下载:
-
肿瘤RNA是目前已知肿瘤疫苗的来源之一[1-2]。先前的研究表明，从CT26结肠癌细胞提取的肿瘤RNA可以通过增强机体抗肿瘤免疫来抑制肿瘤生长[3]，但由于肿瘤RNA易降解、不稳定等特性，需要载体对其包裹后实施注射，从而发挥其抗肿瘤作用[4]。研究证实，纳米脂质体载体具有较强的稳定性，可有效地包裹RNA，并在体内和体外递送核酸，发挥核酸诱导或抑制细胞表达的作用[5-7]。然而，机体不同部位对药物的吸收情况不同，因此，导致药物吸收转化的效果产生差异。为了比较不同部位注射对药物治疗效果的影响，本研究从CT26结肠癌细胞中提取肿瘤RNA，并使用纳米脂质体对其进行包裹制备成纳米脂质体疫苗，分析了不同部位注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗所产生的增强机体抗肿瘤反应的情况。
-
R205B旋转蒸发器（上海申科科技有限公司）；610000-1EA型薄膜挤出器（美国Avanti公司）；必能信Sonifier®450D超声波粉碎仪（美国必能信公司）；马尔文粒径仪（英国马尔文仪器公司）；透射电子显微镜 JEM2100F（日本JEOL公司）；染色封片工作一体机（胶带）Prisma+ Film（日本樱花公司）。
-
(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺硫酸盐((N-1-(2, 3-dioleoyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulfate, DOTAP)（美国Avanti Polar Lipids公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxy(polyethylene glycol)-2000) (sodium salt), DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid)（美国Avanti公司）；鱼精蛋白、小牛胸腺DNA（美国Sigma公司）；胆固醇（上海麦克林生化科技有限公司）；氯仿（中国医药集团有限公司）；DEPC水（碧云天生物技术有限公司）；TRIzol RNA 分离试剂（美国Thermo公司）；CT26小鼠结肠癌细胞系（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），SPF 级 BALB/c 雄性小鼠（上海吉辉实验动物饲养有限公司），饲养于屏障系统中。
-
首先取胆固醇、DOTAP两种材料的氯仿溶液，将二者以1∶1 (m∶m)的比例加入到250 ml的茄型瓶中，随后再加入4 ml氯仿溶液。在真空、45 ℃及100 r/min条件下旋转蒸发45 min，再加入3 ml DEPC水，在45 ℃及100 r/min条件下旋转蒸发45 min，获得脂质体混悬液。先进行超声20 min，再先后通过聚碳酸酯膜（100、50 nm），反复挤出各20次，即得DOTAP/Chol纳米脂质体。
-
取长满培养皿的CT26细胞，倒去培养基，加入3 ml无菌PBS溶液，并轻晃几下进行清洗，然后按照TRIzol™ Reagent 操作说明提取RNA。提取完成后，将核酸溶液用NanoDrop 2000测A值、浓度和纯度。将检测完成后的核酸溶液分装至1.5 ml EP管中，随后放入液氮中保存。
-
准备DOTAP/Chol 脂质体疫苗63 μl，鱼精蛋白12 μl（2 μg/μl）和DEPC水10 μl，将上述材料混合，于室温放置 10 min，得到DOTAP/Chol 脂质体和鱼精蛋白的混合物，在45～50 ℃的范围内水浴加热1～2 min。准备肿瘤RNA 45 μl(0.5 μg/μl)，小牛胸腺 DNA 1.2 μl(10 μg/μl)和DEPC 处理水30 μl，将以上材料混合，并室温放置10 min，得到肿瘤RNA与小牛胸腺DNA 的核酸聚合物，将DSPE-PEG(2000) Carboxylic Acid 3.2 μl(10 μg/μl)加入到 RNA/DNA 聚合物中，在45～50 ℃的范围内水浴加热1～2 min，得到RNA/DNA/PEG 复合物。将纳米脂质体/鱼精蛋白复合物加入到 RNA/DNA/PEG 复合物中，常温放置 10 min。最后将混合物放入 55 ℃的环境中静置10 min，然后在常温环境中静置 10 min，即可得肿瘤RNA纳米脂质体疫苗。
-
稀释肿瘤RNA纳米脂质体疫苗至适当浓度，取1 ml进行粒径检测。选择干净的样品池，取肿瘤RNA纳米脂质体疫苗溶液小心加入，在加入的同时避免气泡产生。把样品池放入进样样品槽中，然后进行粒径检测。对于脂质体放置稳定性试验，将脂质体放置于4 ℃，在第1、3、5、7天取样测量粒径。
-
将10 μl的脂质体疫苗溶液缓慢滴加在铜网上，在室温下彻底风干。随后滴加2%磷钨酸溶液，并使用滤纸吸干多余液体，后在室温下彻底干燥。之后将检测铜网放置在透射电镜下进行观察。
-
实验开始后，取对数生长期的CT26细胞，计数为1×106/ml，在小鼠右侧背部近腋窝处接种，每只小鼠皮下接种CT26细胞100 μl（1×105个/只），构建小鼠结肠癌移植瘤模型。接种1周后按照实验方案接种相应脂质体疫苗溶液，频率为每7 天一次，一共3次。其中，PBS 组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠腹腔注射200 μl的 PBS 作为空白对照。肿瘤RNA纳米脂质体疫苗腹腔注射组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠腹腔注射200 μl的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，注射频率为每7 天一次，共注射 3 次；肿瘤RNA纳米脂质体疫苗皮下注射组（n=5）的小鼠进行常规饲养，每只小鼠左侧皮下注射200 μl的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，频率为每7 天一次，共注射3 次；当肿瘤体积达到2 000 mm3时处死小鼠，并提取实验小鼠各项指标进行分析。
-
动物实验结束后，将小鼠处死，之后将移植瘤肿瘤团块完全剥离，小心去除肿瘤周围的结缔组织和血管，使用PBS浸泡清洗干净后，使用干净滤纸将水吸干，浸没置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。同时，将各组实验小鼠处死后，将心、肝、脾、肺、肾完整剥离，去除结缔组织和血管，使用PBS浸泡清洗干净后，使用干净滤纸将水吸干，浸没置于4%多聚甲醛中以4 ℃保持。将需要处理的组织块放入合适的耐液氮的冰冻小盒中，将冰冻小盒缓缓放入液氮中，使其彻底浸没在液氮中，浸没约20 s左右，使组织块能够彻底冰冻成块。组织块冰冻成块后，取出冰冻块，快速使用已涂抹有冰冻包埋剂的塑料薄膜进行包封，然后将已经包封好的组织块和切片冻头放入冰箱进行保存备用，冰箱温度设置为−80 ℃。按照冰冻切片机器操纵要求进行冰冻切片，切片厚度控制在20～30 μm左右，然后，将切片样品放入−20 ℃的冰箱进行保存。使用染色封片工作一体机（胶带）Prisma+ Film，按照操作说明进行染色及封片操作。使用数字切片扫描系统 PRECICE 500进行图像采集分析。
-
所有数据均以（
$\bar x $ ±s）表示，统计分析软件使用GraphPad Prism Version 9 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)，组间差异采用t检验，P<0.05时表示差异有统计学意义。 -
将从CT26细胞中提取的RNA使用NanoDrop 2000进行检测，OD260/OD280为2.04（图1A），OD260/OD230为1.96，符合RNA需达到OD260/OD280>2.0，1.8<OD260/OD230<2.2的要求，且浓度达到1762.1 ng/ml，满足后续实验需要。制备肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，通过马尔文激光粒度测定仪对肿瘤RNA纳米脂质体疫苗进行了电位检测，结果显示其Zeta电位为（3.39±0.56）mV（图1B），可以降低脂质体疫苗的聚合从而增加其稳定性。通过透射电子显微镜检测发现，我们制备的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗形态规则、呈球形、分布均匀，且粒径大小为（120.0±12.1）nm (图1C)。通过测量不同时间的脂质体疫苗的粒径大小，结果发现放置在4 ℃冰箱的脂质体在7 d内粒径基本维持在120 nm，脂质体放置稳定性良好（图1D）。
图 1 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的表征
-
通过完整剥离各组织移植瘤，我们可以直观看到，腹腔注射组比PBS空白对照组、皮下注射组其肿瘤体积更小（图2A）。同时，对各组移植瘤进行称重测量比较（P<0.01，图2B），腹腔注射组比PBS组及皮下注射组平均移植瘤重量更小，肿瘤生长抑制更加明显。由于结肠癌的大小与肿瘤微血管密度呈正相关性，通过对各组移植瘤H&E染色（图2C），发现与PBS组相比，腹腔注射组和皮下注射组在同一视野下肿瘤微血管密度更小，其中，腹腔注射组微血管密度最小。
图 2 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同途径注射对小鼠结肠癌生长的影响
-
通过完整剥离各组脾脏，我们发现腹腔注射组小鼠的脾脏大于PBS组和皮下注射组（图3）。脾脏是机体重要的免疫器官，在机体抗肿瘤免疫反应中，其大小在一定程度上反应了机体抗肿瘤免疫反应应答强度和免疫水平。因此腹腔注射增强肿瘤RNA的机体抗肿瘤免疫反应的效果更加明显。
图 3 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同部位注射对小鼠脾脏大小的影响（n=5）
-
实验结束后，完整剥离小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器并进行H&E染色（图4），结果显示，各组的主要脏器中没有出现异常的组织学改变，肿瘤RNA对机体毒性影响很小，安全性较高。
图 4 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗注射后小鼠各脏器的H&E 染色（10×）
-
根据2020年全球统计的数据，1930万新增癌症病例中，结肠直肠癌占10.0%，位居第三。在近1000万癌症死亡相关病例中，结肠直肠癌占了9.4%，排在第二位[8]。同时，近10年间，结直肠癌的发病率在我国呈直线上升趋势。因此，我们迫切需要制订新的策略以治疗结直肠癌[9]。研究表明，肿瘤RNA携带有特异性肿瘤抗原，其肿瘤抗原无需检查，并且RNA序列进入宿主基因组内的危险性很小，是优质的肿瘤疫苗来源。此外，有进一步的研究证明，从CT26结肠癌细胞提取的肿瘤RNA可通过增强生物体抗肿瘤免疫来抑制结肠癌生长[1-3]。因此，不同部位注射负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗的抗肿瘤效果值得进一步探讨，为其后续的进一步应用提供理论基础。
纳米脂质体疫苗注射途径种类较多，如静脉注射、动脉注射、肌内注射、皮下注射、腹腔注射等方式[10-13]，研究证明，通过不同部位注射药物，其生物利用度也不同。本研究对移植瘤小鼠进行了不同部位肿瘤RNA纳米脂质体疫苗注射，并分析比较不同部位注射所产生的影响，结果显示，腹腔注射可以抑制肿瘤生长，值得注意的是，腹腔注射后的肿瘤更小、肿瘤微血管密度最低[14-15]，因此，腹腔注射抑制肿瘤生长的效果更加显著。根据相关研究，如果药物注射部位周围血液循环及淋巴液循环丰富，那么药物吸收路径较短，较少受到各种影响因素的干扰，会表现出更好的治疗效果，而腹腔中血液循环和淋巴循环分布较皮下更为丰富，因此腹腔注射表现出更好的治疗效果[16-18]。
此外，在本研究中，负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗的形状为球型体，粒径大小为（120.0±12.1）nm，Zeta电位为（3.39±0.36）mV。实验提示，肿瘤RNA纳米脂质体疫苗组能够引起机体免疫器官脾脏增大[19]，并和治疗效果呈正相关。同时在各治疗组及对照组的实验结束后，小鼠各个重要脏器未发生病理改变。所以腹腔注射是更适合肿瘤RNA纳米脂质体疫苗药物注射的途径，这与腹腔血液循环和淋巴循环更加丰富有关，使纳米级的肿瘤RNA纳米脂质体疫苗能够更好更高效地被机体自身吸收利用，进而能够更有效地增强机体自身抗肿瘤免疫反应，并更有力地抑制肿瘤生长及发展。
综上，本研究对同等大小移植瘤小鼠进行了不同部位负载肿瘤RNA的纳米脂质体疫苗注射的动物治疗实验。实验结果显示，相较于皮下注射，腹腔注射能够更加有效地提高机体抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。
Effect of different injection approaches of tumor RNA nanoliposome vaccine on the growth of colon cancer
-
摘要:
目的 本研究旨在比较CT26肿瘤细胞RNA负载于纳米脂质体后，使用不同途径注射所引起的生物体抗肿瘤生长的作用差异。 方法 将提取的肿瘤RNA载入到纳米脂质体制备成肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，然后进行脂质体疫苗表征。肿瘤RNA纳米脂质体疫苗粒径为（120.0±12.1）nm，电位为（3.39±0.56）mV。最后在小鼠不同部位注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗，检测分析不同部位注射对小鼠结肠癌移植瘤生长的影响。 结果 通过肿瘤RNA纳米脂质体疫苗对移植瘤小鼠进行不同途径注射治疗，结果显示，相比皮下注射，腹腔注射能够更加有效地增强生物体抗肿瘤免疫反应，抑制移植瘤生长。最后，比较小鼠重要脏器的H&E染色，均未见脏器有明显的器质性病变。 结论 通过腹腔注射肿瘤RNA纳米脂质体疫苗比皮下注射能够更加有效地增强机体抗肿瘤免疫反应。 Abstract:Objective To compare the differences in the anti-tumor growth effects of organisms with different injections of CT26 tumor cell RNA loaded into nanoliposomes. Methods The extracted tumor RNA was loaded into nanoliposomes to prepare tumor RNA nanoliposome vaccines, and the related properties of nanoliposome vaccines were investigated. The particle size of nanoliposome vaccines was （120.0±12.1）nm and zeta potential was （3.39±0.56）mV. Tumor RNA nanoliposome vaccines were injected into different parts of the mice to test and analyze the influence of different injections on the growth of colon cancer transplanted tumors in mice. Results Tumor RNA nanoliposome vaccines were used to inject tumor-transplanted mice in different ways. Compared with underarm injection, intraperitoneal injection enhanced the organism's anti-tumor immune response and inhibited the growth of transplanted tumors more effectively. The H&E staining of important organs in mice was compared and no obvious organic lesions were found in the organs. Conclusion Intraperitoneal injections of nanoliposome loaded with tumor RNA can enhance the body's anti-tumor immune response more effectively than underarm injections. -
Key words:
- CT26 colon cancer cells /
- nanoliposomes /
- vaccine /
- tumor RNA
-
隐丹参酮（CTS）是中药丹参的有效成分之一，国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性，具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性，近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰，期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物，从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。
1. 隐丹参酮抗肿瘤作用
1.1 抑制肿瘤细胞增殖
癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明，CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖，包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现，CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]。
1.3 抑制细胞迁移和侵袭
高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征，转移是癌症死亡的主要原因。因此，抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现，CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外，CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]。
1.4 调节机体免疫功能
隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长，还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现，隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用，抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外，隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟，促进抗原提呈功能，进而诱导T细胞活化增殖，抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 （TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移，相反，M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现，隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化，从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]。
1.5 逆转多重耐药
耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明，CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11]，改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外，CTS还可以逆转P-糖蛋白（p-gp）过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]。
1.6 合并用药可增强不同抗癌药物的作用
除了具有以上活性之外，CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如，CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现，CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]。
1.7 自噬
自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径，是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示，CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]。
2. 抗肿瘤作用机制
CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，以及调节免疫等作用的机制十分广泛，涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。
2.1 调控STAT3信号通路
STAT3由Janus激酶（JAKs)激活，参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活，异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后，STAT3被激活，单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，调节其靶基因的表达，例如，上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达，下调 p53表达，促进肿瘤细胞增殖和存活；上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达，促进肿瘤转移；上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达，下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达，抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现，CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合，特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，抑制STAT3二聚化[18-19]，相比之下，姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中，CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用[21]。另外，CTS作为p-STAT3抑制剂，能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化，抑制肿瘤增殖，逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外，CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移，其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3（SIRT3）是一种蛋白质去乙酰化酶，参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明，抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要，且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。
2.2 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2
含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）由基因PTPN11编码，PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现，肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导，调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明，CTS能与SHP2直接结合，是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L，抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后，CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低，提示SHP2是CTS的一个靶点，但是，CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长，说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外，有研究发现，CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性，抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]。
2.3 调控 topo 2a水平
DNA拓扑异构酶 （topos），包括DNA拓扑异构酶1（topo1）和DNA拓扑异构酶2（topo2），其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明，CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平，并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]。
2.4 调控活性氧水平
活性氧与肿瘤的发展密切相关，其过度产生可诱导多种生物学效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现，CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积，通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30]；通过ROS-线粒体途径，上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31]；诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生，激活JNK/p-38，抑制Erk1/2，导致细胞凋亡[32]；刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生，诱导p38 MAPK激活，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中，最终导致自噬发生[15]；刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS，激活内质网（ER）应激，增强不同抗癌药物或细胞因子（Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU）诱导的细胞凋亡[33]。
2.5 调控雌、雄激素受体信号
雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性，从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34]；在异种移植动物模型中，CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外，CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长，通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36]；同时，CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号，发挥抗肿瘤作用[37]。
2.6 PI3K/AKT信号通路
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路，增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达，降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明，CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外，有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号，抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中，CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长，其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。
3. 隐丹参酮衍生物抗肿瘤活性
CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性，但是其药理作用中等，疏水性强且难吸收，口服生物利用度只有2.1%，这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来，针对CTS存在的问题，人们尝试对CTS进行结构改造，期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂，通过对CTS及其骨架类似物进行修饰，设计合成了CTS衍生物62个，其中新化合物46个，通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS，IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略，设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6，该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L，能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上，LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移，促进凋亡，体内可抑制结肠癌的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性，Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物，结果发现这些衍生物比CTS更易溶解，同时保留了CTS的生物活性，其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]。
4. 结论
CTS具有广谱的抗肿瘤活性，该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，逆转耐药性，诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外，CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化，间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明，CTS可直接结合STAT3和SHP2，有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路，而不抑制STAT家族中的其他蛋白，是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用，但不是特异性STAT3抑制剂，例如姜黄素，是一种STAT抑制剂，但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性，但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此，基于靶点STAT3，以CTS作为先导化合物，设计并合成一系列CTS衍生物，有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。
-
图 1 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的表征
A.CT26肿瘤RNA的测定; B.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗的电位测定; C.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗在不同放大倍数下的透射电镜图; D.肿瘤RNA纳米脂质体疫苗在4 ℃冰箱放置1、3、5、7 d的粒径变化情况(n=5)
图 2 肿瘤RNA纳米脂质体疫苗不同途径注射对小鼠结肠癌生长的影响
A.不同注射途径下完整剥离的小鼠结直肠癌移植瘤结果（n=5）;B. 不同注射途径注射肿瘤RNA脂质体疫苗小鼠肿瘤重量结果（n=5），**P<0.05，与PBS组比较; C. 不同注射途径下肿瘤微血管的H&E染色（10×）
-
[1] SAYOUR E J, MENDEZ-GOMEZ H R, MITCHELL D A. Cancer vaccine immunotherapy with RNA-loaded liposomes[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(10). DOI: 10.3390/ijms19102890. [2] NAIR S K, MORSE M, BOCZKOWSKI D, et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells[J]. Ann Surg,2002,235(4):540-549. doi: 10.1097/00000658-200204000-00013 [3] NAKA T, IWAHASHI M, NAKAMURA M, et al. Tumor vaccine therapy against recrudescent tumor using dendritic cells simultaneously transfected with tumor RNA and granulocyte macrophage colony-stimulating factor RNA[J]. Cancer Sci,2008,99(2):407-413. doi: 10.1111/j.1349-7006.2007.00698.x [4] MITCHELL D A, NAIR S K. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy[J]. J Clin Invest,2000,106(9):1065-1069. doi: 10.1172/JCI11405 [5] POWELL D, CHANDRA S, DODSON K, et al. Aptamer-functionalized hybrid nanoparticle for the treatment of breast cancer[J]. Eur J Pharm Biopharm,2017,114:108-118. doi: 10.1016/j.ejpb.2017.01.011 [6] LI S D, HUANG L. Targeted delivery of antisense oligodeoxynucleotide and small interference RNA into lung cancer cells[J]. Mol Pharm,2006,3(5):579-588. doi: 10.1021/mp060039w [7] VEMANA H P, SARASWAT A, BHUTKAR S, et al. A novel gene therapy for neurodegenerative Lafora disease via EPM2A-loaded DLinDMA lipoplexes[J]. Nanomedicine (Lond),2021,16(13):1081-1095. doi: 10.2217/nnm-2020-0477 [8] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660 [9] XIE Y, SHI L, HE X, et al. Gastrointestinal cancers in China, the USA, and Europe[J]. Gastroenterol Rep (Oxf),2021,9(2):91-104. [10] MEI K C, LIAO Y P, JIANG J, et al. Liposomal delivery of mitoxantrone and a cholesteryl indoximod prodrug provides effective chemo-immunotherapy in multiple solid tumors[J]. ACS Nano,2020,14(10):13343-13366. doi: 10.1021/acsnano.0c05194 [11] CHAUDHARY S, GARG T, MURTHY R S, et al. Recent approaches of lipid-based delivery system for lymphatic targeting via oral route[J]. J Drug Target,2014,22(10):871-882. doi: 10.3109/1061186X.2014.950664 [12] AHMADPOUR E, SARVI S, HASHEMI SOTEH M B, et al. Enhancing immune responses to a DNA vaccine encoding Toxoplasma gondii GRA14 by calcium phosphate nanoparticles as an adjuvant[J]. Immunol Lett,2017,185:40-47. doi: 10.1016/j.imlet.2017.03.006 [13] ISHITSUKA T, AKITA H, HARASHIMA H. Functional improvement of an IRQ-PEG-MEND for delivering genes to the lung[J]. J Control Release,2011,154(1):77-83. [14] KAWASAKI K, EIZUKA M, KUDARA N, et al. Mesenteric phlebosclerosis complicating colonic cancer treated by endoscopic submucosal dissection[J]. Clin J Gastroenterol,2020,13(6):1183-1188. doi: 10.1007/s12328-020-01205-5 [15] ELEZOĞLU B, TOLUNAY S. The relationship between the stromal mast cell number, microvessel density, c-erbB-2 staining and survival and prognostic factors in colorectal carcinoma[J]. Turk Patoloji Derg,2012,28(2):110-118. [16] MATUCCI A, VULTAGGIO A, DANESI R. The use of intravenous versus subcutaneous monoclonal antibodies in the treatment of severe asthma: a review[J]. Respir Res,2018,19(1):154. [17] KISHIMOTO S, ISHIHARA M, NAKAMURA S, et al. Fragmin/protamine microparticles to adsorb and protect HGF and to function as local HGF carriers in vivo[J]. Acta Biomater,2013,9(1):4763-4770. [18] KAGAN L, GERSHKOVICH P, MENDELMAN A, et al. The role of the lymphatic system in subcutaneous absorption of macromolecules in the rat model[J]. Eur J Pharm Biopharm,2007,67(3):759-765. doi: 10.1016/j.ejpb.2007.04.002 [19] ZHANG Q S, XIE C, WANG D Y, et al. Improved antitumor efficacy of combined vaccine based on the induced HUVECs and DC-CT26 against colorectal carcinoma[J]. Cells,2019,8(5):494. doi: 10.3390/cells8050494 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 5208
- HTML全文浏览量: 1839
- PDF下载量: 23
- 被引次数: 0
