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对照品系指国家药品标准中用于鉴别、检查、含量测定、杂质和有关物质检查等的标准物质[1]。《中国药典》中并没有明确规定对照品溶液的存放有效期，但《中国药典》和《药品生产质量管理规范》（GMP）均要求使用单位应对对照品溶液的稳定性和使用效期进行验证，通过研究结果来确定内控效期[1-7]。本实验结合日常检验工作的使用率、制剂中间品和成品抽检的周期，挑选5种制剂（维生素E珍珠乳膏、新面醑、复方替硝唑溶液、磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂和地塞米松磷酸钠滴鼻液），涉及8种常用的对照品（维生素E、甲硝唑、氯霉素、水杨酸、替硝唑、醋酸氯己定、磺胺嘧啶和地塞米松磷酸酯），按照相应的质量标准方法进行测定[8-14]，考察各对照品储备液在2～10 ℃冰箱中的稳定性，为存放效期提供必要依据，从而规定对照品储存的内控时间[15-18]。
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Agilent 1260 型高效液相色谱仪（包括脱气机、四元泵、自动进样系统、G7114A紫外检测器、Chemstation工作站，美国Agilent公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪（包括脱气机、四元泵、自动进样系统、G1314B紫外检测器、Chemstation工作站，美国Agilent公司）；PHS-3C型精密 pH计（上海雷磁仪器厂）；ME235S电子天平（德国赛多利斯）；EX225DZH电子天平（美国奥豪斯）。
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对照品维生素E（批号10062-0007，纯度99.2%）、甲硝唑（批号100191-201808，纯度100.0%）、氯霉素（批号130555-201203，纯度99.8%）、水杨酸（批号100106-201104，纯度99.9%）、替硝唑（批号100336-201704，纯度100.0%）、醋酸氯己定（批号100183-201003，纯度96.2%）、磺胺嘧啶（批号100026-201404，纯度99.7%）、地塞米松磷酸酯（批号101116-201102，纯度98.6%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（霍尼韦尔，美国）；磷酸、磷酸二氢钾、盐酸、醋酸铵、三乙胺为分析纯；水为纯化水。
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色谱柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇，流速为1.5 ml/min，检测波长为284 nm，进样量为10 μl。
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色谱柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.04%磷酸溶液（V∶V=47∶53），流速为1.0 ml/min，检测波长为284 nm，进样量为10 μl。
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色谱柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇为流动相A，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH3.5）（V∶V=20∶80）为流动相B，梯度洗脱(0～8 min，0%～55% A；8～15 min，55% A；15～15. 1 min，55%～0% A；15. 1～20 min，0% A)，流速为1.0 ml/min，检测波长为280 nm，进样量为10 μl。
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色谱柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%醋酸铵溶液（V∶V=20∶80），流速为1.0 ml/min，检测波长为260 nm，进样量为10 μl。
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色谱柱：Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.75%三乙胺溶液（磷酸调pH 至3.0）-甲醇-乙腈（V∶V∶V = 55∶40∶5），流速为1.0 ml/min，检测波长为242 nm，进样量为10 μl。
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精密称取维生素E对照品约10 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml中约含维生素E 0.2 mg的对照品溶液。
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精密称取甲硝唑、氯霉素对照品各约10 mg，分别置10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；另精密称取水杨酸对照品约12.5 mg，置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述甲硝唑、氯霉素对照品稀释液各5 ml、水杨酸对照品稀释液10 ml，置于同一25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml中约含甲硝唑、氯霉素和水杨酸分别为0.2 mg、0.2 mg和0.05 mg的混合对照品溶液。
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精密称取替硝唑对照品约10 mg、醋酸氯己定对照品约10 mg置于同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀释成每1 ml中约含替硝唑、醋酸氯己定各0.2 mg的混合对照品溶液。
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精密称取磺胺嘧啶对照品约12.5 mg，置25 ml量瓶中，加稀盐酸1 ml溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml中约含磺胺嘧啶0.1 mg的对照品溶液。
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精密称取地塞米松磷酸酯对照品约15 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释液3 ml，置25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml 约含地塞米松磷酸酯0.036 mg的溶液。
上述对照品溶液均置于具塞的量瓶中，且用封口膜封口，取用后立即冷藏（2～10 ℃）保存，分析前需放至室温。
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按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。各色谱条件下，各主成分峰分离度均大于1.5，理论板数满足相应制剂标准要求，且各出峰情况与文献一致[8-14]。
图 1 系统适用性高效液相色谱图
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将上述3种对照品溶液在保存0、1、4、7、10、14、21、28、35 d时，与当天新鲜配制的相应对照品溶液按照相应色谱条件分别进样，分别计算平均峰面积，以当天新鲜配制的对照品溶液计算对照品储存溶液的含量值。
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每个测试时间点的结果都是用新鲜配制的对照品溶液的平均响应值，来重新计算用于研究效期的对照品溶液的标示量，基于下述公式进行计算：
$$ \mathrm{X}\mathrm{\%}=\frac{{\mathrm{A}}_{\mathrm{T}}\times {\mathrm{C}}_{\mathrm{N}}}{{\mathrm{A}}_{\mathrm{N}}\times {\mathrm{C}}_{\mathrm{T}}}\times 100\mathrm{\%} $$ 式中，AN和CN表示新鲜配制对照品的峰面积和浓度；AT和CT表示对照品储存溶液的峰面积和浓度。
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各对照品溶液均未出现浑浊、沉淀等异常现象；测试用对照品溶液与新鲜配制的对照品溶液外观一致；色谱图中均未出现显著的杂质峰；每个分析测试点，要求对照品储存溶液的标示量与零点的差异不得超过2.0%。
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上述各类对照品溶液在2～10 ℃冰箱内密封储存35 d，测试用对照品溶液外观与新配制对照品溶液一致，未出现浑浊、沉淀等现象；色谱中均未出现显著的杂质峰，每个分析测试点，对照品溶液的含量变化如图2所示，维生素E储存35 d、甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品储存7 d、替硝唑和醋酸氯己定混合对照品储存35 d、磺胺嘧啶储存35 d、地塞米松磷酸酯储存35 d，含量符合要求。结合含量标准要求，在2～10 ℃冰箱中，维生素E对照品、替硝唑和醋酸氯己定混合对照品、磺胺嘧啶对照品、地塞米松磷酸酯对照品溶液的效期可定为35 d，甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品溶液定为7 d。
图 2 5种制剂中8种对照品溶液的稳定性
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对照品溶液是药品检验的重要部分，对照品储存在冰箱中需要以封口膜封口，减少溶剂的挥发；从冰箱中取出时，需超声半分钟或放至室温，摇匀后再取下封口膜取样，避免直接打开引起瓶内挥发的溶剂流失，影响测定结果。
考察结果中发现甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品溶液稳定性较差，各组分储存期分别为35、21和7 d。采用三组分单独配制储存进行考察，结果发现甲硝唑、氯霉素、水杨酸溶液的储存时间分别为35、35和10 d，同比混合对照品溶液中，氯霉素稳定性增加，但对水杨酸稳定性改善不明显，因此推测氯霉素的不稳定性是受其他成分的影响，水杨酸的不稳定性是其固有属性。
通过对照品储存溶液稳定性的考察，可为实验室对照品溶液内控管理提供数据参考，有助于减少对照品的损耗，节约药品检验成本[2,19]。对于某些说明书中附有“本品具有引湿性，建议打开包装后一次使用完毕”的对照品，可于首次打开后精密称定多份置于适宜的容量瓶内备用，从而降低检验成本，如中国食品药品检定研究院在售对照品地塞米松磷酸酯[25]为200 mg/支（单价为390元），即可采用首次开封后，按需求单剂量分装的方式储存。
实际生产过程中，环节多而繁琐，常常中间品和成品抽检时间跨度长，增加了对照品的消耗。《中国药典》四部[1]规定，标准物质溶液应临用前配制，否则应证明其适用性。各类制剂质量标准建立的过程中，一般考察为对照品室温和4 ℃条件下24 h内的稳定性，这个时间远远不能满足中间品和成品的时间跨度。文中对5种制剂涉及的8种对照品储存液适用性进行考察，验证其稳定性，为内控效期的制定提供了依据，基本能够保证对照品储备液的效期能够涵盖中间品和成品检验时间的跨度，完成一批检品的检验。
The investigation of the stability of 8 commonly used reference solutions by HPLC
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摘要:
目的 考察8种常用对照品溶液稳定性，以此确定内控效期。 方法 配制对照品储存溶液，密封保存于2～10 ℃冰箱中，于0、1、4、7、10、14、21、28、35 d采用高效液相色谱法测定各对照品储存溶液与新配制的对照品溶液含量，计算含量变化值。 结果 各对照品溶液在考察期内，外观与新配制对照品溶液一致；色谱中均未出现显著的杂质峰。甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品储存7 d，维生素E对照品、替硝唑和醋酸氯己定混合对照品、磺胺嘧啶对照品、地塞米松磷酸酯对照品储存35 d，含量均符合要求。 结论 在2～10 ℃冰箱中，维生素E对照品、替硝唑和醋酸氯己定混合对照品、磺胺嘧啶对照品、地塞米松磷酸酯对照品溶液的效期可定为35 d，甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品溶液定为7 d。 Abstract:Objective To investigate the stability of 8 commonly used reference solutions and determine the validity period of internal control. Methods The storage solutions of reference substances were prepared and stored in the refrigerator at 2 to 10 ℃. The content of the storage solutions and the newly prepared reference solutions were determined by HPLC on days 0, 1, 4, 7, 10, 14, 21, 28 and 35, and their change values of the content were calculated. Results During the inspection period, the appearance of each reference solution was consistent with the newly prepared reference solution. There was no significant impurity peak in the chromatography. For mixed references of metronidazole, chloramphenicol and salicylic acid stored for 7 days, vitamin E, mixed references of tinidazole and chlorhexidine acetate, sulfadiazine, dexamethasone phosphate for 35 days, their contents met the requirements. Conclusion Stored in the refrigerator at 2 to 10 ℃, the effective time period of vitamin E reference solution, mixed references solution of tinidazole and chlorhexidine acetate, sulfadiazine reference, dexamethasone phosphate reference solution can be 35 days, and the mixed references solution of metronidazole, chloramphenicol and salicylic acid defined can be 7 days. -
Key words:
- vitamin E /
- new surface Xu /
- compound tinidazole solution /
- sulfadiazine /
- dexamethasone phosphate /
- substance stability /
- HPLC
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肾衰宁颗粒由太子参、黄连、制半夏、陈皮、茯苓、大黄、丹参、牛膝、红花、甘草等十味中药制成；具有补气健脾，活血化痰，祛浊的功效[1]。有文献表明，肾衰宁在治疗慢性肾脏疾病中疗效较为显著[2]；在尿毒症腹膜透析患者的治疗过程中能够降低血清硫酸吲哚酯浓度[3]；对于慢性肾脏病的Ⅳ期患者，在西医基础治疗的同时服用肾衰宁颗粒，可以明显改善肾功能，同时提升患者的治愈率，具有较高的临床使用价值[4]。由于中药成分复杂[5]，使得如何控制中药的质量成为十分重要的问题。指纹图谱是在了解中药物质整体作用的基础上，通过光谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，以鉴别中药的真伪，评价质量的一致性和产品的稳定性，其具有信息量大、特征性强、完整性和模糊性等特点[6]。指纹图谱中的质量控制技术既能保证中药的功效，又在实现中药现代化过程中起关键性作用[7]。因此，本实验以10个批次的肾衰宁颗粒为研究对象，拟建立肾衰宁颗粒的指纹图谱，对肾衰宁颗粒进行质量评价。
肾衰宁颗粒是由十味中药组成的复方制剂，其化学成分十分复杂，且许多复方治疗疾病的药物基础并不明显，因此检测成分必须是发挥药效的有效成分[8]，本实验针对大黄中的大黄酚（chrysophanol）[9-10]、丹参中的丹酚酸B（salvianolic acid B）[11]、陈皮中的橙皮苷（hesperidin）[9, 12]3种指标性成分，进行HPLC法含量测定。在多成分的质量控制检测成本高而对照品紧缺的情况下，能较大程度地节约检验成本，又可较全面地控制该制剂的质量，保证临床用药的有效性和安全性，同时为肾衰宁颗粒的质量控制提供参考。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包含G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B-DAD二极管阵列检测器，Chemstation色谱工作站；光电分析天平（德国Sartorius公司，CPA 225D型），最大载荷220 g，分度值0.01 mg；冷冻真空浓缩仪（丹麦Labogene公司，ScanVac ScanSpeed 40型）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK7200H型）；涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，Vortex QL-901型）。
1.2 试剂
肾衰宁颗粒（德元堂制药集团，批号：51103111、51103009 346、51103010 471、51103011 593、51103105、51103018 486、41103033 563、51103110、61103102、61103101）。蜕皮激素（ecdysterone，批号：P11N6F5706）、甘草苷（liquiritin，批号：2O1027BA14）、甘草酸（glycyrrhizic acid，批号：230A6B1）、大黄酚（chrysophanol，批号：T31O6F5345）、丹酚酸B（salvianolic acid B，批号：Y14M7H14804）、橙皮苷（hesperidin，批号：K02M3C1）对照品，均由上海源叶有限公司提供。大黄素（modin，批号：110756-200110）、盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，批号：09030522）对照品，由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸，均为德国Merck公司生产，色谱纯。二氯甲烷，色谱纯。水为纯净水，娃哈哈公司生产。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters SunFire™ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱。流速：1 ml/min。柱温：25 ℃。进样量：10 μl。检测波长：254 nm。梯度洗脱条件见表1。
表 1 梯度洗脱条件时间（t/min） 乙腈（%） 0.1%甲酸溶液（%） 0 5 95 1 23 77 18 25 75 19 30 70 31 75 25 60 85 15 2.2 对照品溶液的制备
精密依次称取丹酚酸B、橙皮苷、大黄素标准品10.25、10.35、10.05 mg，分别置于10 ml容量瓶中，以纯甲醇定容至刻度，摇匀，得储备液并将其分装后储存于−20 ℃的冰箱中。精密称取10.10 mg大黄酚，置于10 ml容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，超声处理3 min，然后用纯甲醇稀释至刻度，摇匀，得到对照品的储备液，置于−20 ℃冰箱保存。
2.3 供试品溶液的制备
取肾衰宁颗粒适量，研磨成细粉，混合均匀，精密称取0.10 g，加适量70%甲醇溶液使其溶解，超声45 min，再用70%甲醇溶液定容至2 ml，冷却，过0.45 μm微孔滤膜后，取续滤液进样分析。
2.4 肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱的建立
2.4.1 精密度试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样5次，通过大黄素（7号色谱峰）作为参照峰，确定相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD在1.0%以内，相对峰面积的RSD在2.0%以内，表明进样仪器的精密度良好。
2.4.2 重复性试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），按照“2.3”项平行制备5份供试品溶液，测定在“2.1”项色谱条件下的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明该实验方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性试验
取肾衰宁颗粒（批号：41103033 563），并根据“2.3”项下平行制备5份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别记录0、4、8、24、36 h的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间RSD在1.0%以内，相对保留面积RSD在2.0%以内。表明供试样品溶液在36 h内稳定性好。
2.5 指纹图谱结果与分析
分别称取10个批次的肾衰宁粉末，按照“2.3”项制备供试品溶液，每个批次平行制备3份供试品溶液，记录图谱，见图1。利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008A版”的软件，将10批次肾衰宁颗粒的图谱导入，将批号为61103102的样品溶液用作针对相似性计算校正的参考图。结果显示，1～9批制剂间指纹图谱与对照图谱之间相似度均不小于0.90，见表2，表明相似度良好。对保留时间0~60 min内的色谱峰进行分析，均有22个稳定的特征峰，确定其为肾衰宁的共有指纹峰，经过标准品比对，其中，6号峰为橙皮苷，14号峰为丹酚酸B，21号峰为大黄酚。
表 2 10批肾衰宁颗粒HPLC指纹图谱相似度样品号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照指纹图谱 S1 1.000 0.980 0.910 0.941 0.934 0.948 0.916 0.941 0.950 0.874 0.965 S2 0.980 1.000 0.934 0.934 0.932 0.945 0.951 0.946 0.978 0.867 0.973 S3 0.910 0.934 1.000 0.952 0.947 0.937 0.972 0.940 0.945 0.914 0.973 S4 0.941 0.934 0.952 1.000 0.990 0.984 0.951 0.971 0.923 0.940 0.986 S5 0.934 0.932 0.947 0.990 1.000 0.978 0.938 0.976 0.910 0.910 0.979 S6 0.948 0.945 0.937 0.984 0.978 1.000 0.954 0.987 0.931 0.923 0.986 S7 0.916 0.951 0.972 0.951 0.938 0.954 1.000 0.949 0.966 0.913 0.979 S8 0.941 0.946 0.940 0.971 0.976 0.987 0.949 1.000 0.928 0.890 0.980 S9 0.950 0.978 0.945 0.923 0.910 0.931 0.966 0.928 1.000 0.892 0.969 S10 0.874 0.867 0.914 0.940 0.910 0.923 0.913 0.890 0.892 1.000 0.937 对照指纹图谱 0.965 0.973 0.973 0.986 0.979 0.986 0.979 0.980 0.969 0.937 1.000 2.6 肾衰宁颗粒中3种有效成分的含量测定
2.6.1 线性结果考察
按照“2.2”项下制备标准品溶液，得到混合对照品色谱图见图2。将标准品储备液用纯甲醇稀释，丹酚酸B浓度梯度为：10、20、40、80和100 μg/ml；橙皮苷浓度梯度为：40、80、160、320和400 μg/ml；大黄酚浓度梯度为：8、16、40、100和350 μg/ml。在“2.1”项色谱条件下，分别记录3种成分的峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，结果见表3。
表 3 各成分线性关系对照品 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 橙皮苷 Y=2.391 8X–2.798 3 0.999 7 40～400 丹酚酸B Y=10.689X–5.578 3 0.999 8 10～100 大黄酚 Y=58.983X+121.99 0.999 9 7～350 2.6.2 精密度试验
取同一对照品溶液，根据“2.1”项下色谱条件进行测定，重复进样5次，并记录峰面积。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚峰面积的RSD分别为0.17%、0.20%、0.15%，表明仪器精密度良好。
2.6.3 检测限和定量限
精密吸取橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚对照品溶液适量，使用甲醇逐步稀释，至色谱图中上述3种成分的峰高分别为噪音的3倍和10倍，测得橙皮苷的检测限和定量限分别为0.18和1 μg/ml；丹酚酸B的检测限和定量限分别为0.3和1.2 μg/ml；大黄酚的检测限和定量限分别为1和5 μg/ml。
2.6.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（批号：41103033 563），并根据“2.1”项色谱条件在0、2、4、8、24、36 h测定。橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为2.01%、2.22%、2.05%，结果表明：供试品在36 h内稳定。
2.6.5 重复性试验
取同一供试品溶液（批号：41103033 563），平行制备6份，并根据“2.1”项色谱条件进行测定，橙皮苷、丹酚酸B、大黄酚的峰面积的RSD分别为0.67%、2.00%、2.02%，表明系统重复性良好。
2.6.6 加样回收率试验
精密量取肾衰宁溶液1 ml，分别加入100%含量橙皮苷对照品（理论值为192.02 μg），100%含量丹酚酸B对照品（理论值为62.66 μg），100%含量大黄酚对照品（理论值35.22 μg），按照“2.2”项平行制备6份，并根据“2.1”的色谱条件进行测量，按照下述公式计算加样回收率，平均加样回收分别为119.20%、84.69%、84.58%。结果见表4。
表 4 加样回收率试验结果成分 取样量（V/ml） 样品含量（m/μg） 加入量（m/μg） 测得量（m/μg） 回收率（%） 平均回收率（%） 橙皮苷 1.00 383.02 95.88 773.46 101.80 100.27 1.00 380.39 95.88 764.91 100.26 1.00 380.31 95.88 763.64 99.95 1.00 384.46 95.88 771.17 100.83 1.00 385.81 95.88 772.95 100.94 1.00 389.20 95.88 764.32 97.81 丹酚酸B 1.00 120.79 31.80 250.42 101.91 98.82 1.00 122.50 31.80 251.14 101.12 1.00 125.56 31.80 248.78 96.87 1.00 127.57 31.80 254.87 100.07 1.00 127.74 31.80 251.44 97.25 1.00 127.75 31.80 249.44 95.66 大黄酚 1.00 72.67 17.79 138.19 92.06 97.36 1.00 69.62 17.79 135.41 92.44 1.00 68.46 17.79 140.83 101.69 1.00 71.03 17.79 141.25 98.66 1.00 68.98 17.79 141.57 102.00 1.00 71.92 17.79 141.17 97.30 回收率=（实测量-样品含量）/加入量×100%。
2.6.7 样品含量测定
取10批肾衰宁颗粒，按“2.2”项制备试液，按“2.1”项色谱条件测定，结果见表5。
表 5 10批肾衰宁样品中3种成分的测定结果药品批号 橙皮苷(μg/ml) 丹酚酸B(μg/ml) 大黄酚(μg/ml) 61103102 66.99 42.29 44.65 51103110 83.41 39.34 42.89 51103111 94.75 41.36 44.51 51103009 346 80.57 43.21 43.44 51103011 593 83.51 42.04 42.58 51103018 486 79.94 41.94 42.96 51103010 471 90.03 41.88 44.03 41103033 563 83.48 43.01 43.94 61103101 85,92 42.93 43.85 51103105 88.04 41.76 42.94 3. 讨论
3.1 检测波长的选择
在190~400 nm处全波长扫描，盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚、丹酚酸B、蜕皮激素、甘草酸、甘草苷、橙皮苷分别在345、254、254、286、250、237、237、283 nm处有最大吸收，通过对比分析，在波长254 nm处，上述8种成分具有良好的响应，样品中相邻色谱峰的基线分离可以满足含量检测的要求。因此，选择波长254 nm作为检测波长。
3.2 样品前处理的方法优化
将肾衰宁粉末直接用水溶解后进样，发现样品出峰很少，所测成分在色谱条件下没有吸收。后用50%、70%、80%的甲醇溶解样品，发现用70%甲醇溶解出峰数最多，且所测成分在此条件下均有吸收，故选择70%甲醇进行样品的前处理。
3.3 流动相的选择
有文献报道，肾衰宁含量测定使用甲醇-0.1%磷酸[13]、乙腈-水-1%甲酸[14]、乙腈-05%磷酸[15]进行90 min的大梯度洗脱，发现色谱峰分不开，且特征峰较少。经过反复实验，确定乙腈-0.1%甲酸水溶液用作梯度洗脱的流动相，分离出样品中测得的特征峰，特征峰很多，峰形良好。
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图 1 系统适用性高效液相色谱图
A.维生素E对照品；B.甲硝唑、氯霉素和水杨酸混合对照品；C.替硝唑和醋酸氯己定混合对照品；D.磺胺嘧啶对照品；E.地塞米松磷酸酯对照品；1.维生素E；2.甲硝唑；3.氯霉素；4.水杨酸；5.替硝唑；6.醋酸氯己定；7.磺胺嘧啶；8.地塞米松磷酸酯
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