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念珠菌为条件致病真菌，可寄居于人体的不同部位，当人体局部或全身免疫力下降时，其致病性可造成个体浅表或全身感染。白念珠菌（Candidaalbicans）是念珠菌的一种，是引发侵袭性感染的最主要致病菌[1]。近年来，由于抗真菌药物的大量使用，白念珠菌的耐药性逐渐增加。常规抗菌药对白念珠菌的抑制效果明显降低。
相对于单药而言，多种药物联合使用时往往能通过药效互补，起到协同作用，增强抑菌效果[2-3]。联合用药提高了抑菌效果，患者的治疗周期缩短，治疗成本可进一步降低。因此，研究抗白念珠菌药物联合疗法对于治疗白念珠菌感染非常有意义。
一般来说，联合疗法会同时使用抗真菌药和增效剂。目前经典的抗真菌药物有唑类化合物（如氟康唑）、多烯类（如两性霉素B）和棘白菌素类（如卡泊芬净）等，这些药物可直接抑制或杀伤白念珠菌。氯法齐明、法尼醇本身对真菌没有直接抑制作用，但可作为增效剂辅助增强抗真菌药物治疗效果，增强耐药菌的敏感性。近年来，光动力学、声动力学疗法等新兴的技术应用于抗真菌的治疗，同时传统的抗真菌物质在现代技术的改进下也能发挥特有的优势，比如将银制成纳米银颗粒用于抑制白念珠菌增殖。本文将针对白念珠菌尤其是耐药菌的杀伤或抑制作用，聚焦于传统抗真菌药物与声动力学/光动力学疗法、纳米银颗粒这几类抗菌方式，阐述与之相关的联合疗法。
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氟康唑、酮康唑、咪康唑等唑类化合物是治疗白念珠菌感染的经典药物，具有毒性相对较低、制备技术成熟等优点。但随着临床治疗疗程变长以及使用频率的增多，白念珠菌的耐药性也越来越严重，单独使用唑类化合物的药效大大降低[4]。研究表明白念珠菌对唑类化合物耐药性主要由以下几种机制引起：唑类药物靶点ERG11过度表达降低了白念珠菌的敏感性；ERG11突变导致与唑类化合物的亲和力降低；细胞膜外排泵表达增加，将唑类药物排出细胞外；ERG3突变避免了氟康唑处理后有毒副产物在细胞内的积累；生物被膜物理隔离了白念珠菌胞体和抗真菌药物的接触[5]。尽管单独使用唑类药物应对耐药菌的效果并不理想，但作为传统的抗真菌药物，其作用机制较为明确，在与其他类型的抗真菌药物或疗法的协同作用下，仍发挥较强的抗真菌效果。
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真菌生物被膜是白念珠菌产生耐药性的重要原因之一。有实验表明，高浓度的酪醇、法尼醇（合金欢醇）等群感效应分子与氟康唑联合使用，可以起到抗真菌被膜的效果，提高白念珠菌对药物的敏感性[6]。白念珠菌对氟康唑等药物耐药的另一个重要机制是其细胞上的外排泵蛋白。对白念珠菌转运泵活性的抑制可增加真菌胞内药物的浓度，以达到抑制或杀灭真菌的目的。研究发现，法尼醇、盐酸氨溴索具有抑制ATP结合转运蛋白的功能，与氟康唑联用可达到抑制氟康唑耐药菌的作用。法尼醇单独使用时还可以诱导氟康唑抗性白念珠菌产生细胞内活性氧，促使其发生凋亡[7]。
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天然化合物在联合用药中也可以发挥重要作用，将其与常规药物结合可以成为应对耐药菌的有效策略。部分生物碱类，如以小檗碱及其衍生物为代表的异喹啉生物碱以及依波加因等吲哚生物碱，尽管在单独使用没有抗真菌功效，但当其与氟康唑联合使用时有克服白念珠菌对氟康唑耐药的效果[8-9]。还有一些化合物，例如，没食子酸、土槿皮乙酸，单独使用时即表现出抗真菌作用，与氟康唑联合使用可明显降低氟康唑的最低抑菌浓度[10-11]。此外，壳聚糖也具有一定的抗真菌效果，可以通过抑制染色质重塑复合物SAGA表达来影响白念珠菌细胞壁和细胞膜的形态[12]。氟康唑联合壳聚糖，有协同抗真菌活性[13]。得益于壳聚糖的细胞亲和性、生物降解性、低毒性、制备技术成熟等优势，氟康唑与壳聚糖的联合应用具有很大潜力。同时，中药方剂黄连解毒汤与氟康唑联用，通过抑制麦角甾醇相关基因，破坏白念珠菌生物被膜的形成，为抗真菌治疗提供了研究思路[14]。除此之外，一些皮质类固醇，例如地塞米松、布地奈德等药物，也能增强白念珠菌对氟康唑的敏感性[15-16]。
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钙调磷酸酶在真菌细胞形态、耐药性等多个生理方面发挥着重要作用[17]。氟康唑与FK506、环孢素A等钙调磷酸酶抑制剂联合使用，可以有效降低白念珠菌对氟康唑的耐受性。一方面，氟康唑抑制白念珠菌麦角甾醇的合成，使钙调磷酸酶抑制剂更容易进入白念珠菌细胞内；另一方面，钙调磷酸酶抑制剂增强了氟康唑的药效，使其从抑菌效果转为杀菌效果。两者联用能破坏白念珠菌的生物被膜，增强了抗真菌效果[18]。
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HSP90是一类与白念珠菌毒力和耐药性密切相关的分子伴侣，可以促进外排泵Cdr1的高表达，增强白念珠菌排出唑类药物，还可以通过一系列级联反应诱发白念珠菌对唑类耐受[19]。因此，抑制HSP90活性是提高白念珠菌对唑类化合物敏感性的有效途径之一。HSP90抑制剂Ganetespib可以下调氟康唑作用的靶酶ERG11和白念珠菌外排泵基因CDR1的表达，有抗生物被膜的效果，与氟康唑在体外联合使用时具有抗真菌活性[20]。除此之外，一些其它的HSP90抑制剂，如格尔德霉素，也可以和氟康唑起到协同作用[21]。针对真菌HSP90设计制备的人类基因重组抗体Mycograb与氟康唑的协同效果仅局限于敏感菌，但当其与两性霉素B联合使用时却能对部分耐药菌表现出一定的协同作用[22]。
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两性霉素B是经典的多烯类抗真菌药物，具有杀菌活性，但对人体不良反应较多。两性霉素B可以与成熟真菌细胞的细胞壁和出芽产生的子细胞的质膜结合，破坏真菌细胞膜，从而发挥抗真菌效果[23]。相对唑类药物而言，两性霉素B耐药发生的情况较少，目前主要面临的问题在于两性霉素B的毒性较大，尤其是对肝肾功能不全的患者有较大的副作用。所以在选择与两性霉素B联合使用的药物时，既要考虑抑菌效果又要考虑药物毒性，在联合使用时最好是能够通过低剂量两性霉素B达到较好效果，以降低其毒性产生的影响。为了降低两性霉素B对人体的毒性，常用的是采用结合脂质体的方法，将两性霉素B包埋在脂质体试剂中。脂质体可以高效地介导两性霉素B与真菌结合，在减少两性霉素B副反应的同时，还提高了其转移至真菌细胞内的效率[24]。两性霉素B和5-氟胞嘧啶联合是临床常用方法，具有更好的抗真菌功效，而且相比于单独使用两性霉素B，两者联合可小幅度降低两性霉素B的毒性[30]。
一些具有抗真菌效果的化合物可能同时具有低毒性的优势。天然化合物丁香酚可以作为渗透酶抑制剂影响白念珠菌的生长形态并阻断Ca2+通道，将其与两性霉素B同时使用时能够引起白念珠菌细胞内活性氧含量的升高，线粒体损伤，胞质内细胞色素C含量升高，导致细胞损伤。相对于单独发挥抗菌效果的两性霉素B，该组合有效降低了两性霉素B的使用剂量，降低了毒副作用[25]。 1,3,4-噻二唑衍生物4-(5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2-yl) benzene-1,3-diol（C1化合物）可与白念珠菌的细胞壁发生作用，影响其完整性，诱发形态紊乱。研究表明，C1化合物与两性霉素B显示出了强烈的协同作用，将100%抑制病原真菌所需的两性霉素B用量降低了10倍甚至几十倍，而且针对正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）的细胞毒实验表明，高浓度的C1化合物并不会对其产生细胞毒效应[26]。
与其他非抗真菌药物联合使用以增强抗真菌效果的方法对两性霉素B同样适用。近年来，已经有团队研发了Simpotentin、Nectriatide、Polyketide glycosides phialotides等两性霉素B活性增强剂，临床前阶段的实验表明，这些两性霉素B活性增强剂可以有效地降低两性霉素B的用量[27-29]。
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棘白菌素是一类β-1,3-D-葡聚糖合酶抑制剂，可以干扰白念珠菌细胞壁的形成，随着其临床上的广泛应用，有越来越多的耐药菌被分离出来。白念珠菌编码葡聚糖合酶亚基的FKS基因突变、真菌生物被膜的形成、应激适应等多种因素均可能引发棘白菌素耐药，通过联合疗法有可能解决耐药问题[31]。
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尼可霉素Z是一种几丁质合酶抑制剂，同β-1,3-D-葡聚糖一样，几丁质也是真菌细胞壁的重要组成成分。当棘白菌素类药物抑制白念珠菌β-1,3-D-葡聚糖合成时，白念珠菌有可能通过上调几丁质的合成，减轻棘白菌素对细胞壁的损伤，降低对棘白菌素的敏感性[32]。如果在使用棘白菌素类药物卡泊芬净或米卡芬净的基础上同时使用尼可霉素Z，则可以同时抑制β-1,3-D-葡聚糖和几丁质的合成，有效抑制白念珠菌的生长[33]。
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由于棘白菌素与唑类化合物抑制白念珠菌的机制不同，将两者联合使用增强对棘白菌素耐药菌的抑制作用。当棘白菌素与泊沙康唑联合使用时，对白念珠菌SC5314的分级抑菌浓度(FIC)<0.5，表明两者联合使用时具有体外协同抗真菌活性[34]。
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氯法齐明是传统的抗分枝杆菌药物，尽管不是抗真菌药物，但研究发现，当氯法齐明与一些其他抗菌类药物联合使用时，具有广谱的抗真菌活性，因此有作为联合药物应用于抑制传统耐药菌增殖的潜力。有研究表明，氯法齐明分子的疏水结构可以嵌入到白念珠菌的膜双层的烃相中，通过非特异性膜扰动发挥对白念珠菌的抑制作用。当卡泊芬净与氯法齐明联合使用时，两者表现出了协同作用[35]。
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一些小分子抗真菌肽和棘白菌素类药物联合使用，也有抑制白念珠菌生长的潜力。通常而言，这类多肽发挥抗菌作用的机制主要是抑制真菌生物膜的形成。植物防御素家族是抗真菌肽的丰富来源，对真菌病原体具有广谱的抗菌活性且通常对人类毒副作用较小。植物防御素HsAFP1在与卡泊芬净的协同作用下表现出了显著的抗白念珠菌生物被膜活性[36]。在应用于联合疗法时，可以考虑将抗真菌多肽通过一些处理来增强活性。酪氨酸复合物可以通过破坏白念珠菌生物膜、诱导内源性活性氧等效应发挥对白念珠菌的抑制作用，与卡泊芬净有明显的协同作用[37]。但由于其容易在水中形成高级结构，过度聚集，其活性会因此而受到影响。针对酪氨酸复合物易于纤维素稳定结合的特性，利用纤维素类制剂可以有效控制酪氨酸复合物的稳定性，增强其活性[38]。
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声动力学和光动力学抗真菌疗法是一个新兴的技术，近年来，针对白念珠菌光动力学和声动力学疗法相关的研究也逐渐增多，在临床和实验都有其相关应用的报道。由于白念珠菌的耐药性与其对光动力学疗法抗性无直接的相关性，光动力学疗法有望成为应对白念珠菌耐药的有效手段之一[39]。在纳米颗粒、姜黄素类药物、甲苯胺蓝等光敏剂的作用下可以使用无害的可见光激活活性氧，从而达到破坏真菌生物被膜、杀伤真菌细胞的效果[40]。β葡聚糖酶、DNA酶等水解酶可以通过破坏白念珠菌生物被膜，使光敏剂更容易渗透到更深的生物膜层，加强光动力疗法的效果[41]。为了进一步提高光动力学疗法的抗真菌效果，可以使用其他抗真菌药物联合使用，有研究表明，相对于单独使用抗真菌的唑类药物，如咪康唑、氟康唑、伊曲康唑等，唑类药物和光动力学疗法联合使用时可以下调绝大部分白念珠菌菌株的活力[42-43]。
声动力学疗法主要基于低频和低强度超声，在与其他药物如两性霉素B的协同作用下，声动力学疗法比单独使用抗菌药物更有效，对白念珠菌活性、生物被膜活性以及其酶的活性均产生一定的影响[44-45]。
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银和银盐用于灭菌已有很长的历史，近年来，随着纳米材料在生物学中的应用，纳米银的抗菌作用逐渐引起重视。纳米银颗粒主要是通过诱导细胞内活性氧的生成对白念珠菌产生杀伤作用，还可以诱导真菌耐药性和致病性相关的多个靶点改变，影响真菌细胞形态、膜流动性、菌丝形成等[46]。有实验表明，纳米银对多种真菌的混合生物被膜有抑制效果[47]。单独使用纳米银有一定的抗菌效果，不同的载体和不同的纳米银制备过程对其抗菌效果影响不同，相对于使用游离的纳米银颗粒，使用可生物降解的材料聚乳酸作为载体时的抗菌活性明显提高[48]。有研究表明，纳米银可以干扰白念珠菌对葡萄糖的摄取，当其与糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸共同使用时，则可以进一步阻碍白念珠菌获取增殖所需的能量，针对能量层面表现出协同作用，促进白念珠菌的死亡[49]。
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随着传统抗真菌药物的长期大量使用，白念珠菌的耐药性也逐渐增强。在探索新的抗真菌药物的同时，联合疗法也可以作为临床治疗中应对耐药白念珠菌的有效思路。抗菌药物和增强剂同时使用、新型抗菌技术配合药物等联合治疗手段，已经有了大量实验数据的支持，展现出了巨大的临床应用潜力。
在联合疗法的介导下，发挥抗菌作用的药物仍是抗菌主力，其他非抗菌药物和技术则有效地辅助了抗菌药物的疗效，通过破坏真菌生物被膜等方式发挥协同效应。在经典抗菌药物杀伤真菌的基础上，尝试联合以不同途径抑制、杀伤真菌或针对真菌耐药机制发挥作用的药物及手段，是寻找新的联合疗法的主要思路。
Research progress on drug combination therapy against Candida albicans
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摘要: 白念珠菌是念珠菌属最常见的种类之一，是临床上重要的侵袭性念珠菌感染来源。由于传统抗真菌药物的广泛使用，临床已经分离出很多耐药白念珠菌，导致部分传统药物在临床治疗效果明显下降。同时，一些化合物自身的毒性限制了其临床应用。在这种背景下，联合疗法由于发挥了各种药物或手段的协同作用，有可能改进单独用药的不足，具有抑制白念珠菌生长的巨大潜力。Abstract: Candida albicans is one of the most common species of Candida, which is an important cause of invasive candidiasis in clinic. Due to the frequently use of classical antifungal agents, there are amounts of drug resistant C. albicans being isolated, causing the significantly decreasing of the efficacy of some antifungal agents in clinical treatment. Besides, the use of some compounds in clinic has been limited because of their toxicities. In such a context, drug combination therapy shows great potential on antifungal because of the synergy of different drugs or therapeutic methods that could bring, which could improve the weaknesses of single drug.
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Key words:
- Candida albicans /
- combination therapy /
- azole /
- polyenes /
- echinocandins /
- photodynamic therapy /
- ultrasonic therapy /
- silver nanoparticles
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中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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