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肿瘤RNA是目前已知肿瘤疫苗的来源之一[1-2]。先前的研究表明，从CT26结肠癌细胞提取的肿瘤RNA可以通过增强机体抗肿瘤免疫来抑制肿瘤生长[3]，但由于肿瘤RNA易降解、不稳定等特性，需要载体对其包裹后实施注射，从而发挥其抗肿瘤作用[4]。研究证实，纳米脂质体载体具有较强的稳定性，可有效地包裹RNA，并在体内和体外递送核酸，发挥核酸诱导或抑制细胞表达的作用[5-7]。然而，机体不同部位对药物的吸收情况不同，因此，导致药物吸收转化的效果产生差异。为了比较不同部位注射对药物治疗效果的影响，本研究从CT26结肠癌细胞中提取肿瘤RNA，并使用纳米脂质体对其进行包裹制备成纳米脂质体疫苗，分析了不同部位注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗所产生的增强机体抗肿瘤反应的情况。
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R205B旋转蒸发器（上海申科科技有限公司）；610000-1EA型薄膜挤出器（美国Avanti公司）；必能信Sonifier®450D超声波粉碎仪（美国必能信公司）；马尔文粒径仪（英国马尔文仪器公司）；透射电子显微镜 JEM2100F（日本JEOL公司）；染色封片工作一体机（胶带）Prisma+ Film（日本樱花公司）。
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(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺硫酸盐((N-1-(2, 3-dioleoyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulfate, DOTAP)（美国Avanti Polar Lipids公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxy(polyethylene glycol)-2000) (sodium salt), DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid)（美国Avanti公司）；鱼精蛋白、小牛胸腺DNA（美国Sigma公司）；胆固醇（上海麦克林生化科技有限公司）；氯仿（中国医药集团有限公司）；DEPC水（碧云天生物技术有限公司）；TRIzol RNA 分离试剂（美国Thermo公司）；CT26小鼠结肠癌细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），SPF 级 BALB/c 雄性小鼠（上海吉辉实验动物饲养有限公司），饲养于屏障系统中。
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首先取胆固醇、DOTAP两种材料的氯仿溶液，将二者以1∶1 (m∶m)的比例加入到250 ml的茄型瓶中，随后再加入4 ml氯仿溶液。在真空、45 ℃及100 r/min条件下旋转蒸发45 min，再加入3 ml DEPC水，在45 ℃及100 r/min条件下旋转蒸发45 min，获得脂质体混悬液。先进行超声20 min，再先后通过聚碳酸酯膜（100、50 nm），反复挤出各20次，即得DOTAP/Chol纳米脂质体。
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取长满培养皿的CT26细胞，倒去培养基，加入3 ml无菌PBS溶液，并轻晃几下进行清洗，然后按照TRIzol™ Reagent 操作说明提取RNA。提取完成后，将核酸溶液用NanoDrop 2000测A值、浓度和纯度。将检测完成后的核酸溶液分装至1.5 ml EP管中，随后放入液氮中保存。
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准备DOTAP/Chol 脂质体疫苗63 μl，鱼精蛋白12 μl（2 μg/μl）和DEPC水10 μl，将上述材料混合，于室温放置 10 min，得到DOTAP/Chol 脂质体和鱼精蛋白的混合物，在45～50 ℃的范围内水浴加热1～2 min。准备肿瘤RNA 45 μl(0.5 μg/μl)，小牛胸腺 DNA 1.2 μl(10 μg/μl)和DEPC 处理水30 μl，将以上材料混合，并室温放置10 min，得到肿瘤RNA与小牛胸腺DNA 的核酸聚合物，将DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid 3.2 μl(10 μg/μl)加入到 RNA/DNA 聚合物中，在45～50 ℃的范围内水浴加热1～2 min，得到RNA/DNA/PEG 复合物。将纳米脂质体/鱼精蛋白复合物加入到 RNA/DNA/PEG 复合物中，常温放置 10 min。最后将混合物放入 55 ℃的环境中静置10 min，然后在常温环境中静置 10 min，即可得肿瘤RNA纳米脂质体疫苗。
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稀释肿瘤RNA纳米脂质体疫苗至适当浓度，取1 ml进行粒径检测。选择干净的样品池，取肿瘤RNA纳米脂质体疫苗溶液小心加入，在加入的同时避免气泡产生。把样品池放入进样样品槽中，然后进行粒径检测。对于脂质体放置稳定性试验，将脂质体放置于4 ℃，在第1、3、5、7天取样测量粒径。
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将10 μl的脂质体疫苗溶液缓慢滴加在铜网上，在室温下彻底风干。随后滴加2%磷钨酸溶液，并使用滤纸吸干多余液体，后在室温下彻底干燥。之后将检测铜网放置在透射电镜下进行观察。
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实验开始后，取对数生长期的CT26细胞，计数为1×106/ml，在小鼠右侧背部近腋窝处接种，每只小鼠皮下接种CT26细胞100 μl（1×105个/只），构建小鼠结肠癌移植瘤模型。接种1周后按照实验方案接种相应脂质体疫苗溶液，频率为每7 天一次，一共3次。其中，PBS 组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠腹腔注射200 μl的 PBS 作为空白对照。肿瘤RNA纳米脂质体疫苗腹腔注射组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠腹腔注射200 μl的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，注射频率为每7 天一次，共注射 3 次；肿瘤RNA纳米脂质体疫苗皮下注射组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠左侧皮下注射200 μl的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，频率为每7 天一次，共注射3 次；当肿瘤体积达到2 000 mm3时处死小鼠，并提取实验小鼠各项指标进行分析。
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动物实验结束后，将小鼠处死，之后将移植瘤肿瘤团块完全剥离，小心去除肿瘤周围的结缔组织和血管，使用PBS浸泡清洗干净后，使用干净滤纸将水吸干，浸没置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。同时，将各组实验小鼠处死后，将心、肝、脾、肺、肾完整剥离，去除结缔组织和血管，使用PBS浸泡清洗干净后，使用干净滤纸将水吸干，浸没置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。将需要处理的组织块放入合适的耐液氮的冰冻小盒中，将冰冻小盒缓缓放入液氮中，使其彻底浸没在液氮中，浸没约20 s左右，使组织块能够彻底冰冻成块。组织块冰冻成块后，取出冰冻块，快速使用已涂抹有冰冻包埋剂的塑料薄膜进行包封，然后将已经包封好的组织块和切片冻头放入冰箱进行保存备用，冰箱温度设置为−80 ℃。按照冰冻切片机器操纵要求进行冰冻切片，切片厚度控制在20～30 μm左右，然后，将切片样品放入−20 ℃的冰箱进行保存。使用染色封片工作一体机（胶带）Prisma+ Film，按照操作说明进行染色及封片操作。使用数字切片扫描系统 PRECICE 500进行图像采集分析。
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所有数据均以（
$\bar x $ ±s）表示，统计分析软件使用GraphPad Prism Version 9 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)，组间差异采用t检验，P<0.05时表示差异有统计学意义。 -
将从CT26细胞中提取的RNA使用NanoDrop 2000进行检测，OD260/OD280为2.04（图1A），OD260/OD230为1.96，符合RNA需达到OD260/OD280>2.0，1.8<OD260/OD230<2.2的要求，且浓度达到1762.1 ng/ml，满足后续实验需要。制备肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，通过马尔文激光粒度测定仪对肿瘤RNA纳米脂质体疫苗进行了电位检测，结果显示其Zeta电位为（3.39±0.56）mV（图1B），可以降低脂质体疫苗的聚合从而增加其稳定性。通过透射电子显微镜检测发现，我们制备的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗形态规则、呈球形、分布均匀，且粒径大小为（120.0±12.1）nm (图1C)。通过测量不同时间的脂质体疫苗的粒径大小，结果发现放置在4 ℃冰箱的脂质体在7 d内粒径基本维持在120 nm，脂质体放置稳定性良好（图1D）。
图 1 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的表征
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通过完整剥离各组织移植瘤，我们可以直观看到，腹腔注射组比PBS空白对照组、皮下注射组其肿瘤体积更小（图2A）。同时，对各组移植瘤进行称重测量比较（P<0.01，图2B），腹腔注射组比PBS组及皮下注射组平均移植瘤重量更小，肿瘤生长抑制更加明显。由于结肠癌的大小与肿瘤微血管密度呈正相关性，通过对各组移植瘤H&E染色（图2C），发现与PBS组相比，腹腔注射组和皮下注射组在同一视野下肿瘤微血管密度更小，其中，腹腔注射组微血管密度最小。
图 2 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同途径注射对小鼠结肠癌生长的影响
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通过完整剥离各组脾脏，我们发现腹腔注射组小鼠的脾脏大于PBS组和皮下注射组（图3）。脾脏是机体重要的免疫器官，在机体抗肿瘤免疫反应中，其大小在一定程度上反应了机体抗肿瘤免疫反应应答强度和免疫水平。因此腹腔注射增强肿瘤RNA的机体抗肿瘤免疫反应的效果更加明显。
图 3 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同部位注射对小鼠脾脏大小的影响（n=5）
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实验结束后，完整剥离小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器并进行H&E染色（图4），结果显示，各组的主要脏器中没有出现异常的组织学改变，肿瘤RNA对机体毒性影响很小，安全性较高。
图 4 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗注射后小鼠各脏器的H&E 染色（10×）
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根据2020年全球统计的数据，1930万新增癌症病例中，结肠直肠癌占10.0%，位居第三。在近1000万癌症死亡相关病例中，结肠直肠癌占了9.4%，排在第二位[8]。同时，近10年间，结直肠癌的发病率在我国呈直线上升趋势。因此，我们迫切需要制订新的策略以治疗结直肠癌[9]。研究表明，肿瘤RNA携带有特异性肿瘤抗原，其肿瘤抗原无需检查，并且RNA序列进入宿主基因组内的危险性很小，是优质的肿瘤疫苗来源。此外，有进一步的研究证明，从CT26结肠癌细胞提取的肿瘤RNA可通过增强生物体抗肿瘤免疫来抑制结肠癌生长[1-3]。因此，不同部位注射负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗的抗肿瘤效果值得进一步探讨，为其后续的进一步应用提供理论基础。
纳米脂质体疫苗注射途径种类较多，如静脉注射、动脉注射、肌内注射、皮下注射、腹腔注射等方式[10-13]，研究证明，通过不同部位注射药物，其生物利用度也不同。本研究对移植瘤小鼠进行了不同部位肿瘤RNA纳米脂质体疫苗注射，并分析比较不同部位注射所产生的影响，结果显示，腹腔注射可以抑制肿瘤生长，值得注意的是，腹腔注射后的肿瘤更小、肿瘤微血管密度最低[14-15]，因此，腹腔注射抑制肿瘤生长的效果更加显著。根据相关研究，如果药物注射部位周围血液循环及淋巴液循环丰富，那么药物吸收路径较短，较少受到各种影响因素的干扰，会表现出更好的治疗效果，而腹腔中血液循环和淋巴循环分布较皮下更为丰富，因此腹腔注射表现出更好的治疗效果[16-18]。
此外，在本研究中，负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗的形状为球型体，粒径大小为（120.0±12.1）nm，Zeta电位为（3.39±0.36）mV。实验提示，肿瘤RNA纳米脂质体疫苗组能够引起机体免疫器官脾脏增大[19]，并和治疗效果呈正相关。同时在各治疗组及对照组的实验结束后，小鼠各个重要脏器未发生病理改变。所以腹腔注射是更适合肿瘤RNA纳米脂质体疫苗药物注射的途径，这与腹腔血液循环和淋巴循环更加丰富有关，使纳米级的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗能够更好更高效地被机体自身吸收利用，进而能够更有效地增强机体自身抗肿瘤免疫反应，并更有力地抑制肿瘤生长及发展。
综上，本研究对同等大小移植瘤小鼠进行了不同部位负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗注射的动物治疗实验。实验结果显示，相较于皮下注射，腹腔注射能够更加有效地提高机体抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。
Effect of different injection approaches of tumor RNA nanoliposome vaccine on the growth of colon cancer
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摘要:
目的 本研究旨在比较CT26肿瘤细胞RNA负载于纳米脂质体后，使用不同途径注射所引起的生物体抗肿瘤生长的作用差异。 方法 将提取的肿瘤RNA载入到纳米脂质体制备成肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，然后进行脂质体疫苗表征。肿瘤RNA纳米脂质体疫苗粒径为（120.0±12.1）nm，电位为（3.39±0.56）mV。最后在小鼠不同部位注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，检测分析不同部位注射对小鼠结肠癌移植瘤生长的影响。 结果 通过肿瘤RNA纳米脂质体疫苗对移植瘤小鼠进行不同途径注射治疗，结果显示，相比皮下注射，腹腔注射能够更加有效地增强生物体抗肿瘤免疫反应，抑制移植瘤生长。最后，比较小鼠重要脏器的H&E染色，均未见脏器有明显的器质性病变。 结论 通过腹腔注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗比皮下注射能够更加有效地增强机体抗肿瘤免疫反应。 Abstract:Objective To compare the differences in the anti-tumor growth effects of organisms with different injections of CT26 tumor cell RNA loaded into nanoliposomes. Methods The extracted tumor RNA was loaded into nanoliposomes to prepare tumor RNA nanoliposome vaccines, and the related properties of nanoliposome vaccines were investigated. The particle size of nanoliposome vaccines was （120.0±12.1）nm and zeta potential was （3.39±0.56）mV. Tumor RNA nanoliposome vaccines were injected into different parts of the mice to test and analyze the influence of different injections on the growth of colon cancer transplanted tumors in mice. Results Tumor RNA nanoliposome vaccines were used to inject tumor-transplanted mice in different ways. Compared with underarm injection, intraperitoneal injection enhanced the organism's anti-tumor immune response and inhibited the growth of transplanted tumors more effectively. The H&E staining of important organs in mice was compared and no obvious organic lesions were found in the organs. Conclusion Intraperitoneal injections of nanoliposome loaded with tumor RNA can enhance the body's anti-tumor immune response more effectively than underarm injections. -
Key words:
- CT26 colon cancer cells /
- nanoliposomes /
- vaccine /
- tumor RNA
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目前全球抑郁症的发病率为4.2%，中国已达6.9%，据世界卫生组织报道，抑郁症已成为导致人类死亡和致残的第二大类疾病[1]。百合知母汤始见于张仲景的《金匮要略•百合狐惑阴阳毒病脉证并治第三篇》，由知母和百合两味中药组成，两药配伍有养阴清热、除烦润燥之效，以润养心肺为大法，主治百合病[2]。百合病与现代医学的失眠多梦和抑郁症有很大关联[3]，而百合知母汤也已成为中医药治疗抑郁症、失眠、焦虑等精神神经性疾病的经典方药[4]。知百安神口服液来源于经典古方百合知母汤，按照方中百合与知母2∶1配比制备而成，在海军军医大学长征医院临床使用多年，用于抑郁症、失眠等症的治疗，疗效显著。本研究采用正交试验设计法，以主要成分芒果苷的含量为检测指标，对知百安神口服液制备工艺进行优化，并进行稳定性研究，为其质量控制、工业生产提供科学依据。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent，美国）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；CPA225D十万分之一天平（Sartorius，德国）；WL-901涡旋振荡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司，海门）；SK7200H型超声仪（科导超声仪器有限公司，上海）；SHH-250SD药物稳定性试验箱（重庆永生实验仪器厂，温度：15～65 ℃，±2 ℃，湿度：15%～95%，±5%）。
1.2 试药
知百安神口服液（中药材购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，口服液由海军军医大学长征医院制剂室制备）；芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111607-201503，含量98.4%）；甲醇、乙腈、二氯甲烷为色谱纯试剂（Merck，德国）；甲酸为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。
2. 方法与结果
2.1 芒果苷的含量测定
2.1.1 色谱条件
色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长为246 nm；流速1 ml/min；柱温30 ℃；进样量为5 μl。理论塔板数按芒果苷计算应不低于20 000。
表 1 梯度洗脱程序时间（t/min） A. 乙腈（%） B. 0.2%甲酸水溶液（%） 0 5 95 5 10 90 10 10 90 20 13 87 25 13 87 30 5 95 2.1.2 对照品溶液的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释制成每1 ml中含0.15 mg芒果苷的溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
精密量取知百安神口服液10 ml，用10 ml二氯甲烷萃取，震摇，静置，待完全分离。精密量取水相4 ml，加水定容至25 ml，经0.45 μm薄膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，用70%乙醇溶液溶解并稀释，制成每1 ml中含1.04 mg芒果苷的溶液，作为对照品母液，采用逐级稀释的方法，将芒果苷配制成208、156、104、78、52、26、10.4 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归分析，得回归方程为Y=16.56X−5.412（r=0.999 9），结果表明芒果苷在10.4～208 μg/ml范围内线性关系良好。
2.1.5 精密度试验
取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算得到芒果苷峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，计算得到芒果苷含量的RSD为0.72%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得到芒果苷含量的RSD为1.18%，结果表明该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验
精密量取知百安神口服液（批号：120208）6份，每份5 ml，分别加入104 μg/ml的芒果苷对照品溶液各5 ml，混匀，按照“2.1.3”项下方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定。计算得芒果苷的平均加样回收率为99.47%，RSD为0.86%，表明该方法准确度良好。
2.2 提取方法的选择
水提醇沉法是广泛应用于中药的提取方法，其操作方法简单，生产成本低廉，更适合于规模化生产。本实验依据大生产实际情况对制备工艺采用正交设计，拟对中药水醇提取法影响较大的因素即提取加水量、提取时间、提取次数和醇沉浓度为影响因素进行考察，但参照文献[5]发现，提取次数不适合加入到正交设计中，经过预实验结果并结合工艺化大生产能源等消耗考虑，确定提取次数为2次，可达到提取要求。因此，参照L9(34)设计正交试验，加水量为药材总量的6、10、12倍，提取时间为1、2、3 h，醇沉浓度为40%、60%、80%，以芒果苷的含量为检测指标，优选最佳提取工艺，见表2。
表 2 正交试验因素水平表水平 A因素加水量
（倍）B因素提取时间
（t/h）C因素醇沉浓度
（%）1 6 1 40 2 10 2 60 3 12 3 80 2.3 知百安神口服液正交试验结果
按处方称取各味药材共9份，按表2条件进行提取，按“2.1”项下方法进行含量测定，结果折合知百安神口服液芒果苷的含量（μg/ml），结果见表3。
表 3 正交试验结果编号 因素 芒果苷含量（μg/ml） A B C 1 1 1 1 371.58 2 1 2 2 453.26 3 1 3 3 282.74 4 2 1 2 504.40 5 2 2 3 300.59 6 2 3 1 370.01 7 3 1 3 440.91 8 3 2 1 293.82 9 3 3 2 381.15 K1 369.19 438.96 343.86 K2 391.67 349.22 446.27 K3 371.96 344.63 341.41 R 22.48 94.33 104.86 从正交试验结果可以看出，A、B、C三因素影响大小排序为C>B>A，即醇沉浓度为最大影响因素，经过极差分析并结合能源成本和工业操作的简便有效性，确定最佳工艺为A2B1C2，即10倍量水煎煮1 h，以60%醇浓度为醇沉浓度。
结合课题组前期研究和以上试验结果，知百安神口服液制备工艺的一般流程为：称取百合667 g、知母333 g，加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.24（50 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量达60%，4 ℃静置72 h，滤过，加单糖浆200 ml，加水至1000 ml，搅匀、煮沸、放冷、滤过、灌封、灭菌即得。
依据上述优化的工艺，于本院制剂室扩大生产，依据“2.1”项下芒果苷的测定方法对3批（批号：170406、180104、180713）中试产品进行测定，所测芒果苷的含量分别为780.9、657.7、621.0 μg/ml。
2.4 知百安神口服液稳定性研究
根据制剂稳定性试验指导原则（《中国药典》2020年版四部制剂通则9000）及口服溶液剂（《中国药典》2020年版四部制剂通则0123）有关规定，取3批知百安神口服液（批号：170406-1、170406-2、170406-3），在温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%的条件下放置6个月进行加速试验，于第0、1、2、3、6个月末分别取样，按稳定性重点考察项目检测。另取3批知百安神口服液（批号：170406、180104、180713），在温度（25±2）℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置12个月进行长期试验，分别于第0、3、6、9、12个月取样，按稳定性重点考察项目进行检测。稳定性加速试验和长期试验结果提示，知百安神口服液在12个月内稳定。结果见表4、表5。
表 4 知百安神口服液稳定性加速试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406-1 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 1个月 棕褐色液体 4.34 1.09 660.9 2个月 棕褐色液体 4.45 1.08 654.1 3个月 棕褐色液体 4.24 1.07 531.2 6个月 棕褐色液体 4.46 1.05 456.8 170406-2 0个月 棕褐色液体 4.31 1.09 750.0 1个月 棕褐色液体 4.64 1.08 630.5 2个月 棕褐色液体 4.35 1.08 588.8 3个月 棕褐色液体 4.54 1.08 541.9 6个月 棕褐色液体 4.59 1.07 406.1 170406-3 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 789.1 1个月 棕褐色液体 4.19 1.09 671.3 2个月 棕褐色液体 4.13 1.07 611.9 3个月 棕褐色液体 4.39 1.06 500.6 6个月 棕褐色液体 4.56 1.05 438.9 表 5 知百安神口服液稳定性长期试验结果批号 检查项目 考察时间 性状 pH值 相对密度 芒果苷含量
（μg/ml）170406 0个月 棕褐色液体 4.30 1.08 780.9 3个月 棕褐色液体 4.91 1.08 667.9 6个月 棕褐色液体 4.71 1.07 604.8 9个月 棕褐色液体 4.24 1.06 540.6 12个月 棕褐色液体 4.15 1.04 434.0 180104 0个月 棕褐色液体 4.60 1.09 657.7 3个月 棕褐色液体 4.64 1.08 603.4 6个月 棕褐色液体 4.57 1.08 432.0 9个月 棕褐色液体 4.77 1.06 354.0 12个月 棕褐色液体 4.69 1.05 352.0 180713 0个月 棕褐色液体 4.43 1.09 621.0 3个月 棕褐色液体 5.09 1.08 703.2 6个月 棕褐色液体 4.70 1.08 524.0 9个月 棕褐色液体 4.69 1.07 483.1 12个月 棕褐色液体 4.78 1.07 439.9 3. 讨论
本课题组在前期研究工作中对知百安神口服液的质量标准进行了系统研究[6]，笔者选取芒果苷作为工艺研究的指标及所用芒果苷的含量测定方法，即以前期研究工作为基础进行。
前期工作中发现，随着放置时间的延长，该口服液的pH值变化较大，发现原因是口服液瓶盖中的胶塞材质为天然橡胶，天然橡胶塞长时间与药液接触会对药液pH值产生影响，更换为硅胶塞后，稳定性试验结果显示口服液的pH值可保持稳定，本研究中采用的均为更换后的现行包装。
文献报道[7]芒果苷可能受溶液pH值和温度的影响而不稳定，知百安神口服液的稳定性试验结果也证实了这点。从结果可以看出，芒果苷在水溶液的状态下，3个月内含量可稳定在10%以内，超过3个月会加速降解。《中国药典》2020年版对知母含量测定要求是检测芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量，但知母皂苷BⅡ需要应用蒸发光散射检测器检测，由于蒸发光散射检测器的检测误差较大，并不适用于制剂工艺考察。考虑到芒果苷是知百安神口服液的主要成分[6]，且制剂工艺考察周期并不长（不超过1个月），芒果苷又利于快速便捷检测，因此，选择芒果苷作为指标成分，优化知百安神口服液的提取工艺，而利用稳定性考察结果制订制剂的有效期则需考察多种检验因素，还需进一步研究。
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图 1 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的表征
A.CT26肿瘤RNA的测定; B.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的电位测定; C.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗在不同放大倍数下的透射电镜图; D.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗在4 ℃冰箱放置1、3、5、7 d的粒径变化情况(n=5)
图 2 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同途径注射对小鼠结肠癌生长的影响
A.不同注射途径下完整剥离的小鼠结直肠癌移植瘤结果（n=5）;B. 不同注射途径注射肿瘤RNA脂质体疫苗小鼠肿瘤重量结果（n=5），**P<0.05，与PBS组比较; C. 不同注射途径下肿瘤微血管的H&E染色（10×）
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