血红素的铁离子传递电子，在维持雌激素的稳态中发挥重要作用，雌激素过多在肝脏内蓄积后常引起胆汁淤积^[64]。研究表明，补骨脂二氢黄酮甲醚对CYP1A1表现也出较强的抑制活性，IC₅₀为4.07±0.85 μmol/L ^[65]。

3. 结语

补骨脂二氢黄酮甲醚具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗糖尿病及抗哮喘等药理活性。同时，补骨脂二氢黄酮甲醚因其药理活性的多样性可以多靶点、多条通路相互关联、共同发挥治疗作用。因此，需要加强对补骨脂二氢黄酮甲醚药理作用机制的探索，以便更好的服务于临床。

补骨脂及其制剂的用药安全性越来越受到关注。补骨脂作为驱白巴布期片的主要成分被报道具有潜在的肝毒性，并且已引起一例患者死亡^[66]。研究发现，补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮甲醚均具有肝毒性。补骨脂二氢黄酮甲醚通过影响线粒体功能、脂质积累等途径造成肝损伤。建议在使用药物时注意平衡药效和不良反应，尽量在最大程度地发挥其药理作用的同时又减少不良反应的发生。

此外，目前对于补骨脂二氢黄酮甲醚的研究多是体内和体外的研究，临床试验少。因此，应该加强对补骨脂二氢黄酮甲醚临床药理学和用药安全性研究，进一步阐明其作用机制，更好地服务于临床。

参考文献 (66)

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补骨脂二氢黄酮甲醚的药理活性及肝毒性研究进展

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202204031

作者简介: 周容睿, 本科生，E-mail: Zhourr9414@163.com

通讯作者: 王金鑫，讲师，研究方向：天然药物化学，Email：jxwang2013@126.com; 祖先鹏，副教授，研究方向：中药药效物质基础与系统生物学研究，Email：zuxianpeng@163.com

Progress on pharmacological activities and hepatotoxicity of bavachinin

1. 材料

1.1 动物

1.2 试剂

1.3 仪器

2. 方法

2.1 CSE制备

2.2 BMMs分离与培养

2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性

2.4 体外破骨细胞分化实验

2.5 F-actin环染色和骨吸收实验

2.6 q-PCR检测

2.7 蛋白印迹法检测

2.8 动物造模、分组及给药

2.9 HE染色和TRAP染色

2.10 ELISA法检测血清生化指标

2.11 统计学方法

3. 结果

3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响

3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响

3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响

3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响

3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响

3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响

3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响

4. 讨论

期刊类型引用(1)

其他类型引用(0)

计量

出版历程

补骨脂二氢黄酮甲醚的药理活性及肝毒性研究进展

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202204031

1a. 海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433 1b. 海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433 2. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355 3. 安徽中医药大学药学院, 安徽 合肥 230021

作者简介: 周容睿, 本科生，E-mail: Zhourr9414@163.com

通讯作者: 王金鑫，讲师，研究方向：天然药物化学，Email：jxwang2013@126.com; 祖先鹏，副教授，研究方向：中药药效物质基础与系统生物学研究，Email：zuxianpeng@163.com

English Abstract

Progress on pharmacological activities and hepatotoxicity of bavachinin

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1.1. 抗肿瘤

1.2. 抗菌、抗病毒

1.3. 抗糖尿病

1.4. 神经保护作用

1.5. 雌激素样作用

1.6. 抗色素沉着

1.7. 抗炎

1.8. 抗哮喘

1.9. 抑制人羧酸酯酶

1.10. 其他作用

目录

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1.1. 抗肿瘤

1.2. 抗菌、抗病毒

1.3. 抗糖尿病

1.4. 神经保护作用

1.5. 雌激素样作用

1.6. 抗色素沉着

1.7. 抗炎

1.8. 抗哮喘

1.9. 抑制人羧酸酯酶

1.10. 其他作用

作者简介:
周容睿, 本科生，E-mail: Zhourr9414@163.com

1a. 海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433

1b. 海军军医大学:a. 基础医学院, b. 药学院, 上海200433

2. 山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

3. 安徽中医药大学药学院, 安徽合肥 230021

作者简介:
周容睿, 本科生，E-mail: Zhourr9414@163.com