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在全球范围内，乳腺癌是女性癌症死亡的主要原因，2018年约有210万女性疑似患有乳腺癌，占女性癌症的25%[1]。在我国，乳腺癌在女性肿瘤中发病率居首位，死亡率居第5位，近几十年来乳腺癌负担迅速增长[2]。目前，雌激素敏感的乳腺癌患者主要以内分泌治疗为主，然而，缺乏激素受体的乳腺癌细胞通常使用化疗药物，如紫杉醇和阿霉素[3]。但是，化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞均表现出毒性反应，这限制了其临床应用。此外，细胞毒等抗肿瘤药物表现出的细胞耐药性进一步限制其应用。因此，迫切需要寻找毒性较小、效果较好的治疗药物。
五味子乙素（schisandrin B, Sch B）是从五味子中提取的主要活性成分[4]。据报道[5]，Sch B可通过抑制NF-κB激活及MAPK/ Erk/p38/c-Jnk信号通路激活而有效减轻炎症反应，NASSER等[6]发现，Sch B可通过抑制PI3K/AKT和STA3/JAK2信号通路磷酸化，从而降低细胞内ROS的产生发挥抗前列腺癌作用，Wang等[7]发现，Sch B可通过TGF-b信号通路靶向miR-101-5p抑制大鼠肝纤维化。Dai等[8]发现，Sch B可通过STAT3的磷酸化和核转位发挥抗乳腺癌活性，但是Sch B 如何影响乳腺癌细胞增殖凋亡能力及具体机制尚不清楚。本研究以Sch B为研究对象，探讨其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其作用机制。
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人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(中科院细胞库，目录号：SCSP-5043)；甘草查尔酮A(纯度≥98%，批号76296-75-6，上海麦克林生化科技有限公司)；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、JC-1荧光探针、DCFH-DA荧光探针、Hoechst 33342 染色剂、PBS（大连美仑生物）；1640培养基、胎牛血清( FBS) （美国HyClone公司）；ECL发光液、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)；Bcl-2、Bax、CHOP、GPR78、ATF4、PERK、p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、β-actin、二抗(美国 Cell Signaling Technology公司)。
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人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素及100 U/ml青霉素的L-15培养基中，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱培养，细胞2～3 d可传代培养。Sch B药物处理时，首先取生长状态良好的对数期细胞进行实验，细胞分为对照组和药物组，根据细胞存活率检测结果计算IC50，药物组分为Sch B低剂量组剂量（1/2倍IC50），Sch B中剂量组（1倍IC50），Sch B高剂量组（2倍IC50）。
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取状态良好的对数期MDA-MB-231细胞，以8×103/100 μl细胞密度接种于96孔板，于37 ℃，5% CO2培养箱培养过夜。将细胞分为空白组（含培养基，不含细胞）、对照组（含培养基，含细胞，不含药物）和药物处理组，药物处理组分别以终浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L的Sch B处理细胞24 h，每组3个复孔。24 h后每孔加入CCK-8溶液(10 μl), 于培养箱继续培养1 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度（OD）值，计算细胞存活率，并计算药物IC50值。
细胞存活率=[(OD药物−OD空白)/(OD对照−OD空白)]×100%
细胞克隆形成分析：取生长良好的对数期MDA-MB-231细胞，消化成单细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种于6孔板，轻轻摇动使细胞分散均匀，过夜贴壁。分为对照组和药物组，对照组加等体积的培养基，药物组分别加以终浓度为（10、20、40 μmol/L）Sch B培养基，置培养箱中培养14 d。然后用PBS清洗2次，室温下用4%多聚甲醛固定15 min，1%结晶紫染色10 min。显微镜观察克隆形成情况，观察3个视野中克隆数量。
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将生长良好的对数期MDA-MB-231细胞，以每孔2.5×105个/ml细胞密度接种于6孔板，置培养箱过夜培养。待细胞贴壁后，分别将终浓度为10、20、40 μmol/L的Sch B处理24 h。用不含EDTA胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，结合缓冲液（100 μl）重悬细胞，转入流式管，然后再分别加入Annexin V-FITC（5 μl）和PI染液（5 μl），室温孵育15 min（避光），最后加入结合缓冲液（400 μl）混匀，流式仪上机检测，Flow Jo软件处理数据。
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将生长良好的对数期MDA-MB-231细胞，以1×105个/ml细胞密度接种于12孔板，置培养箱过夜培养。待细胞贴壁后，分别将终浓度为10、20、40 μmol/L的Sch B处理24 h。DCFH-DA染液用PBS 1∶1000稀释成工作液，每孔加入200 μl工作液，37 ℃培养箱中避光孵育30 min，PBS洗涤2次，倒置荧光显微镜拍照，Image J软件检测荧光强度。
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将生长良好的对数期MDA-MB-231细胞，以2.5×105个/ml细胞密度接种于6孔板，于培养箱过夜培养。待细胞贴壁后，将细胞依次分为对照组和药物组，对照组细胞加等体积培养基，药物组分别加终浓度为10、20、40 μmol/L的Sch B及加或者不加活性氧(ROS)清除剂（NAC）5 mmol/L, 内质网应激抑制剂4-PBA 2 mmol/L处理24 h。用RIPA（含PMSF蛋白酶抑制剂）裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液金属浴（100 ℃）使蛋白变性。20 μg蛋白样品经PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，孵育一抗（4 ℃冰箱过夜），1×TBST洗涤3次，二抗室温孵育2 h，采用ECL显影液显色，凝胶成像系统拍照，Image J软件分析。
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数据采用GraphPad软件进行分析，以
$ \bar{x}\pm s $ 表示。组间比较采用t检验和单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。 -
图1结果显示，与对照组比较，随着药物浓度增大，细胞存活率下降，其IC50为19.16 μmol/L，故选择1/2倍IC50（10 μmol/L），1倍IC50（20 μmol/L），2倍IC50（40 μmol/L）3个剂量进行后续实验。细胞克隆实验结果显示，随着药物浓度增大，细胞克隆形成显著被抑制，且呈现剂量依赖关系，差异具有统计学意义(P<0.05)。
图 1 五味子乙素对MDA-MB-231细胞存活增殖的影响
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流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，Sch B（10、20、40 μmol/L）均可诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖，具有统计意义（P<0.05）。Western blot法检测结果显示，与对照组比较，Sch B（10、20、40 μmol/L）使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，促凋亡蛋白Bax的表达显著升高( P<0.05)，结果见图2。
图 2 五味子乙素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
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DCF-DA染色结果显示，与对照组比较，Sch B（10、20、40 μmol/L）组绿色荧光逐渐增强，显示细胞内ROS水平增高，且呈剂量依赖，差异有统计学意义(P<0.05)，活性氧清除剂NAC（5 mmol/L）预处理2 h可显著抑制由Sch B导致的细胞内ROS增多(P<0.05)，结果见图3。
图 3 五味子乙素对MDA-MB-231细胞内活性氧（ROS）水平的影响
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异常内质网应激可引起细胞凋亡，Western blot 法检测结果显示，与对照组比较，Sch B（10、20、40 μmol/L）分别使内质网应激相关蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α表达增多且呈剂量依赖，差异有统计学意义(P<0.05)，内质网应激抑制剂4-PBA（2 mmol/L）预处理2 h，可显著抑制由Sch B引起的内质网应激，使内质网应激相关蛋白CHOP、GPR78、p-eIF2α表达降低(P<0.05)，结果见图4。
图 4 五味子乙素对MDA-MB-231细胞内质网应激的影响
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上述结果表明Sch B可以使细胞内ROS升高，Sch B也可以使内质网应激诱导细胞凋亡。为了验证ROS升高与内质网应激之间的联系，MDA-MB-231用ROS清除剂NAC（5 mmol/L）预处理2 h，结果显示，NAC可逆转由Sch B引起的内质网应激，使内质网应激相关蛋白CHOP，GPR78，p-eIF2α显著降低(P<0.05)，进一步实验证明， 5 mmol/L NAC可逆转由Sch B引起的细胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著升高，促凋亡蛋白Bax的表达显著降低(P<0.05)，结果见图5。
图 5 ROS对MDA-MB-231细胞内质网应激及凋亡的影响
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乳腺癌是临床上特别常见的恶性肿瘤，每年的发病率和死亡率都在增加，其发生发展是一个复杂的病理过程，是不受控制的细胞增殖和抵抗凋亡的结果[9]。尽管癌症研究领域取得了相当大的进展，但由于对化疗耐药和高复发率，乳腺癌的总体生存率仍然不令人满意，因此，大量的研究都集中在发现新的有效的治疗乳腺癌的候选药物中[10]。从植物中提取的天然化合物具有更有效和更少的副作用被认为是抗癌药物的重要来源。
ROS在细胞存活和死亡中起着关键作用。在正常生理条件下，适当水平的ROS有助于细胞存活。然而，过量的ROS会导致细胞损伤和凋亡细胞死亡[11]。ROS作为不良刺激之一，可引起内质网功能障碍，诱导内质网应激，称为ROS介导的内质网应激[12]。在本研究中，MDA-MB-231细胞在与Sch B孵育前先经ROS清除剂NAC预处理。凋亡减轻，ROS生成减少，CHOP，GPR78和p-eIF2a表达下调，内质网应激减轻。这说明Sch B诱导的MDA-MB-231细胞内质网应激依赖性凋亡中，ROS是不可或缺的。
内质网是真核细胞中传导和提供蛋白质折叠环境的细胞器，因为它对刺激的敏感性会导致某种情况发生成为内质网应激，内质网应激被认为是应对内质网稳态失衡的各种细胞生物学生理和病理事件的一种高度保守的细胞防御机制，如抗癌药物诱导的细胞凋亡通路[13]。GPR78是调节内质网应激的关键因子，GPR78的激活增加了真核启动子2 alpha (eIF2α) 51位丝氨酸的磷酸化，从而抑制蛋白的合成，磷酸化的eIF2α促进活化转录因子4 (ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP) 的表达，CHOP是调节Bcl-2家族蛋白表达的关键促凋亡转录因子[14]。我们发现，Sch B可引起乳腺癌MDA-MB-231细胞内质网应激，CHOP，GPR78和 p-eIF2α蛋白水平呈剂量依赖性增加，当使用内质网抑制剂4-PBA后，内质网应激减轻。
综述所述，Sch B可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，其机制可能与增加细胞内ROS水平，使p-eIF2α蛋白激活，GPR78和CHOP表达增多，引发细胞内质网应激有关。本研究可为乳腺癌的辅助治疗提供一定的实验依据。
Schisandrin B induces apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells through ROS mediated endoplasmic reticulum stress
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摘要:
目的 研究五味子乙素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其作用机制。 方法 用细胞计数试剂(CCK-8)检测不同浓度五味子乙素对MDA-MB-231细胞存活率的影响；五味子乙素（10、20、40 μmol/L）作用 MDA-MB-231 细胞 24 h，分别用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡情况；用DCFA-DA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平；用Western blot法检测细胞凋亡及内质网应激相关蛋白（Bcl-2、Bax、CHOP、GPR78、PERK、p-PERK、p-eIF2α、eIF2）的表达。 结果 与空白组比较，随着五味子乙素浓度增大，细胞存活率明显降低，其IC50为19.16 μmol/L；与对照组比较，五味子乙素（10、20、40 μmol/L）均能抑制细胞克隆形成(P<0.05)，且呈剂量依赖；五味子乙素（10、20、40 μmol/L）均可诱导细胞凋亡（P<0.05），使抗凋亡蛋白BCL-2的表达显著降低，促凋亡蛋白Bax的表达显著升高(P<0.05)；五味子乙素（10、20、40 μmol/L）显著升高细胞内ROS水平(P<0.05)，且呈剂量依赖；五味子乙素（10、20、40 μmol/L）能够激发内质网应激，使内质网应激相关蛋白CHOP、GPR78、p-eIF2α表达增多(P<0.05)，且呈剂量依赖。 结论 五味子乙素可能通过ROS介导内质网应激诱导MDA-MB-231细胞凋亡。 Abstract:Objective To study the effects of schisandrin B (Sch B) on the apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. Methods Cell counting reagent (CCK-8) was used to detect the effect of Sch B on the survival rate of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells were treated with Sch B (10, 20, 40 μmol/L) for 24 hours. The cell death was detected by Annexin V-FITC/PI. The levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by DCFA-DA fluorescent probe. Apoptosis and the expression of endoplasmic reticulum stress related proteins (Bcl-2、Bax、CHOP、GPR78、PERK、p-PERK、p-eIF2α、eIF2) were detected by Western blot. Results Compared with the blank group, the cell survival rate decreased significantly (P<0.01) with the increase of Sch B concentration, and its IC50 was 19.16 μmol/L. Compared with the control group, Sch B groups (10, 20, 40 μmol/L) inhibited cell clone formation in a dose-dependent manner (P<0.05). Sch B groups (10, 20, 40 μmol/L) induced apoptosis (P<0.05), significantly reduced the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and significantly increased the expression of pro-apoptotic protein Bax (P<0.05). Sch B groups (10, 20, 40 μmol/L) significantly increased the level of intracellular ROS in a dose-dependent manner (P<0.05). Sch B groups (10, 20, 40 μmol/L) stimulated endoplasmic reticulum stress and increased the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins CHOP, GPR78 and p-eIF2α in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion Sch B induces apoptosis of MDA-MB-231 cells through ROS mediated endoplasmic reticulum stress. -
Key words:
- schisandrin B /
- breast cancer /
- reactive oxygen species /
- endoplasmic reticulum stress /
- apoptosis
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隐丹参酮（CTS）是中药丹参的有效成分之一，国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性，具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性，近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰，期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物，从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。
1. 隐丹参酮抗肿瘤作用
1.1 抑制肿瘤细胞增殖
癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明，CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖，包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]。
1.2 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现，CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]。
1.3 抑制细胞迁移和侵袭
高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征，转移是癌症死亡的主要原因。因此，抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现，CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外，CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]。
1.4 调节机体免疫功能
隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长，还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现，隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用，抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外，隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟，促进抗原提呈功能，进而诱导T细胞活化增殖，抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 （TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，具有异质性，可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移，相反，M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现，隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化，从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]。
1.5 逆转多重耐药
耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明，CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11]，改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外，CTS还可以逆转P-糖蛋白（p-gp）过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]。
1.6 合并用药可增强不同抗癌药物的作用
除了具有以上活性之外，CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如，CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现，CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]。
1.7 自噬
自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径，是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示，CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]。
2. 抗肿瘤作用机制
CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，以及调节免疫等作用的机制十分广泛，涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。
2.1 调控STAT3信号通路
STAT3由Janus激酶（JAKs)激活，参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活，异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后，STAT3被激活，单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体，并从细胞质转移到细胞核中，调节其靶基因的表达，例如，上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达，下调 p53表达，促进肿瘤细胞增殖和存活；上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达，促进肿瘤转移；上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达，下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达，抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现，CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合，特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，抑制STAT3二聚化[18-19]，相比之下，姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中，CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤的作用[21]。另外，CTS作为p-STAT3抑制剂，能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化，抑制肿瘤增殖，逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外，CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移，其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3（SIRT3）是一种蛋白质去乙酰化酶，参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明，抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要，且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。
2.2 抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2
含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP2）由基因PTPN11编码，PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现，肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导，调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明，CTS能与SHP2直接结合，是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂，抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L，抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后，CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低，提示SHP2是CTS的一个靶点，但是，CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长，说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外，有研究发现，CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性，抑制STAT3 Tyr705的磷酸化，从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]。
2.3 调控 topo 2a水平
DNA拓扑异构酶 （topos），包括DNA拓扑异构酶1（topo1）和DNA拓扑异构酶2（topo2），其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明，CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平，并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]。
2.4 调控活性氧水平
活性氧与肿瘤的发展密切相关，其过度产生可诱导多种生物学效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现，CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积，通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30]；通过ROS-线粒体途径，上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31]；诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生，激活JNK/p-38，抑制Erk1/2，导致细胞凋亡[32]；刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生，诱导p38 MAPK激活，导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中，最终导致自噬发生[15]；刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS，激活内质网（ER）应激，增强不同抗癌药物或细胞因子（Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU）诱导的细胞凋亡[33]。
2.5 调控雌、雄激素受体信号
雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性，从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34]；在异种移植动物模型中，CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外，CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长，通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36]；同时，CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号，发挥抗肿瘤作用[37]。
2.6 PI3K/AKT信号通路
磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路，增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达，降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达，诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明，CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外，有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号，抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中，CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长，其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。
3. 隐丹参酮衍生物抗肿瘤活性
CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性，但是其药理作用中等，疏水性强且难吸收，口服生物利用度只有2.1%，这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来，针对CTS存在的问题，人们尝试对CTS进行结构改造，期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂，通过对CTS及其骨架类似物进行修饰，设计合成了CTS衍生物62个，其中新化合物46个，通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS，IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略，设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6，该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L，能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上，LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移，促进凋亡，体内可抑制结肠癌的生长和转移，是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性，Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物，结果发现这些衍生物比CTS更易溶解，同时保留了CTS的生物活性，其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]。
4. 结论
CTS具有广谱的抗肿瘤活性，该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，逆转耐药性，诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外，CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化，间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明，CTS可直接结合STAT3和SHP2，有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路，而不抑制STAT家族中的其他蛋白，是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用，但不是特异性STAT3抑制剂，例如姜黄素，是一种STAT抑制剂，但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性，但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此，基于靶点STAT3，以CTS作为先导化合物，设计并合成一系列CTS衍生物，有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。
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图 1 五味子乙素对MDA-MB-231细胞存活增殖的影响
a. 对照组；b. 10 μmol/L Sch B组；c. 20 μmol/L Sch B组；d. 40 μmol/L Sch B组*P< 0.05、**P< 0.01，与对照组比较
图 2 五味子乙素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
a. 对照组；b. 10 μmol/L Sch B组；c. 20 μmol/L Sch B组；d. 40 μmol/L Sch B组*P< 0.05、**P< 0.01，与对照组比较
图 3 五味子乙素对MDA-MB-231细胞内活性氧（ROS）水平的影响
a. 对照组；b. 10 μmol/L Sch B组；c. 20 μmol/L Sch B组；d. 40 μmol/L Sch B组；e. 40 μmol/L Sch B +5 mmol/L NAC组*P< 0.05、**P< 0.01，与对照组比较；#P< 0.05，与40 μmol/L Sch B组比较
图 4 五味子乙素对MDA-MB-231细胞内质网应激的影响
a. 对照组；b. 10 μmol/L Sch B组；c. 20 μmol/L Sch B组；d. 40 μmol/L Sch B组；e. 40 μmol/L Sch B +2 mmol/L 4-PBA组*P<0.05、**P<0.01，与对照组比较；## P<0.01，与40 μmol/L Sch B组比较
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