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肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是以肝内细胞外基质（extracellular matrix protein，ECM）过度沉积和纤维瘢痕形成为特征的慢性肝病，在世界范围内具有较高的发病率和病死率，持续发展导致肝硬化、肝癌的发生[1]。肝纤维化发病机制复杂，病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病等均可能导致慢性肝炎症，并最终导致肝纤维化[2]。然而，除肝移植外，目前尚无有效治疗肝纤维化的方法，针对肝纤维化早期识别和治疗对于预防相关负面后果至关重要。鉴于肝脏是人体最大的器官和主要代谢枢纽，探讨肝纤维化的代谢特征有望发现新的标志物和治疗靶点。
二氢丹参酮Ⅰ（dihydrotanshinone I，DHI）是中药丹参中的亲脂性成分，被认为是一种潜在的治疗肝纤维化的药物，其肝脏保护作用、抗癌作用、抗流感活性、抗炎作用等生物学功能已多次报道[3-5]。在本课题组前期扶正化瘀方抗肝纤维化机制研究中发现DHI是扶正化瘀胶囊的重要药效物质基础，也在细胞活性实验中证明其能显著抑制细胞活性发挥抗肝纤维化作用[6]。然而，DHI对肝纤维化治疗作用的体内药效及机制尚不明确。本研究利用肝脏代谢组学方法研究肝纤维化密切相关的生物标志物，探索肝纤维化相关病理过程，同时采用DHI进行干预，研究其对肝纤维化的治疗作用及作用机制，为肝纤维化早期诊断、有效治疗提供科学依据。
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METTLER AE240 型电子天平（瑞士梅特勒公司）；FRESCO17台式冷冻离心机 (Thermo Fisher，美国)；DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒实验仪器公司)；Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪、Agilent 6538 Q-TOF/MS 质谱仪、Micro17高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，2.5μm）(Waters，美国)。
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DHI（纯度 98%，上海一飞生物科技有限公司）；硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA，东京化成工业株式会社)；甲醇、乙腈（均为色谱纯，德国Merck公司），甲酸（色谱纯，ROE scientific INC，美国）；水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。
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SD大鼠，雄性，质量(200～250 g)，共28只，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养于海军军医大学实验动物中心，遵循动物实验的标准操作规范。饲养条件：温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜交替循环的条件下笼养。
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将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组，每组7只。24 h适应性饲养后，除正常组外，模型组及不同用药剂量干预组每周3次腹腔注射200 mg/kg TAA，持续给TAA造模8周；同时，自第5周起，按照给药剂量持续给药4周：正常组、模型组，每日给予生理盐水10 ml/kg；DHI低剂量组，每日给予DHI15 mg/kg；DHI高剂量组，每日给予30 mg/kg。
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最后一次给药24 h后，采用脊椎脱臼法处死大鼠。快速切除肝脏后，用0 ℃生理盐水冲洗并立即放于液氮中快速冷冻，储存于−80 ℃冰箱直至分析。
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将冻存的肝脏组织置于室温自然解冻，取约100 mg肝脏样本于匀浆管中，加入800μl甲醇，在60 Hz下充分匀浆至没有纤维颗粒，4 ℃离心15 min（14 500×g）后取上清液置于1.5 ml的离心管中，氮气吹干。在上述氮气吹干的样品残渣中加入300 μl含内标甲醇涡旋30 s（内标为L-2-氯苯丙氨酸，浓度为5 μg/ml），每个样品取10μl混匀作为质量控制样品。
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色谱条件：Agilent 1290 Infinity UHPLC，色谱柱：Waters XSelect HSS T3 column色谱柱，柱温：30 ℃；进样量：3 μl；流动相A：含0.1 %甲酸的水，流动相B：含0.1 %甲酸的乙腈。流速：0.4 ml/min；梯度洗脱条件：0～2 min，2 %B，2～17 min，2 %～98 % B，17～19 min，98 %B。质谱条件：Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF/MS，离子源：电喷雾（ESI）离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度：350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；碎裂电压：120 V；毛细管电压：4 000 V（ESI+）/3 500 V（ESI-）；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。
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将采集的质谱数据转换为mzData格式文件，然后通过R软件XCMS程序将质谱数据转化为含有保留时间、质核比、峰强度的数据矩阵。保留频数超过80%的质核比数据，并对所有峰面积以内标峰面积和肝组织质量进行归一化处理。
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将上述获得的二维矩阵列表导入SIMCA 14.1软件中进行多元统计分析，采用正交偏最小二乘判别分析研究各组间差异，并得到变量VIP值。正常组和模型组组间比较采用独立样本t检验，采用VIP>1，且选择差异具有显著性（P<0.05）的变量作为潜在的差异代谢物，然后检索数据库（HMDB、METLIN、KEGG数据库），筛选出潜在的差异代谢物。
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使用SPSS 21.0统计软件进行数据统计分析，组间数据采用单因素方差分析（ANOVA），两组样本分析采用独立样本t检验，分析数据差异的统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。
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本研究采用UPLC-Q-TOF/MS在正、负两种模式下对肝组织进行代谢组学分析，两种模式下典型的总离子流图见图1。代谢组学数据的稳定性、重现性对研究的可靠性非常重要，为考察实验的系统稳定性，本研究从每个肝组织样品中取10 μl混匀后作为质量控制样品。在样品序列一开始连续进样10针QC样品，并按每7个样品再进样一针，共进样14次。正、负离子模式下，QC样品均显示良好的聚集状况，证明该分析系统稳定可靠。
图 1 肝脏正负离子模式下典型的LC-MS总离子流图
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经过数据处理后，LC-MS数据集在正离子模式下得到368个离子，在负离子模式下得到249个离子。根据OPLS-DA方法对数据进行分析，OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，最大特点是可以去除自变量和分类变量无关的分类变异，根据得分图可以揭示数据离散程度，发现异常值[7]。在得分图上具有相似的代谢物组成的样本，处在比较相似的位置，样本间距越远代表代谢物差异越大，样本间生理状态相差越大。将正常组、模型组、DHI低剂量组和DHI高剂量组的LC-MS数据导入到SIMCA进行分析，其得分如图2A、2B所示，正常组与模型组样本各自聚为一类，并且完全分离，说明肝纤维化大鼠模型的肝组织代谢轮廓发生显著改变，代谢物的种类或水平发生了明显变化。DHI给药组（DHI低剂量组、DHI高剂量组）能够与模型组明显区分，并向正常组靠近，表明DHI给药组可恢复部分代谢物至正常水平。
图 2 基于LC-MS正负离子模式下的OPLS-DA分析得分图
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OPLS-DA可用于寻找导致聚类间显著差异的变量，筛选正常组和肝纤维化大鼠模型组间潜在的差异代谢物。基于OPLS-DA模式下VIP>1筛选两组间的差异代谢物，进行t检验后，筛出模型组和正常组间差异具有显著性的变量（P<0.05）。基于VIP和t检验以及HMDB和KEGG等数据库比对，筛选出38个与TAA诱导肝纤维化大鼠模型相关的较为重要的差异代谢物作为潜在生物标志物（表1）。通过KEGG、HMDB等数据库查询，我们发现这些代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。
表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 -
以肝纤维化相关的差异代谢物的相对含量作为检测指标可以评价DHI对肝纤维化的治疗作用，比较发现33种代谢物的含量发生明显逆转（图3），同时，有14种代谢物的含量回调与DHI的剂量成正相关性，即高剂量组比低剂量组回调更多（图3A、3B）。
图 3 33种潜在标志物在正常组、肝纤维化模型组、DHI给药组中的相对含量变化
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肝纤维化是一种发病机制复杂，可导致肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等严重肝脏疾病的慢性流行肝病，然而目前并没有药物可以治疗肝纤维化，中药及其活性成分由于其多靶点、多通路等特点被认为是肝纤维化治疗的潜在药物。代谢组学可以对生物体内小分子代谢产物进行动态分析，通过分析阐述代谢物与生理病理变化间的联系，对肝纤维化的机制进一步阐述，也能通过肝纤维化相关差异代谢物的含量相对变化分析药物对肝纤维化模型的药效作用。本研究用肝脏代谢组学方法分析了与TAA诱导的肝纤维化模型密切相关的38种代谢物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径，DHI能够通过调节部分代谢通路发挥预防和治疗肝纤维化作用。
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肝纤维化的产生伴随着肝细胞死亡和肝星状细胞(HSCs)的活化，HSCs约占正常人肝脏中非实质细胞的1/3和总驻留细胞的15%，HSCs从静态到激活会使得ECM过剩表达而导致纤维化，而氧化应激在HSCs激活和ECM形成中发挥重要的促进作用[1, 8]。谷胱甘肽（GSH）是人体内含量最丰富的抗氧化剂，也是体内氧化防御体系的主要组成成分之一[9]。GSH可以在谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶以及谷胱甘肽还原酶的作用下与其氧化态相互转换，清除部分有机过氧化物，调节体内的氧化还原稳态，缓解氧化应激对组织造成的损伤[10-11]。有研究表明，在对乙酰氨基酚、四氯化碳、重金属砷等诱导下，大鼠肝组织中GSH含量下降[12]。本研究中，TAA诱导的肝纤维化大鼠模型肝组织中GSH显著下降，这与谷胱甘肽在其他肝损模型中下调的趋势一致。经过DHI干预后GSH回调，且高剂量DHI比低剂量组回调比例更大，这说明DHI可能调整体内谷胱甘肽代谢通路，通过提高体内谷胱甘肽含量恢复肝组织抗氧化功能，缓解氧化应激对肝脏的进一步损伤，从而起到抗肝纤维化作用。
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肝纤维化过程中，抑制HSC的激活和增殖是预防和治疗肝纤维的重要途径。血小板衍生生长因子(PDGF)可以激活JAK2/STAT3信号通路，致使HSC增殖，并抑制HSC凋亡[13]。已有研究证明，褪黑素通过抑制JAK2/STAT3相关信号通路或抗氧化机制来抑制HSC的激活和增殖从而发挥肝脏保护作用[14-15]。在本研究中，环6-羟基褪黑素及N-乙酰血清素硫酸盐均为褪黑素代谢产物，在模型组中含量显著增加，说明褪黑素被大量代谢，肝脏保护作用被抑制。经过DHI的干预后两种褪黑素代谢产物均回调，这提示DHI可能通过调整褪黑素代谢，回调褪黑素及其代谢产物的机体内含量发挥抗肝纤维化活性。
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肝脏是机体物质代谢的中枢器官，在氨基酸的新陈代谢和蛋白质的合成与分解中发挥重要作用。天冬氨酸是一种酸性氨基酸。天冬氨酸在哺乳动物中一般被认为是一种营养上非必需的氨基酸。然而，越来越多的文献表明，天冬氨酸在包括肝脏生理学在内的许多生物和生理过程中起着重要作用，如合成精氨酸以维持巨噬细胞应对免疫挑战，同时，也有证据表明天冬氨酸可以减轻肝损伤、增强肝脏功能[16]。本研究发现TAA诱导大鼠肝纤维化后，与正常组比较，模型组中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路被干扰，L-天冬氨酸含量显著变化，经过DHI的干预后回调，这提示DHI可能调整丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，改变体内天冬氨酸含量发挥肝保护作用。
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脂质不仅是细胞膜的组成成分，而且参与信号转导。磷脂酰胆碱、鞘脂、溶血性磷脂酰胆碱是血清脂蛋白和细胞膜的重要组成成分。溶血磷脂酰乙醇胺是磷脂酶A1水解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一分子脂肪酸生成的产物，作为一种溶血卵磷脂，在肝脏中与卵磷脂一起在线粒体间进行转移[17]。有研究证明，PE通过N-甲基转移酶生成PC的通路约占PC产生量的30%，磷脂酰胆碱为肝脏重要营养来源，可以拮抗肝脏受病毒、药物、酒精及其他有毒物质的侵害，防止肝纤维化[9]。肝脏是脂质生成和脂肪酸氧化等脂类代谢的主要场所，肝纤维化时可以引起脂质合成、转运及分解代谢的普遍紊乱，而脂质代谢异常又会加重肝损害，引起肝脏的脂毒性[18]。在本研究中，4种LysoPE在模型组中均发生下降，另外一些磷脂代谢相关物质，如GlcCer(d18:1/12:0)、PE(16:0/P-16:0)、PE(18:0/15:0)、CL(i-13:0/i-22:0/i-12:0/i-13:0)和脂质代谢相关物质如二酰甘油（DG）、甘油磷酸甘油、牛磺酸熊去氧胆酸等在正常组与模型组大鼠中也存在显著差异，说明TAA诱导的大鼠肝纤维化模型脂质代谢的紊乱。经过DHI干预治疗后，代谢物水平不同程度得到回调，表明DHI可通过干预多个脂质代谢通路发挥其抗肝纤维化活性。
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三羧酸循环是糖、脂肪、氨基酸三大营养素的最终代谢通路，在能量代谢、提供生物合成的前体中起重要作用。琥珀酸既是三羧酸循环的的重要中间产物，也是一种重要的细胞外信号分子，在信号传递、炎症反应、肝纤维化的发生发展中发挥着重要作用[19]。在本研究中，肝纤维化模型组大鼠琥珀酸的代谢变化趋势均与正常大鼠相反，而给予DHI后趋近正常，说明DHI能够改善肝纤维化大鼠的能量代谢。
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本研究建立了LC-MS代谢组学分析的方法，通过OPLS-DA筛选出与肝纤维化密切相关的38种差异代谢产物，主要涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径。基于38种差异代谢物在正常组、模型组及DHI给药组之间相对含量的差异，对DHI预防治疗大鼠肝纤维化模型的药效进行了评价，结果表明DHI能够回调34种潜在差异代谢物的相对含量，调节部分失衡代谢通路，发挥抗肝纤维化作用。本研究为肝纤维化的新标志物和治疗靶点的发现以及DHI作为抗肝纤维化潜在药物的进一步开发应用提供实验依据。
Metabolomics study of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis with LC-MS technology
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摘要:
目的 利用肝脏代谢组学方法监测肝纤维化相关的代谢变化，评价二氢丹参酮Ⅰ治疗肝纤维化的药效及作用机制。 方法 将28只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组、肝纤维化模型组和二氢丹参酮Ⅰ低剂量组、二氢丹参酮Ⅰ高剂量组。采用硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型，给予4周治疗后，取大鼠肝脏进行液相色谱-质谱分析，结合OPLS-DA模式识别方法筛选模型组和正常组之间的差异代谢物，并以此评价二氢丹参酮Ⅰ对肝纤维化的治疗作用。 结果 通过肝脏代谢组学分析鉴定了38种肝纤维化相关的生物标志物，涉及谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路，同时数据显示二氢丹参酮Ⅰ的干预对肝纤维化有改善作用。 结论 二氢丹参酮Ⅰ能够通过调节失衡的谷胱甘肽代谢、褪黑素代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、三羧酸循环等途径而发挥预防和治疗肝纤维化作用。 Abstract:Objective To evaluate therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis based on liver metabolomics method. Methods 28 rats were randomly divided into four groups including control group, hepatic fibrosis model group and dihydrotanshinone Ⅰ low dose group and dihydrotanshinone Ⅰ high dose group. The dihydrotanshinone Ⅰ treated groups received dihydrotanshinone Ⅰ for 28 days. The rat liver samples were collected and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS). The OPLS-DA pattern recognition analysis of metabolomics differences among the groups and therapeutic effects of dihydrotanshinone Ⅰ on hepatic fibrosis were evaluated. Results 38 metabolites were identified through liver metabolomics analysis. The possible mechanism of hepatic fibrosis was mainly involved glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism and TCA cycle. The hepatic fibrosis induced by TAA was reversed by dihydrotanshinone Ⅰ. Conclusion Dihydrotanshinone Ⅰ provided satisfactory therapeutical effects on hepatic fibrosis through partially regulating the perturbed glutathione metabolism, melatonin metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, TCA cycle. -
Key words:
- hepatic fibrosis /
- dihydrotanshinone I /
- LC-MS /
- metabolomics
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白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根，首载于《神农本草经》。白蔹是最早用于疮痈、烫伤[1]治疗的药物，具有解毒、生肌的功效。资料显示，白蔹在皮肤创伤治疗中的使用频率较高。随着白蔹药理研究的不断深入，发现白蔹还具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫调节及促进溃疡快速愈合等作用。
在2015版《中国药典》中，白蔹的质量标准只有定性分析而无定量分析。白蔹成分检测中发现其含大黄素等蒽醌类活性成分[7]，且白蔹中大黄素的定量测定方法文献资料[8-9]较少。本实验采用反相高效液相色谱法，建立白蔹药材中大黄素含量测定方法，为白蔹的质量控制标准提供方法和依据。
1. 试药与仪器
1.1 试药
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，经面积归一化法计算含量为99.1%）；甲醇（烟台远东精细有限公司，批号：160706）为色谱纯，水为超纯水，磷酸（莱阳市双双化工有限公司，批号：2010246）为分析纯，硫酸（淄博市淄川区张庄化学试剂厂，批号：950626）为分析纯。白蔹饮片（安国市弘发中药材饮片有限公司，批号：131001），经淄博市中医院药品供应科主任魏星教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹Ampelopsis japonica(Thunb.) Makino的干燥块根。
1.2 仪器
Lab Alliance PC 3000 高效液相色谱仪（美国科学系统公司），紫外检测器（北京普析通用仪器有限责任公司）；LD310-2R电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；FA/JA系列电子天平（上海上平仪器有限公司）；RE-201D型恒温水浴锅、RE-201D型旋转蒸发器（郑州博科仪器设备有限公司）；766-3型远红外快速干燥箱（江苏省南通县金余电器配件厂）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
Apollo-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇−0.2%磷酸溶液（85:15），流速1.0 ml/min，检测波长220 nm，进样量20 μl。在此条件下，大黄素与相邻色谱峰分离度良好，无干扰，理论塔板数为2 000。对照品与供试品色谱图见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的制备
取大黄素对照品（含量为99.1%）约10 mg，精密称定，置于1 000 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为9.91 μg /ml 的大黄素对照品储备液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取过5目筛的白蔹药材粉末，置烘箱内（70±2）℃，2 h烘干。精密称量30 g，用10倍量质量分数20%的硫酸在50 ℃条件下回流水解2 h。过滤，取滤渣。滤渣用纯化水洗至中性（pH=7），烘干。称其质量，记录。再以8倍量体积的95%乙醇在82 ℃条件下回流提取2次，每次1 h，过滤，合并乙醇提取液，减压蒸馏，浓缩至无醇味，加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中，即得供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
分别精密量取“2.2.1”项下制备的大黄素对照品溶液各125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成6种不同浓度的对照品溶液。依次精密吸取对照品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y = 53 962X − 966. 46，r = 0.999 7；结果表明大黄素在0.124～3.968 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验
精密量取对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。大黄素峰面积RSD为1.7%。仪器精密度良好，符合要求。
2.3.3 重复性试验
精密称取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法平行制备样品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别进样，测定大黄素的峰面积，RSD为1.2%（n= 6），结果表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取在室温（10~30 ℃）下放置0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供试品溶液各20 μl进样测定，记录大黄素的峰面积，6次进样结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为1.5%。
2.3.5 加样回收率试验
取同一批次（批号：20170704）已知含量的白蔹药材样品9份，分别按相当于样品溶液中大黄素含量的80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.3.1”项下制备的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。计算回收率，结果见表1。
表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果样品含有量（m/mg） 加样量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 2.3.6 样品测定
取不同批次白蔹药材样品，分别按“2.3.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，连续进样3次，以外标法计算含量，测定结果见表2。
表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)批号 含量（μg/g） RSD（%） 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50 3. 讨论
3.1 色谱条件的选择
3.1.1 检测波长的选择
笔者所查文献[8-10]中，测量大黄素所用波长有254、290 nm等。通过实验发现，不同的波长影响其重现性及灵敏度。通过对大黄素标准品甲醇溶液全波段（200～400 nm）紫外扫描可见:其在220、254、260、272、278 nm处均具有特征吸收。通过综合比较上述波长处大黄素峰的峰形及峰面积，220 nm处波长的峰形较好、干扰少、峰面积较大，故选定220 nm作为白蔹药材中大黄素的测定波长。
3.1.2 流动相的选择
大黄素的化学名为1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，具有一定的极性和酸性。所查文献中，大黄素含量测定的流动相体系有多种。在实验过程中发现，流动相对色谱峰的保留时间及分离度有较大影响。故本实验在选择流动相时，考察了不同比例的甲醇-水，乙腈-水，甲醇:0.1%磷酸溶液[8-10]，甲醇:0.5%磷酸溶液[11]，甲醇:0.2%磷酸溶液，甲醇:0.02%磷酸溶液，甲醇:1% 冰醋酸[12]等不同溶剂系统，结果表明，相同条件下，甲醇:0.2%磷酸溶液（85:15）为流动相时，可以达到基线分离，出峰时间较短，峰形较好。
3.1.3 流速与进样量的选择
在流动相及波长选定的条件下，考察了不同流速（0.5~2.0 ml/min）对出峰时间的影响，当流速小于1.0 ml/min时，保留时间延长，使流动相的用量增加，会造成试剂的浪费；当流速大于1.0 ml/min时，保留时间缩短，但大黄素的峰会与杂质峰产生重叠，影响分离度及重现性。本实验选择1.0 ml/min作为流速。
在样品浓度一定的条件下，考察了不同进样体积（10～30 μl）的影响。实验结果表明，进样体积小于20 μl时，重现性及灵敏度均下降；大于20 μl时，杂质峰明显。当进样量为20 μl时，峰的对称性得到保证。因此，本实验选择20 μl为进样量。
3.2 样品提取方法的选择
已有文献[8]对白蔹中大黄素的提取方法采用甲醇提取及三氯甲烷萃取法。通过实验发现这种方法稳定性差、步骤烦琐，且所用试剂毒性较大。本实验在上述提取方法的基础上，参照大黄药材中大黄素的提取方法[10]，通过4因素（粒度、溶剂剂量、溶剂浓度、提取时间）3水平的正交设计确定了白蔹中大黄素的提取方法。结果表明，采用过5目筛的白蔹粉末，先用20%的硫酸在50 ℃条件下回流酸水解2 h，滤渣用纯化水洗至中性。再用8倍量体积的95%乙醇，水浴回流2 h能够达到较好的提取效果。白蔹中含大黄素等游离蒽醌，还含有结合型蒽醌[13-14]。先进行酸水解，使结合型蒽醌水解，结果大黄素的含量有所提高。白蔹具有的抗菌性与其中的大黄素[15-16]有关，大黄素是白蔹的活性成分。本提取方法克服了以往相关文献报道方法的不足，分离度好、重现性好、结果准确，因此大黄素作为白蔹药材中指标成分有一定可行性，为完善白蔹药材的质量控制标准提供了方法和依据。新药临床试验的质量是药品上市后安全、有效的保障[17]，所以临床试验过程中的质量控制尤为重要。包括相似性评价（外观检测和观感评估测试）、安全性评价（常规安全性检测）、适用性评价（薄层鉴别、HPLC、指标成分测定和药理实验）和最终制剂的质量标准。临床试验过程中的质量控制所要评价的范围更广、要求更为严格，是为了确保临床数据的真实、准确、完整和可靠，为下一步临床应用提供依据，对提高医疗水平具有重大意义。
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表 1 TAA诱导肝纤维化相关的差异代谢物及其代谢通路
编号 代谢物 精确分子量 加合离子 分子式 调节趋势 相关通路 1 丁二酸 118.026 6 M-H C4H6O4 ↓* TCA循环 2 柠檬酸 130.026 6 M+NH4 C5H6O4 ↑** 脂肪酸代谢 3 戊二酸 130.026 6 M+FA-H C5H6O4 ↓*** / 4 L-天冬氨酸 133.037 5 M-H C4H7NO4 ↑* 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 5 丝氨酸甘氨酸 162.064 1 M+H-H2O C5H10N2O4 ↑* 二肽 6 左旋肉碱 162.113 0 M+H C7H16NO3 ↓** 肉碱合成 7 2-甲基-3-苯基丙酸 164.083 7 M+H-H2O C10H12O2 ↑*** / 8 顺乌头酸 174.016 4 M-H C6H6O6 ↓** 三羧酸循环 9 半胱氨酰甘氨酸 178.041 2 M+H C5H10N2O3S ↓*** 谷胱甘肽代谢 10 缬氨冬酰胺 231.121 9 M+NH4 C9H17N3O4 ↓* 二肽 11 尿苷 244.069 5 M-H C9H12N2O6 ↓** 嘧啶代谢 12 甘油磷酸甘油 246.050 5 M-H C6H15O8P ↓** 脂质代谢 13 环状6-羟基褪黑素 246.100 4 M+Na C13H14N2O3 ↓** 褪黑素代谢 14 7,8-二氢蝶呤 255.096 8 M+H C9H13N5O4 ↓* 蝶呤生物合成 15 谷氨酰胺天冬酰胺 261.096 1 M+Na C9H15N3O6 ↑*** 二肽 16 γ-谷氨酰鸟氨酸 261.132 5 M+NH4 C10H19N3O5 ↑*** 二肽 17 3-羟基异戊酰肉碱 261.1576 M+NH4 C12H23NO5 ↓*** 脂肪酸代谢 18 天冬氨酰谷氨酸 262.080 1 M+FA-H C9H14N2O7 ↓*** 二肽 19 N-乙酰5-羟色胺硫酸盐 298.062 3 M-H20-H C12H14N2O5S ↓*** 褪黑素代谢 20 视黄酯 302.224 6 M-H C20H30O2 ↓* 脂肪酸代谢 21 谷胱甘肽 307.083 8 M+H C10H17N3O6S ↓** 谷胱甘肽代谢 22 吲哚酚葡萄糖醛酸苷 309.084 9 M+H C14H15NO7 ↓** 脂质代谢 23 3'-AMP 347.063 1 M+H C10H14N5O7P ↓* 胆酸生物合成 24 苯酰甘氨酸 397.355 6 M+Na C24H47NO3 ↑* 脂肪酸代谢 25 花生四烯酰肉碱 448.342 1 M+H C27H46NO4 ↓** 脂质代谢 26 花生四烯基肉碱 455.397 5 M+H-H2O C27H53NO4 ↑** 脂肪酸代谢 27 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/18∶2(9Z,12Z)) 477.285 5 M+H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 28 溶血磷脂酰乙醇胺(18∶2(9Z,12Z)/0∶0) 477.285 5 M-H C23H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 29 溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)) 499.269 9 M+FA-H C25H42NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 30 牛磺熊去氧胆酸 499.296 8 M-H C26H45NO6S ↓* 脂质代谢 31 溶血磷脂酰乙醇胺(20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0) 501.285 5 M+H C25H44NO7P ↓* 甘油磷脂代谢 32 二酰甘油(16∶1n7/0∶0/18∶3n3) 588.475 4 M+H-H2O C37H64O5 ↑*** 脂质代谢 33 二酰甘油(14∶0/0∶0/22∶5n3) 614.491 0 M+H C39H66O5 ↑*** 脂质代谢 34 磷脂神经酰胺(d18∶1/16∶0) 617.478 4 M+H-H2O C34H68NO6P ↑*** 鞘脂代谢 35 鞘糖脂(d18∶1/12∶0) 643.502 3 M+H C36H69NO8 ↑*** 磷脂代谢 36 磷脂酰乙醇胺(16∶0/P-16∶0) 675.520 3 M+H-H2O C37H74NO7P ↑** 磷脂代谢 37 磷脂酰乙醇胺（18∶0/15∶0） 705.530 9 M+H-H2O C38H76NO8P ↑*** 磷脂代谢 38 心磷脂(i-13∶0/i-22∶0/i-12∶0/i-13∶0) 1 296.909 6 M+H-H2O C69H134O17P2 ↓* 磷脂代谢 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，模型组与正常组比较 
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