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前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球范围内第二位最常见的男性癌症，也是全球第二大致死癌症[1]。据统计，我国前列腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，其中，上海地区该病的发病率和病死率较高，但总体而言，亚洲国家前列腺癌的发病率明显低于西方国家[1-3]。在前列腺癌的治疗中，局限性前列腺癌常规行根治性前列腺切除术或放射治疗，而对于进展期患者则需要接受内分泌治疗即雄激素阻断治疗（androgen deprivation therapy，ADT）。虽然ADT在早期可以明显抑制激素依赖性前列腺癌的进展，但是随着治疗时间的延长，激素依赖性前列腺癌会逐渐失去对ADT的反应而转化成为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC），目前对CRPC尚无有效的治疗方法。因此，亟需深入挖掘CRPC病程进展中的关键基因和蛋白，为CRPC提供潜在治疗靶标。
Abula等[4]进行了PCa蛋白质组学文献的数据挖掘，发现了前列腺肿瘤组织和正常组织中41种差异表达蛋白，并构建了蛋白相互作用网络。其中，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase β subunit，MCCB）就是其中的重要差异蛋白之一。MCCB是生物素依赖性羧化酶（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）的两个组成亚基之一，由563个氨基酸组成[5-8]，MCCC2是该蛋白的编码基因。已有研究报道，MCCC2是一种致癌基因，与包括肝细胞癌、结直肠癌以及乳腺癌在内的多种肿瘤的形成和发展密切相关[9-11]，有望成为肿瘤治疗干预的潜在靶标。
在本研究中，我们主要探讨了MCCC2与前列腺癌的关系。首先，采用慢病毒与质粒构建了稳定低表达MCCC2的DU145细胞株并通过Western blot和qPCR分析敲减率；然后，系统考察敲减MCCC2对DU145前列腺癌细胞的增殖、迁移以及凋亡的影响，明确下调MCCC2与DU145细胞系肿瘤生物学特性的改变的相关性。
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人前列腺癌DU145细胞，来源于海军军医大学附属长海医院泌尿外科，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。
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CCK-8试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；兔MCCC2多克隆抗体、GAPDH抗体以及HRP标记山羊抗兔二抗（美国CST公司）；4%多聚甲醛固定液以及结晶紫染色液（碧云天生物技术有限公司）；细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物有限公司）。
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DU145细胞复苏后接种于含10%灭活的胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液中，置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中生长，每隔3 d传代一次。将shRNA质粒复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养皿。细胞在CO2培养箱中37 ℃孵育24 ~ 48 h进行转染；再用嘌呤霉素筛选低表达MCCC2-DU145的稳定细胞株。
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将复苏的细胞接种于大的培养皿中。3 d后细胞以3×103个/孔，接种于96孔板。分别在0、24、48、72、96 h后，加CCK-8试剂，在450 nm处测定A值，根据A值分析结果。
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取出DU145细胞、NC-DU145细胞以及shMCCC2-DU145细胞，弃掉上清，加入PBS缓冲液洗3次，每次1 ml；加入细胞裂解液（Western及IP细胞裂解液∶PMSF = 100∶1），吹打细胞，置冰上裂解20 min；收集细胞裂解液于1.5 ml的EP管中，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；上清液即为提取的细胞总蛋白溶液，可用于BCA法定量；加入5 ×蛋白加样缓冲液，沸水中煮5 min，于−20 ℃保存，可用于后续的Western blot实验。
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配胶，捡漏，加入样品，先将电压调为80 V，待marker条带分离后，将电压调制120 V，直到蛋白样品跑至凝胶底部，停止电泳；恒流250 mA，冰浴90 min的条件下转膜；染色，封闭，再孵育MCCC2抗体以及二抗，置于Tanon5200光密度扫描仪中进行拍照；用Image J 灰度分析差异性蛋白条带。
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将复苏的细胞接种于培养皿中，待对数生长期时，细胞以5 × 105个/孔接种于6孔板中，在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中孵育；48 h后，将培养基吸掉，加入PBS洗涤3次，每次1 ml；加入RA2裂解液，每孔500 μl，置于冰上1 min；将裂解液收集于内套管中，在12000 r/min下离心1 min；取出，将外套管中的液体倒去，向内套管中加入500 μl洗液，在12000 r/min下离心1 min；重复上述步骤一次；重复上述步骤，但是这次不加洗液，在12000 r/min下离心1 min；取出，弃去外套管，将内套管移入新的1.5 ml Ep管中，加入30 μl的洗脱液，室温静置2 min，在12000 r/min下离心1 min；得到总的RNA，并测定其浓度。
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按照1 000 μg逆转录，总反应体系为20 μl。反应条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，30 s；4 ℃，永恒。反应体系见表1。
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反应条件：94 ℃预变性30 s后94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环后，进行溶解曲线的检测。反应体系见表2。
表 1 逆转录反应体系
物质 加入量（V/μl） 总RNA X（X=1000/c，c为上述测定的总RNA的浓度） Rnase Free dH2O 16－X 5×Mix 4 表 2 RT-qPCR的反应体系
物质 加入量（V/μl） cDNA 1.0 Primer R 0.3 Primer F 0.3 ddH2O 3.4 SYBR 5.0 总计 10 -
进行Transwell实验以评估细胞在体外的迁移能力。细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤2次，用胰蛋白酶消化，稀释为每毫升含1 × 106个细胞，在Transwell室中，加入200 μl含1% FBS培养基的细胞液，下层用600 μl含10% FBS培养基处理。置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养48 h，然后用棉签小心地擦去未穿过小孔的细胞，再用4%多聚甲醛固定30 min，最后用结晶紫染色1 h。使用倒置显微镜拍摄细胞照片，Image-Pro Plus 6.0分析实验结果。
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将细胞以5 × 105/孔的比例接种于6孔板中，37 ℃孵育48 h。使用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒，按照说明书操作方法，使用流式细胞术检测细胞凋亡。
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数据分析通过SPSS (21.0)统计软件进行，采用单因素方差分析，实验结果用（
$\bar x$ ± s）表示。与对照组比较，P < 0.05，则认为差异具有统计学意义。 -
通过Western blot检测PC3、C4-2和DU145细胞中MCCC2的表达水平。如图1A和图1B所示，MCCC2在DU145细胞中的表达为（0.56 ± 0.05）；MCCC2在PC3细胞中的表达为（0.24 ± 0.04）；MCCC2在C4-2细胞中的表达为（0.32 ± 0.04）。结果表明MCCC2在DU145细胞中的表达水平高于C4-2和PC3细胞。为了探讨MCCC2在前列腺癌发生发展中的生物学作用，我们在DU145细胞中通过慢病毒转染稳定下调了MCCC2的表达。成功建立了低表达MCCC2的DU145细胞株，如图1C和1D，Western blot结果表明，shMCCC2组的MCCC2表达水平明显低于shNC组（0.22 ± 0.02 对 0.61 ± 0.06，P < 0.001），而DU145组与shNC组无明显差异（0.60 ± 0.06 对 0.61 ± 0.06，P > 0.05）。qPCR结果表明，shMCCC2组的MCCC2表达水平明显低于shNC组（0.36 ± 0.04 对 1.0 ±0.00，P < 0.001），而DU145组与shNC组无明显差异（1.17 ± 0.01对1.0 ± 0.00，P > 0.05，图1E）。
图 1 MCCC2在不同前列腺癌细胞系和shMCCC2 DU145细胞中的表达水平
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采用CCK-8检测敲减MCCC2对细胞活力的影响。分别在0、24、48、72、96 h后，加CCK-8试剂，在450 nm处测定A值，检测细胞增殖情况。如图2所示，48 h时，shMCCC2组的增殖明显低于shNC组（1.16 ± 0.03 对 1.59 ± 0.07，P < 0.05），而DU145组与shNC组比较无明显差异（1.47 ± 0.05 对 1.59 ± 0.07，P > 0.05）。在72 h时，shMCCC2组的增殖明显低于shNC组（1.92 ± 0.03 对 2.57 ± 0.08，P < 0.01），而DU145组与shNC组比较无明显差异（2.43 ± 0.11对2.57 ± 0.08，P > 0.05）。在96 h时，shMCCC2组的增殖明显低于shNC组（2.24 ±0.04对3.13 ± 0.15，P < 0.01），而DU145组与shNC组比较无明显差异（2.93 ± 0.05对3.13 ± 0.15，P > 0.05）。由结果可以看出，敲减MCCC2能显著抑制细胞增殖，并呈时间依赖性。
图 2 敲减MCCC2对DU145人前列腺癌细胞增殖的影响
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我们采用Transwell小室实验法测定敲减MCCC2对细胞迁移的影响。采用Image-Pro Plus 6.0分析实验结果，计算细胞迁移率。如图3A和3B所示，shMCCC2组的跨膜DU145细胞数量明显少于shNC组（23.96 ± 1.85对49.73 ± 0.63，P < 0.001）；而空白对照组与shNC组相比，跨膜DU145细胞数无显著性差异（48.45 ± 1.26对49.73 ± 0.63，P > 0.05）)。由此可见，敲减MCCC2可有效抑制前列腺癌细胞的迁移。
图 3 敲减MCCC2对DU145人前列腺癌细胞迁移能力的影响
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进一步利用Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒检测了敲减MCCC2对DU145细胞凋亡的影响。结果如图4A和4B所示，shMCCC2组DU145细胞的凋亡率明显高于shNC组（12.64 ± 0.30对 3.68±0.02，P<0.001）；空白对照组与shNC组相比，DU145细胞的凋亡率无显著性差异（5.30 ± 0.02对3.68±0.02，P>0.05）。因此，敲减MCCC2可诱导DU145前列腺癌细胞凋亡。
图 4 敲减MCCC2对DU145人前列腺癌细胞凋亡的影响
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围绕CRPC发生发展中的关键基因和蛋白，已有研究者采用蛋白组学和转录组学等多种组学技术深入挖掘PCa中AR等重要信号通路的关键调节蛋白、基因和潜在的疾病标志物，发现MCCB是前列腺肿瘤组织和正常组织中差异表达的关键蛋白之一[4]，而编码该蛋白的基因MCCC2为AR信号通路调节的关键基因，在人类前列腺癌临床样本中显著过表达，可作为潜在的肿瘤标志物[10]。
3-甲基巴豆酰基辅酶A羧化酶（MCC）是一种生物素依赖的羧化酶，可将3-甲基巴豆酰基辅酶A催化为3-甲基戊二酰辅酶A[5-6]，是亮氨酸降解途径的重要一步。MCC包含α（MCCA）和β（MCCB）两个亚基，分别由MCCC1和MCCC2基因编码[12-13]。MCC在人体内主要表达于肾脏和肝脏中，它的缺陷可引起甲基巴豆酰甘氨酸尿症，严重的可导致婴儿期的死亡[14-16]。MCC缺陷主要与MCCC1和MCCC2基因的突变有关[17-21]。人MCCC1位于染色体区域3q25-q27，具有19个外显子，而MCCC2位于染色体区域5q12-q13，由17个外显子组成[7-8]。迄今为止，人类基因突变数据库中共报道了MCCC1基因的49个突变和MCCC2基因的52个突变[22]。近年来，越来越多的研究表明，MCCC2参与了包括肝细胞癌、结直肠癌以及乳腺癌在内等多种肿瘤的形成和发展[9-11]，其在不同肿瘤中发挥的重要作用有待进一步挖掘。
本研究主要探究了MCCC2与前列腺癌的关系。结果表明，敲减MCCC2可显著抑制DU145前列腺癌细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。研究结果提示，MCCC2可能在前列腺癌发生发展过程中发挥重要作用，有望成为治疗前列腺癌的一个潜在新靶标。至今尚无针对其编码蛋白MCCB的选择性抑制剂的报道，是前列腺癌治疗药物发现的潜在新方向。
Effects of MCCC2 knockdown on proliferation, migration and apoptosis of DU145 prostate cancer cells
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摘要:
目的 应用慢病毒载体shRNA对DU145细胞中的3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶β亚基编码基因（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase 2，MCCC2）进行敲减，探究MCCC2对前列腺癌细胞生物学功能改变的影响。 方法 研究分为3组进行，其中shNC为未敲减MCCC2的DU145细胞对照组，shMCCC2为敲减MCCC2的DU145细胞实验组，DU145为未作任何处理的空白组。运用Western blot和qPCR检测DU145细胞系慢病毒shRNA敲减MCCC2后的表达，CCK8法检测敲减MCCC2对DU145细胞增殖的影响；Transwell检测敲减MCCC2对DU145细胞迁移的影响；流式细胞术检测敲减MCCC2对DU145细胞凋亡的影响。 结果 前列腺癌细胞系DU145经慢病毒shRNA敲减MCCC2后，shMCCC2组的MCCC2表达水平明显低于shNC组（0.22 ± 0.02对0.61 ± 0.06，P < 0.001），shMCCC2组增殖（2.24 ± 0.04对3.13 ± 0.15）和迁移（23.96 ± 1.85对49.73 ± 0.63）均明显低于shNC组（P<0.001）、而shMCCC2组凋亡（12.64 ± 0.30对3.68 ± 0.02）明显高于shNC组（P<0.001）。 结论 敲减MCCC2可显著抑制DU145细胞的增殖和迁移并诱导细胞凋亡，提示MCCC2下调与DU145细胞系肿瘤生物学特性的改变具有一定相关性，有望成为前列腺癌的潜在治疗靶标。 Abstract:Objective To investigate the change of biological characteristics after stable knockdown of the coding gene of 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase β subunit (MCCC2) expression in DU145 by lentivirus shRNA. Methods Three groups were included in this study. shNC was the control group in which MCCC2 was negatively knocked down in DU145. shMCCC2 was the experimental group in which MCCC2 was knocked down. DU145 was the blank group without any treatment. The expression of MCCC2 was assessed by Western blot and qPCR. The proliferation of DU145 cells was detected by CCK8 assay. The migration ability of DU145 was detected by transwell. The apoptosis of DU145 cells was detected by flow cytometry. Results The expression level of MCCC2 in shMCCC2 group was significantly lower than that in shNC group (0.22 ± 0.02 vs 0.61 ± 0.06, P < 0.001). The proliferation (2.24 ± 0.04 vs 3.13 ± 0.15) and migration (23.96 ± 1.85 vs 49.73 ± 0.63) of DU145 cells in shMCCC2 group was significantly lower than that in shNC group, whereas the apoptosis (12.64 ± 0.30 vs 3.68 ± 0.02) of DU145 cells in shMCCC2 was significantly higher than that in shNC group. Conclusion MCCC2 knockdown significantly inhibited the proliferation and migration, and induced apoptosis of DU145 cells, which indicated that the down-regulation of MCCC2 is correlated with the change of tumor biological characteristics of DU145 cell line and can be a potential target for the treatment of prostate cancer. -
Key words:
- MCCC2 /
- prostate cancer /
- proliferation /
- migration /
- apoptosis
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临床上导致患者进入疾病终末期的主要病因分为肿瘤疾病及非肿瘤疾病两大类。疾病终末期患者中，恶心、呕吐症状发生率皆较高，尤以肿瘤疾病最为显著，对患者生活造成明显的负面影响，降低其治疗的依从性及生活质量，并可能造成营养失调、代谢紊乱、体重减轻，严重时会增加患者对治疗的恐惧感以至于终止治疗。因此，积极、合理地预防和治疗疾病终末期患者出现的恶心、呕吐症状，具有重要的临床意义。目前临床常用的止吐药物主要包括多巴胺受体拮抗剂、5-羟色胺(5-HT)受体拮抗剂和神经激肽-1(NK1)受体拮抗剂，皆有一定的不良反应及毒副作用[1-2]。多项研究表明中药穴位贴敷可以有效缓解恶心、呕吐症状，且具有简、便、验、廉、效的优势，毒副作用及不良反应小，患者的治疗依从性高，值得在疾病终末期患者中推广应用[3-5]。尤其是对严重到不能进食及服药的患者，穴位贴敷的外治疗法更显优势。
穴位贴敷疗法是以中医理论中经络腧穴学说为基础，以整体观念及辨证论治为原则，通过药物刺激腧穴以激发经气，激活经络作用于全身脏腑，从而达到治疗效果，最早见于战国时期的《五十二病方》，《黄帝内经》中亦有“马膏” “豕膏”的记载。清代外治法大家吴尚先（1806—1886，名樽，原名安业，字尚先，又字师机）在《理瀹骈文》中较为完备地记载了穴位贴敷疗法，他认为“外治之理即内治之理，外治之药，即内治之药，所异者法耳”[6-7]。姜砂半夏纳米穴位贴为上海市奉贤区南桥镇光明社区卫生服务中心院内穴位贴敷制剂，在临床应用中取得了较好的疗效，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
所有病例来源于上海市奉贤区光明社区、金汇社区、庄行社区及奉城社区4家社区卫生服务中心的安宁疗护病房，住院时间为2020年1月至2021年12月，根据纳入及排除标准，共收录疾病终末期患者病例120例，采用系统随机化法，按纳入研究对象身份证号交替随机分配至对照组和观察组各60例。对照组年龄33～74岁，平均（45.2±16.5）岁；男32例，女28例；病程1～12年，平均（4.3±3.2）年，其中肿瘤患者50例，非肿瘤患者10例。观察组年龄31～75岁，平均（45.8±16.1）岁；男35例，女25例；病程1～14年，平均（4.4±3.7）年，其中肿瘤患者52例，非肿瘤患者8例。两组患者以上基线资料比较差异均无统计学意义，有可比性。研究期间无脱落病例及终止病例，纳入病例均无意识障碍及精神类疾病。本研究通过医疗伦理委员会批准，所有患者及家属均被告知本研究并签署知情同意书。
1.2 病例纳入
1.2.1 纳入标准
①经西医诊断明确为肿瘤或非肿瘤疾病终末期，临床资料完整；②伴有恶心、呕吐症状，恶心呕吐症状评分均为Ⅲ级；③年龄30～80岁，男女不限；④近1个月未采用过中西医药物治疗恶心、呕吐；⑤患者拒绝接受内服药物治疗；⑥患者同意配合研究，并取得其知情同意书。
1.2.2 排除标准
①对敷贴的药物有过敏者；②治疗期间不遵从医嘱、依从性差者；③出现严重不良反应或并发症者；④出现特殊生理变化难以继续治疗者；④有严重痴呆、意识障碍或昏迷的患者；⑤有精神类疾病或智力障碍的患者；⑥不能理解并完成本研究中量表信息的患者。
1.2.3 脱落标准
①未按计划完成试验而中途退出者；②因个人原因拒绝配合试验研究的受试者。
1.2.4 中止试验的条件
在试验研究期间出现其它不良反应或者病情恶化者，不适合继续进行治疗；患者要求停止试验并采用其他手段止呕治疗。
1.3 治疗方法
观察组所有患者均使用姜砂半夏纳米贴进行治疗。药物制备方法：采用球磨技术将半夏、砂仁按2:1比例纳米化，制成500 nm以下超微粉末（占90%以上），鲜生姜榨汁为溶剂，制备包裹有活性有效药物成分的缓释复合材料贴剂。选取穴位为神阙穴、中脘穴、足三里穴、内关穴，每24 h更换，连续使用7 d。对照组穴位的选择同观察组，以淀粉、糊精、焦糖粉等组成安慰药膏贴敷，其重量、外观与姜砂半夏纳米贴相似，贴敷方式与持续时间同观察组。
1.4 观察指标
1.4.1 疗效指标
参考“中药新药临床研究指导原则”症状分级量化标准[8]，于治疗前后对患者进行恶心呕吐症状评分，评分标准见表1。根据以下标准，疗效评定显效为0～I级，有效为Ⅱ级，无效为Ⅲ～Ⅳ级。
表 1 恶心呕吐症状评分标准等级 症状 0级 无恶心呕吐 I级 轻微恶心，无呕吐，不影响进食 Ⅱ级 明显恶心，呕吐1～2次/天，不影响进食及正常生活 Ⅲ级 呕吐3～5次/天，不能耐受，需治疗 Ⅳ级 难控制的呕吐，呕吐＞5次/天 1.4.2 生存质量评价指标
由于纳入的疾病终末期患者中85%（102/120）为肿瘤患者，因此在治疗前后对两组中的肿瘤患者进行生存质量评价，并进行比较。
采用癌症患者生命质量测定量表（EORTC-QLQ-C30）进行评价[9]。量表由整体健康领域、主要症状领域、其他症状领域、经济领域4个部分，共30个条目组成。整体健康领域包括躯体（第1～5条）、角色（第6～7条）、情绪（第21～24条）、认知（第20、25条）、社会功能（第26～27条），主要症状领域包括疲乏（第10、12、18条）、恶心与呕吐（第14～15条）、疼痛（第9、19条），其他症状领域包括气促（第8条）、失眠（第11条）、食欲丧失（第13条）、便秘（第16条）、腹泻（第17条），经济领域包括经济困难（第28条，本文未做统计）。评分方法：总体健康状况（第29～30条，本文未做统计）采用Likert 7级评分，从“很差”到“很好”（1～7分），其他条目采用Likert 4级评分，从“没有”到“很厉害”（1～4分）。量表以极差化方法进行线性变换，将得分转化为标准化分数（1～100分）。整体健康领域得分越高，表明患者的生活质量越高；主要症状和其他症状领域得分越高，表明患者的生活质量越差。由于疾病终末期患者在经济领域及总体健康状况于治疗前后均无统计学意义，因此本文不做分析及论述。
1.5 统计学处理
采用SPSS 26.0统计分析软件，计量资料以
$\bar x $ ±s表示，符合正态分布者采用t检验，不符合正态分布者采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 两组患者症状评分比较
由表2可知，对照组与观察组总有效率分别为18.33%、88.33%，两组对比差异有统计学意义（Z=−7.594，P<0.05）。对照组与观察组中肿瘤患者有效率分别为20.00%、90.38%（P<0.05），非肿瘤患者有效率分别为10.00%、75.00%（P<0.05），差异均有统计学意义。
表 2 两组患者恶心呕吐症状评分比较组别 分型 例数 0～I
（显效）Ⅱ（有效） Ⅲ～Ⅳ
（无效）总有效率
（%）对照组 肿瘤 50 2（4.00） 8（16.00） 40（80.00） 20.00 非肿瘤 10 0（0.00） 1（10.00） 9（90.00） 10.00 合计 60 2（3.33） 9（15.00） 49（81.67） 18.33 观察组 肿瘤 52 23（44.23） 24（46.15） 5（9.62） 90.38* 非肿瘤 8 1（12.50） 5（62.50） 2（25.00） 75.00* 合计 60 24（40.00） 29（48.33） 7（11.67） 88.33* *P<0.05，与对照组比较 2.2 两组肿瘤患者生命质量测定评分比较
癌症患者生命质量测定评分（见表3）表明：治疗前两组各项评分均无统计学差异（P>0.05），对照组治疗前后各项评分亦无统计学差异（P>0.05）。观察组治疗后与治疗前比较，其他症状领域的气促、腹泻评分无统计学差异（P>0.05），其他症状领域的其余项目及主要症状领域评分均低于治疗前（P<0.05），整体健康领域评分均高于治疗前（P<0.05）。贴敷治疗后，观察组整体健康领域及主要症状领域评分均高于对照组（P<0.05），其他症状领域的气促、腹泻得分无统计学差异（P>0.05），其他症状领域的其余3个项目评分均低于对照组（P<0.05）。
表 3 两组患者EORTC-QLQ-C30各领域评分比较项目 时间 对照组（n=50） 观察组（n=52） t P 评分 P 评分 P 整体健康领域 身体功能 治疗前 35.80±7.91 0.601 33.85±8.67 <0.001# 1.188 0.238 治疗后 34.90±9.17 42.21±10.73*# −3.704 <0.001# 角色功能 治疗前 39.25±12.37 0.842 42.07±16.05 <0.001# −0.990 0.324 治疗后 38.75±12.69 60.82±18.53*# −7.041 <0.001# 情绪功能 治疗前 41.64±9.93 0.849 41.85±11.42 <0.001# −0.099 0.921 治疗后 41.25±10.26 63.96±14.83*# −9.024 <0.001# 认知功能 治疗前 48.50±13.28 0.402 50.48±12.37 0.030 −0.780 0.437 治疗后 50.75±13.46 56.25±14.33*# −1.996 0.049 社会功能 治疗前 40.50±11.99 0.760 42.79±13.64 <0.001# −0.899 0.371 治疗后 41.25±12.44 66.35±15.76*# −8.905 <0.001# 总健康状况 治疗前 44.14±11.43 0.501 41.48±12.17 <0.001# 1.137 0.258 治疗后 45.71±11.81 55.22±15.18*# −3.537 0.001 主要症状领域 疲倦 治疗前 66.00±12.35 0.757 61.86±17.10 <0.001# 1.397 0.165 治疗后 66.83±14.43 34.45±9.91*# 13.161 <0.001# 恶心与呕吐 治疗前 79.25±13.51 0.276 78.13±13.75 <0.001# 0.417 0.678 治疗后 76.25±13.89 34.86±10.31*# 17.040 <0.001# 疼痛 治疗前 59.00±16.76 0.763 58.41±19.60 <0.001# 0.162 0.872 治疗后 60.00±16.37 44.23±17.41*# 4.709 0.000 其他症状领域 气促 治疗前 73.50±19.83 0.322 70.43±20.71 0.855 0.763 0.447 治疗后 69.50±20.39 69.71±19.39 −0.054 0.957 失眠 治疗前 75.00±18.90 0.442 70.67±20.24 <0.001# 1.115 0.268 治疗后 72.00±19.97 40.38±23.30*# 7.366 <0.001# 食欲丧失 治疗前 78.00±17.23 0.118 75.00±19.17 <0.001# 0.830 0.409 治疗后 72.50±17.68 32.69±21.32*# 10.245 <0.001# 便秘 治疗前 75.00±18.90 0.496 71.63±17.87 <0.001# 0.924 0.358 治疗后 72.50±17.68 32.21±23.40*# 9.836 <0.001# 腹泻 治疗前 64.50±20.88 0.811 67.31±18.88 0.128 −0.713 0.478 治疗后 65.50±20.76 61.54±19.47 0.995 0.322 *P<0.05，与对照组比较； #P<0.05，与治疗前比较 2.3 两组肿瘤患者KPS评分比较
两组患者治疗前的KPS评分（见表4）无统计学差异（P>0.05），对照组治疗前后的KPS评分无统计学差异（P>0.05），观察组治疗前后的KPS评分有统计学差异，治疗后高于治疗前（P<0.05），两组患者治疗后的KPS评分有显著差异，观察组评分高于对照组（P<0.05）。
表 4 两组患者KPS评分比较组别 治疗前 治疗后 t P 对照组 43.40±12.39 44.60±12.16 −0.489 0.626 观察组 45.00±12.91 56.73±18.76*# −3.715 <0.001# t −0.638 −3.891 P 0.525 <0.001# *P<0.05，与对照组比较；# P<0.05，与治疗前比较 3. 讨论
本研究结果显示，姜砂半夏纳米贴可以有效缓解疾病终末期患者恶心呕吐症状。由于纳入的疾病终末期患者中肿瘤患者占比较大，且目前尚无针对疾病终末期患者统一而权威的生存质量评价量表，因此采用EORTC-QLQ-C30和KPS量表单独对肿瘤患者的生存质量进行评价。结果显示姜砂半夏纳米贴治疗后，EORTC-QLQ-C30量表中整体健康领域评分升高，症状领域评分降低，说明患者生活质量改善，姜砂半夏纳米贴对疾病终末期患者的整体健康及症状改善均有良好的效果。姜砂半夏纳米贴治疗后KPS评分升高，说明患者健康状况提升，生存质量得到改善。
疾病终末期患者易发恶心呕吐，尤其是肿瘤患者，由于化疗药物在肠道聚积，刺激肠内嗜铬细胞释放5-羟色胺等神经递质，与5-羟色胺受体结合刺激迷走神经，从而投射到脑干延髓呕吐中枢，引起恶心呕吐症状[10-11]。研究发现，疾病终末期患者不仅会因疾病和死亡产生恐惧，还会因严重的恶心呕吐症状产生负面情绪。在肿瘤疾病化疗过程中出现的恶心呕吐等不良反应，会降低患者的治疗依从性，统计表明约有20%的患者因难以忍受恶心呕吐而中断化疗[12]。因此，选择副作用小、患者接受度高的方法及时治疗恶心呕吐症状，可以帮助疾病终末期患者延续治疗，延长生命，提高生存质量。
穴位贴敷是一种具有中医特色的外治疗法，它以整体观念及经络腧穴学说为理论基础，药物通过贴敷经皮吸收有效成分，刺激腧穴并激发调控经络，调节脏腑机能达到治疗效果。在本研究的４个治疗选穴中，神阙穴位于脐部中央，属于任脉的穴位，系血脉之蒂，为精、气、神、血往来之要。神，元神；阙，帝王之宫庭。此穴在脐中心，为元神出入之阙庭，故名神阙穴。此穴是胎儿时期生长发育的命脉，能够联系五脏六腑，具有培元固本、和胃理肠的作用。中脘穴属于任脉，为胃经募穴，能够和胃降逆。足三里穴是足阳明胃经要穴，能够调理脾胃、补中益气、通经活络。内关穴属于手厥阴心包经，具有和胃降逆、理气宽胸、宁心安神的作用。中脘、足三里、内关的配穴组合是治疗胃病的经典组穴，大量研究表明这组配穴止吐作用显著[13-14]，且动物实验亦已证实其可以促进胃肠蠕动、改善胃黏膜血流[15]。本研究使用的姜砂半夏纳米贴的组方为生姜、砂仁、半夏，其中生姜能够温中止呕，砂仁能够行气调中、醒脾和胃，半夏能够降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结；三味药配伍可以增强其降逆止呕的疗效。三味药均归属于脾、胃经，其治疗呕吐的疗效也得到现代研究证实[16-18]。我们初步的临床研究发现，姜砂半夏纳米贴对疾病终末期患者的恶心呕吐有良好的临床疗效，并且可提升肿瘤终末期患者的生存质量。
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图 1 MCCC2在不同前列腺癌细胞系和shMCCC2 DU145细胞中的表达水平
A.Western blot法检测PC3、C4-2和DU145细胞中MCCC2的蛋白表达水平；B.MCCC2蛋白表达水平的灰度值分析，***P < 0.001，与DU145比较；###P < 0.001，与DU145比较；C.Western blot法检测shMCCC2 DU145细胞中MCCC2的蛋白表达水平；D.不同处理组细胞MCCC2蛋白表达水平的灰度值分析，***P < 0.001，与shNC比较；E.RT-qPCR检测shMCCC2 DU145细胞中MCCC2的mRNA表达水平，***P < 0.001，与shNC比较。
图 3 敲减MCCC2对DU145人前列腺癌细胞迁移能力的影响
A.200倍镜下不同处理组的细胞迁移图；B.Image-Pro Plus 6.0分析不同处理组的细胞迁移面积，***P < 0.001，与shNC比较。
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