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目前，脑卒中、冠心病等心血管病（cardiovascular disease, CVD）是造成我国居民死亡和疾病负担的首要病因[1]。有研究预测，2010−2030年间我国成年人血清胆固醇水平的升高将会造成心血管病事件增加920万例，预示未来中国成年人血脂异常及相关疾病负担将继续加重[2]。以低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）或总胆固醇（TC）升高为特点的血脂异常是缺血性脑卒中的重要危险因素，血清胆固醇水平升高与缺血性卒中的发生密切相关[3]。降低LDL-C水平，可显著减少其发病及死亡危险[4]。阿托伐他汀（atrovastatin）为亲水性羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）抑制剂，临床用于降脂和调脂治疗，但其疗效和不良反应具有明显的个体差异性，考虑可能与患者的基因多态性有关。
以往他汀药物基因多态性研究多以高血脂症患者为研究对象，而对心血管疾病极高危和高危人群研究较少，且用药后观察时间较短，一般不超过2个月。笔者研究缺血性脑卒中伴血脂异常患者的SLCO1B1、APOE基因多态性及阿托伐他汀用药3个月后疗效、不良反应的相关性，从遗传变异角度评价药物疗效的临床差异，以期为阿托伐他汀的临床长期用药提供参考。
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选取上海市浦东新区公利医院2018年4月至2018年12月收治的缺血性脑卒中伴血脂异常患者。纳入标准：①符合2016年修订的《中国血脂异常防治指南》血脂异常诊断标准；②入院前3个月内服用过他汀类及其他调脂类（如贝特类、烟酸类、依折麦布等）。排除标准：①肝、肾功能不全者；②严重感染、恶性肿瘤、甲状腺和血液系统等疾病患者；③患者未进行规律服药及复查，临床记录不完整的患者。入选患者共210例，男132例（62.86%），女78例（37.14%），平均年龄（67.29±12.49）岁。
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入选患者首次服药前空腹抽取外周静脉血2 ml置于eDTA抗凝管中，采用磁珠法提取全血DNA，提取好的基因组DNA在−20 ℃下储存；采用PCR技术扩增特定基因片段：PCR系统包括：2 μl基因组DNA，25 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），1 μmol/L引物，25 mmol/L镁离子（Mg2+），5 U/μl PCR DNA聚合酶，总反应体积为5 μl。PCR反应参数为循环参数：95 ℃ 2 min，（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s）45个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保温。7 μl的纯化PCR产物进行单碱基延伸反应，反应参数为：94 ℃ 30 s，[94 ℃ 5 s，(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s)该步骤5个循环]40个循环，72 ℃ 3 min，4 ℃ 保温。运用飞行时间质谱法进行包括SLCO1B1 521T>C（rs4149056）与APOE 526C>T（rs429358）、388T>C（rs7412）的基因分型检测。
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入选患者首次服用阿托伐他汀20 mg/d前及服药3个月后，空腹采集全血标本2 ml，全自动生化仪测定疗效指标血清TC、TG、HDL-C和LDL-C，以及安全性指标总胆红素（TBil）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）水平。收集患者服药期间患者肌痛的发生情况，包括肌钝痛、酸痛，四肢及远端压痛，运动时或之后即刻痛性痉挛等不良反应。其中，他汀类相关肌病（SAM）诊断标准为①肌痛：肌组织疼痛或无力，但CK水平无明显升高。②肌炎：肌组织有疼痛症状，CK水平轻-中度升高但小于正常值上限5倍。③横纹肌溶解：肌组织有明显疼痛症状，CK水平超过正常上限5倍及以上、褐色尿及肌红蛋白尿合并急性肾功能衰竭[5]。追踪纳入的210例患者长期服用阿托伐他汀期间不良反应的主诉情况，并排除重体力劳动和长期剧烈运动对患者的影响。
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采用SPSS 22.0统计软件对观察指标的结果进行分析，连续变量以（
$ \bar x$ ±s）表示，通过χ2检验验证SLCO1B1和APOE各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，P>0.05代表该基因型已经在本群体中达到遗传平衡。计量资料符合正态分布采用（$ \bar x$ ±s）表示，组间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 -
采用直接计数法统计基因型，计算各位点等位基因频率。SLCO1B1 521 T>C在缺血性脑卒中伴血脂异常患者中，等位基因型频率为11.43%，SLCO1B1 521T>C基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.73，P=0.39），P>0.05表明本研究人群具有群体代表性。APOE基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.61，P=0.43），P>0.05表明本研究人群具有群体代表性，各基因型分布见表1。
表 1 缺血性脑卒中伴血脂异常患者SLCO1B1和APOE各基因型频率
基因型 野生型
纯合型（TT）突变
杂合型（TC）突变
纯合型（CC）等位基因
（频率/%）T C SLCO1B1 521 T>C 166
（79.05）40
（19.05）4
（1.90）372
（88.57）48
（11.43）APOE 526 C>T 169
（80.47）38
（18.10）3
（1.43）376
（89.52）44
（10.48）388 T>C 5
（2.38）28
（13.33）177
（84.29）38
（9.05）382
（90.95） -
APOE基因表型E3组（e3/e3、e2/e4）最高，占67.62%；E2组（e2/e2、e2/e3）占14.28%；E4组（e3/e4、e4/e4）占18.10%，详见表2。
表 2 缺血性脑卒中伴血脂异常患者APOE基因分型及频率
基因分型 等位基因 数量（例） 合计（例） 频率（%） E2 e2/e2（TT/TT） 5 30 14.28 e2/e3（TT/CT） 25 E3 e3/e3（TT/CC） 139 142 67.62 e2/e4（TC/TC） 3 E4 e3/e4（CT/CC） 35 38 18.10 e4/e4（CC/CC） 3 合计 210 210 100 -
用药后APOE不同基因型患者TG、TC、HDL-C、LDL-C变化率均有显著性差异（P<0.01），见表3。经组间比较，TC值降低幅度和HDL-C升高幅度E3优于E2、E4（P<0.01），TG和LDL-C值降低幅度E2、E3优于E4（P<0.01）。
表 3 APOE基因不同分型阿托伐他汀治疗3个月后血脂水平变化率比较（
$ \bar x$ ±s）APOE分型 血脂水平变化率（%） TC TG HDL−C LDL−C E2（n=30） −5.14±43.07 −10.33±20.52 −3.66±17.97 −15.93±24.38 E3（n=142） −22.06±10.95 −10.54±6.08 10.75±7.31 −17.85±6.39 E4（n=38） −7.30±13.12 5.86±24.18 −0.38±15.50 −5.85±16.27 F 15.3615 22.0550 29.8886 13.6252 P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 -
两组患者TBil、ALT、ALP的变化率差异无统计学意义（P>0.05），（TC+CC）组较TT组能显著升高CK，有统计学意义（P<0.01），见表4。
表 4 患者SLCO1B1基因多态性对阿托伐他汀安全性影响（
$ \bar x$ ±s）组别 安全性指标变化（%） TBil ALT ALP CK TT（n=166） 30.06±25.83 36.27±50.22 23.68±42.32 8.39±32.28 TC+CC(n=44) 22.62±31.01 20.36±45.22 35.49±54.63 28.62±29.66 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 -
纳入的210例患者中，共有10例患者表示出现不同程度的肌痛症状，其中，8例患者为SLCO1B1突变型（CT+CC），2例为SLCO1B1野生型（TT型），两组肌痛发生率有显著性差异（P<0.01），见表5。
表 5 有肌痛症状和无肌痛症状组患者携带SLCO1B1基因型情况
基因位点 基因型 无肌痛 肌痛 SLCO1B1（n=210） TT（n=166） 164 2 TC+CC(n=44) 36 8 合计 200 10 -
阿托伐他汀，3-羟基-3-甲基-戊二酰（HMG）-CoA还原酶抑制剂，不仅被广泛用于治疗高胆固醇血症，在动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）一级和二级预防中亦能显著降低心血管事件风险。但在临床实践中，阿托伐他汀的降脂效果，以及药物不良反应个体差异较大，这可能与基因遗传学方面有关，而SLCO1B1和APOE则是2个重要基因。
有机阴离子转运体OATP1B1是SLCO1B1基因编码蛋白，主要存在于人体肝脏的基底膜外侧，负责将多种内源性和外源性物质由血液转运至肝细胞内。阿托伐他汀需经OATP1B1主动摄取进入肝细胞，从而发挥降血脂的作用。目前发现SLCO1B1具有很高的遗传变异性，尤其是521T>C位点突变使OATP1B1转运功能下降,降低了肝细胞内药物浓度, 而升高体循环中的药物浓度，此时可能导致肌肉损伤等毒副作用。BAI等分析了758例服用阿托伐他汀后出现SAM的患者，发现SLCO1B1521 T>C突变与高他汀类相关肌病（SAM）风险显著相关（R=1.741，95%CI：1.180～2.568，P=0.005）[6]。王婧等[7]研究认为，SLCO1B1基因388A>G对阿托伐他汀降脂效果无显著影响。本研究发现，SLCO1B1基因521 T>C TC/CC组有18.18%患者出现肌痛症状，与TT组相比差异有统计学意义，这可能与患者体内阿托伐他汀药物浓度升高有关。因此，SLCO1B1基因521 T>C增大了患者发生肌病的风险，对于有SLCO1B1521 T>C等位基因突变的患者，建议临床使用时降低他汀类药物剂量或更换他汀类品种。
APOE是一种蛋白质，在脂质体内平衡中起着关键作用，因为它调节血液和大脑中的胆固醇，甘油三酸酯和磷脂代谢。ApoE蛋白的产生受APOE基因的控制，针对该基因可识别3个不同的等位基因：ε2，ε3和ε4。APOE位于乳糜微粒、高密度脂蛋白（HDL）、中密度脂蛋白（IDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）的表面。APOE基因调节该蛋白的表达，并具有3个不同的等位基因：ε2，ε3和ε4[8]。张宇等[9]报道，经阿托伐他汀治疗后，APOE基因型e3/e3患者的血脂水平及APOE基因表达的下调程度均高于e3/e4型患者。Kirac等[10]研究发现，经阿托伐他汀治疗后，对APOE基因e2携带者的降脂作用最强，e4突变型患者主要见于无效组中。本研究中，患者经阿托伐他汀治疗后，APOE E4等位基因携带者对阿托伐他汀降脂治疗不敏感，故此类型患者可采用非他汀类调脂药物治疗。
综上所述，本研究发现APOE基因型影响阿托伐他汀降脂效果，而SLCO1B1521 T>C基因型与增加肌病的风险相关。药师在开展药物治疗管理时，可通过相应的基因多态性检测评估患者疗效和出现肌病的风险，合理选择降脂药物品种和剂量，提高临床用药的有效性和安全性，实现个体化用药。因本研究病例数有限，后续还需多中心、大样本、前瞻性研究等临床试验进一步验证。
Effects of SLCO1B1 521 T>C and APOE gene polymorphisms on lipid-lowering efficacy and adverse reactions of atorvastatin
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摘要:
目的 研究缺血性脑卒中伴血脂异常患者SLCO1B1 521 T>C和APOE基因多态性对阿托伐他汀临床疗效及安全性的影响。 方法 收集上海市浦东新区公利医院2018年4月至2018年12月收治的缺血性脑卒中伴血脂异常的患者210例，测定纳入患者SLCO1B1 521 T>C和APOE基因多态性，给予阿托伐他汀20 mg/d口服进行降脂或调脂治疗，于治疗前和治疗后3个月测定其TC、TG、HDL-C、LDL-C水平来评价疗效，测定TBil、ALT、AST、CK水平，以及根据不良反应来评价安全性。 结果 SLCO1B1 521 T>C的基因型分布为TT 79.05%，TC 19.05%，CC 1.90%；APOE基因的E2、E3、E4等位基因频率分别为14.28%、67.62%、18.10%，各基因型符合Hardy-Weinberg平衡定律。服药3个月后，APOE不同基因型患者TC、TG、LDL-C、HDL-C变化有显著性差异（P<0.01）。各项安全性指标未发现明显异常。SLCO1B1 521 T>C突变组肌痛发生率高于野生组，有显著性差异（P<0.01）。 结论 APOE基因多态性影响阿托伐他汀的调脂疗效，患者SLCO1B1 521 T>C基因可能与阿托伐他汀肌痛不良反应相关。检测SLCO1B1和APOE基因分型有助于血脂个体化治疗，为药物治疗管理患者他汀类药物合理使用提供依据。 Abstract:Objective To study the effect of SLCO1B1 521 T>C and APOE gene polymorphisms on the clinical efficacy and safety of atorvastatin in ischemic stroke patients with dyslipidemia. Methods 210 cases of ischemic stroke with dyslipidemia were enrolled from April 2018 to December 2018 to determine SLCO1B1 521 T>C and APOE gene polymorphisms. Patients received atorvastatin 20 mg/d orally. TC, TG, HDL-C, LDL-C levels were measured to evaluate the efficacy 3 months pre-and post- treatment. TBil, ALT, AST, CK levels were assayed with following up adverse reactions to evaluate safety. Results SLCO1B1 521 T>C genotype distribution was TT79.05%, TC19.05%, CC1.90%. E2, E3, E4 allele frequencies of APOE genes were 14.28%, 67.62%, 18.10%. Each genotype conforms to the law of Hardy-Weinberg balance. After three months of medication, there were significant differences in TC, TG, LDL-C, HDL-C changes in patients with different APOE genotypes. No obvious abnormality was found in safety index. The incidence of myalgia in SLCO1B1521 T>C mutant group was significantly higher than that in the wild group (P<0.01). Conclusion Lipid regulation of atorvastatin was affected by APOE gene polymorphism. SLCO1B1521 T>C may be associated with myalgia, the adverse reaction of atorvastatin. The detection of SLCO1B1 and APOE genotyping is helpful for individualized treatment of blood lipids and provides basis for rational use of statins in patients for drug therapy management. -
Key words:
- SLCO1B1 /
- APOE /
- gene polymorphism /
- atorvastatin /
- lipid regulating agents /
- adverse drug reactions
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中药红花（Carthami Flos）是菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，传统本草学著作《本草纲目》记载，红花具有活血散瘀，通经止痛的功效[1]，其药材和制剂在临床上被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。现代药理研究表明，其主要药效物质是以羟基红花黄色素A（hydroxysafflower yellow A，HSYA）为代表的查尔酮类化合物和以菸花苷为代表的黄酮醇类化合物，这些化合物均具有良好的心脑血管损伤保护活性[2-3]。红花药材的产量偏低，每平方千米产量仅为18.0～22.5 t[4]，其中特有的HSYA[5]、红花红色素等查尔酮类成分在不同品种间差异较大[6]。由于红花中的查尔酮类成分仅特异性地存在于花冠中[7]，加之体外组织培养再生率低[8]等原因，对其功能基因的研究工作一直进展缓慢。特别是对于HSYA等红花特有的有效成分，其生物合成相关的功能基因尚不完全清楚，合成通路也未被完全解析[9]。因此，用现代分子生物学技术手段以提高药效物质的含量，是提高红花品质，节约土地资源、降低制药成本的一条新途径。
短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenases/reductases，SDR）在植物次生代谢物的生物合成中广泛参与各类碳-氧双键，碳-碳双键以及烯酮键的氧化还原催化反应。根据SDRs基因序列的特征结构，SDRs超家族可以被分为5个亚家族[10-14]。最早发现并且进行鉴定的两类主要短链还原酶命名为classical和extend，classical类的SDRs基因拥有长度约为250个氨基酸残基，被称为Extended类的SDRs基因在碳基末端因其含有多余的约100个氨基酸残基而得名。另外3种类型SDRs基因分别被命名为intermediate、complex和divergent。这些类型的SDRs基因基于其结合辅酶类型和结合催化位点的不同进行命名分类。此外，SDRs存在与传统类型不同的含有“rossmann-fold”保守结构域的氧化还原酶结构[15-18]。
黄酮类化合物起源于莽草酸途径和苯丙素生物合成途径，1个香豆酰辅酶A（coumaroyl CoA）和3个丙二酰辅酶A（malonyl CoA）在查尔酮合酶的作用下生成二氢查尔酮，然后经查尔酮异构酶催化为二氢黄酮，进一步在各类还原酶，聚合酶和糖基转移酶的作用下，生成终端次生代谢产物组合[19-21]。红花中所含的主要有效成分HSYA具有查尔酮式结构，本课题组前期研究认为：HSYA从前体物质到合成，中间存在必不可少的氧化还原过程。短链脱氢还原酶家族广泛参与植物体内次生代谢，这一类还原酶都带有相似的折叠结构以及催化位点，已有研究表明，其对苯丙烷代谢途径起重要作用[22-23]，但有关红花中还原酶基因相关报道较少[24]。故笔者通过对红花转录组数据库、基因表达谱数据库以及代谢组数据库进行分析，筛选在HSYA生物合成途径的关键还原酶基因，并进行功能验证，以期揭示红花次生代谢成分生物合成途径，为定向调控红花的品质提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
云南巍山红花品系（ZHH0119），采自海军军医大学药学系温室，经海军军医大学郭美丽教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）。红花种植条件：温度恒定25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。采集相关花与组织后迅速存放于液氮或者−80 ℃冰箱中冷冻。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
按照Trans ZOL Plant植物总RNA提取试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法提取红花花冠总RNA，按照Transtart One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix逆转录试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书方法进行cDNA第一链的合成。cDNA于−20 ℃保存。
1.3 基因筛选
基于数据库中的基因注释以“黄酮还原酶”和“黄酮类化合物生物合成”作为关键词进行检索，筛选出其中可能与HSYA生物合成相关的还原酶基因，将筛选基因不同花期时间的表达量，将其与红花代谢组数据库中同花期的芦丁（rutin）、山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、HSYA、柚皮素（naringenin）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（kaempferol-3-O-rutinoside）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-gluciside）、Carthamin、芹菜素（apigenin）、黄芩素（scutellarein）、木犀草素（luteolin）、苯丙氨酸（D-phenylalanine） 12个主要成分的含量[12,25]进行皮尔森相关性分析。
1.4 全长克隆及生物信息学分析
基于红花花冠EST转录组文库，结合第三代测序技术[26-29]红花花冠全长转录组数据库筛选得到目的基因序列。在其5'端、3'端分别设计特异性引物。按照2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）高保真酶（南京诺唯赞公司，中国）说明书进行PCR扩增，扩增片段经EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（北京全式金公司，中国）说明书操作回收后，连接于pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金公司，中国）载体上，转化至大肠杆菌T1感受态细胞（北京全式金公司，中国）后，涂布在LBA平板上，恒温培养37 ℃过夜，挑取阳性单克隆菌落[30-31]，送至上海生工生物有限公司进行菌液测序。
用ExPASyProtParam工具（http://web.expasy.org/compute/）对目的基因的理论等电点（pI），蛋白分子量（MW）和蛋白分子式进行预测。通过Simple Molecule Architecture Research Tool工具（http://smart.embl-heidelberg.de/）对目的基因编码的蛋白质结构功能域进行分析。使用ProtScale（http://us.Expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）以及TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质的亲/疏水性和跨膜区域做出预测。使用SignaIP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测目的蛋白是否含有信号肽。使用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对筛选出的SDRs基因进行BLAST序列比对。通过Neighbor-Joining相邻节点法构建系统发育进化树，自展分析法进行1000次重复[32-34]。使用PBILYON-GRLAND数据库预测构建蛋白质二级结构模型。蛋白三级结构由Protein Homology/analogy Recognition Engine预测。用WOLFPSORT软件（https://wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。
1.5 目的基因表达模式分析
取盛花期新鲜红花根、茎、叶、花冠4个部位的新鲜组织和花期Ⅰ（开花前3 d）、花期Ⅱ（开花当天）、花期Ⅲ（开花后1 d）、花期Ⅳ（开花后3 d）4个花期的新鲜花冠，提取总RNA，合成cDNA第一链后，在靠近5'端处对各个基因设计引物，依据Transtart Top Green qPCR super Mix（北京全式金公司，中国）试剂盒推荐体系，以Ct60s（KJ634810）作为内参标记基因，进行qRT-PCR实验，结果使用2−ΔΔCt的方法进行计算分析[35]。
1.6 植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
根据CtSDR3的开放阅读框和植物真核表达载体pMT-39序列信息，设计无缝克隆引物。以红花cDNA做模板，使用高保真酶进行PCR反应。产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经NcoI酶切线性化的pMT-39载体进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性克隆菌株扩大培养后抽提质粒，提取的pMT39-CtSDR3质粒用冷冻法转至农杆菌GV3101中。LBK+Rif平板筛选阳性克隆后，取1ml OD600 = 0.8的菌液经6 000 r/min，离心3 min后用1 ml 5%蔗糖溶液重悬，加入Silwet-L 1μl，用注射器注射于红花花柱，套袋避光[35]。
在pMT-39的35 s启动子区域设计5'端特异性引物，在目的基因CtSDR3中设计3'端引物。取T2代新鲜叶cDNA第一链作为模板，2× Easy Taq PCR Mix（北京全式金，中国）推荐体系进行PCR反应，确定是否存在目的条带。采集CtSDR3阳性植株花冠以及pMT-39空载体对照植株的花冠，按照上述的qRT-PCR反应体系评价CtSDR3基因的过表达水平，使用UPLC-Q-TOF/MS 检测CtSDR3过表达组和空载体对照组的黄酮代谢物含量，选择以HSYA为代表性成分的8个黄酮类化合物作为检测对象。
1.7 原核表达载体构建及蛋白表达
根据CtSDR3的开放阅读框及蛋白表达载体pGEX-6p-1以及pET-28a序列信息，设计同源重组克隆引物[34]。以红花花冠cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应。PCR产物经胶回收后依无缝克隆试剂盒说明书与经XhoI、BamHI酶切线性化的载体pGEX-6p-1以及pET-28a进行重组连接。重组载体转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性菌株克隆扩大培养后抽提质粒，提取的重组质粒用热激法转至大肠杆菌Rosseta（DE3）（上海唯地生物，中国）中。
在20 ml LBA液体培养基中培养至OD600为0.6左右，分2份10 ml菌液各加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG和生理盐水。恒温培养箱中16 ℃，100 r/min继续培养16 h[35-36]。菌液离心弃上清液，用1×PBS缓冲液洗涤两次后重悬。超声破碎仪中40 kW，工作时间5 s，循环间隔时间25 s，共15个循环进行破碎[16]，裂解完成后取上清与沉淀15 μl，上样检测。
2. 结果
2.1 基因筛选
通过分析，得到contig325、contig483、contig2863共3个与HSYA具有强相关性的基因（r>0.85），见图1。
2.2 全长克隆和生物信息学分析
3个目的基因序列信息经测序验证结果如下：contig325全长共1523 bp，开放阅读框1341bp，编码446个氨基酸；contig483全长1393 bp，开放阅读框792 bp，编码263个氨基酸；contig2863全长序列1527 bp，开放阅读框1023 bp，编码340个氨基酸。PCR产物电泳结果如图2所示。
contig325基因编码446个氨基酸，命名为CtSDR1（GenBank登录号：MW792035）；Contig483基因编码263个氨基酸，命名为CtSDR2（GenBank登录号：MW792036）；Contig2863基因编码339个氨基酸，命名为CtSDR3（GenBank登录号：MW792037）。系统进化树表明CtSDR1与蓟Cirsium japonicum (QQH14901.1)同源性最高；CtSDR2与小蓬草Erigeron canadensis (XP_043636506.1)同源性最高；CtSDR3与小豆蔻Cynara cardunculus var. scolymus (KVI09206.1)同源性最高。Prot-param分析CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C2230H3346N606O639S7，相对分子量为49.2×103，理论等电点pI=9.61；CtSDR2基因所编码的蛋白质分子式C1289H2072N360O379S13，相对分子量为29×103，理论等电点pI=8.63；CtSDR1基因所编码的蛋白质分子式C1691H2614N442O481S9，相对分子量为37.1×103，理论等电点pI=6.80。Prot Scale分析预测CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白为亲水性蛋白，无信号肽属非分泌蛋白。蛋白跨膜性分析显示CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3不含有跨膜区域，为非跨膜蛋白。对CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3蛋白二级结构的预测显示均属于不规则结构。对CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3蛋白质三维结构预测如图3所示。系统进化树如图4所示。亚细胞定位预测显示，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3均可能定位于细胞质。
2.3 目的基因表达模式分析
取红花花期的Ⅳ期的红花各个部位进行分析，发现红花花冠内的CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3基因表达量从高到低依次均为花冠>叶>茎>根。其中CtSDR1在花冠中的相对表达量约为根中的3倍、而CtSDR2、CtSDR3在花冠中的相对表达量约为根中的4倍。将4个花期的红花花冠进行qRT-PCR分析表明，CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3花冠中表达量均随着花冠发育逐渐升高，特别是CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3的Ⅳ期花冠对比Ⅲ期花冠的表达量分别提高了7.2倍、2.7倍、2.3倍（图5）。
2.4 CtSDR3植物表达载体构建及红花体内功能初步验证
构建真和表达载体并通过PCR鉴定后，我们从19株农杆菌浸染的子代植株中得到5株pMT39-CtSDR3阳性红花植株（图6）。通过qPCR对其CtSDR3基因转录水平进行测定，结果发现阳性红花植株中CtSDR3基因的转录水平得到显著增加，约为空白组株系的2～3倍，CtSDR3的在花冠部位的高表达也证明了研究成功获取CtSDR3过表达红花植株（图7）。通过UPLC-QTOF/MS技术测定阳性转基因红花株系组和空白对照组的目标化合物含量，包括7个红花花冠主要黄酮类化合物及苯丙烷类代谢途径上游关键物质苯丙氨酸（图8），分别为：野黄芩素（scutellarein）、Carthamin、HSYA、山柰酚（kaempferol）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-β-D-glucoside）、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（kaempferol-3-O-β-rutinoside）、芦丁（rutin）和苯丙氨酸（D-Phenylalanine）。由图8可知，与空白组相比，CtSDR3过表达株系相较于空白组野黄芩素提高了3.6%～9.8%，HSYA提高了7.1%～16.6%，以及苯丙氨酸含量提高了5.5%～15.7%，具有显著性升高。其他化合物含量则有无显著性变化趋势。通过对过表达株系与空白组的含量分析，我们认为CtSDR3基因过表达会引起红花中黄酮类物质的变化，尤其是HSYA含量升高显著。同时，苯丙氨酸代谢途径属于植物重要的次生代谢途径，过表达组引起苯丙氨酸含量的显著上升，上述指标性成分的变化也进一步说明CtSDR3对红花黄酮类化合物次生代谢途径具有一定的影响，但目前我们尚难以判断CtSDR3红花中影响次生代谢产物积累的明确途径。
图 6 真核表达载体构建及阳性鉴定电泳图注：1. CtSDR3基因开放阅读框（ORF）区扩增产物电泳图，a、b泳道均为CtSDR3基因ORF区克隆PCR产物；2. 真核表达载体pMT-39载体酶切产物电泳图，a、b泳道为CtSDR3 PCR产物，c泳道为pMT-39载体，d、e泳道为pMT-39线性化载体；3. pMT39-CtSDR3重组载体阳性转化子鉴定电泳图，a、b泳道为阳性转化子菌液PCR产物；4. pMT39-CtSDR3质粒转化农杆菌GV3101，a、c和e泳道为空白对照组，b、d和f泳道为阳性克隆菌液PCR产物；5. 红花pMT39-CtSDR3阳性转化植株鉴定PCR产物电泳图，1～19为待鉴定植株，p为pMT39-CtSDR3质粒，k为空白组，WT为野生型红花植株
图 8 阳性植株黄酮类化合物含量测定注：A.黄芩素；B.Carthamin；C.HSYA；D.山柰酚；E.山柰酚-3-O-葡萄糖苷；F.山柰酚-3-O-芸香糖苷；G.芦丁；H.苯丙氨酸；CK.空白组株系；OVX.阳性过表达株系2.5 原核表达载体构建及蛋白表达
目的片段成功扩增，将目的条带进行胶回收、纯化。CtSDR1、CtSDR1、CtSDR1构建的pGEX-6p-1、pET-28a原核表达载体均有在大肠杆菌内表达，但是CtSDR1-pGEX-6p-1、 CtSDR2-pGEX-6p-1、CtSDR3-pGEX-6p-1、CtSDR1-pET-28、CtSDR2-pET-28a、CtSDR3-pET-28a表达的目的蛋白均形成包涵体，存在于沉淀中。无法进行下一步大量纯化实验，唯有CtSDR2-pGEX-6p-1诱导表达了存在于上清液的目的蛋白，明显可以在上清液中观察到分子量约为50 000的蛋白条带（图9）。
图 9 目的片段PCR产物电泳及表达蛋白电泳分析注：A.目的片段PCR产物电泳：1～5为CtSDR1，6～10为CtSDR2，11～15为CtSDR3（其对应的PCR反应Tm值分别为67 ℃、65 ℃、63 ℃、59 ℃、57 ℃）；B.pGEX-6p-1蛋白表达电泳分析；C.pET-28a蛋白表达电泳分析3. 讨论
越来越多的红花药理学相关研究表明，红花的主要药效物质包括查尔酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物，其中，查尔酮类HSYA对脑缺血具有保护作用，并且还能抗脑血栓形成以及抗氧化等。研究HSYA的生物合成分途径，对于HSYA的工业化生产具有重要意义。
本研究借助生物学分子技术、结合代谢组分析测定，筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2和CtSDR3，这3个基因序列具有高度保守性，在不同器官的表达模式均呈现出花冠>叶>茎>根的特点，而且在花冠中的表达量随花冠发育逐渐升高，表明其很有可能参与红花中HSYA等主要药用成分的积累。进一步研究发现，转CtSDR3过表达T2代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍，次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P<0.05），验证了我们对CtSDR3在红花体内参与黄酮类化合物生物合成功能的推测。本研究中，体外表达CtSDR3蛋白，得到目的蛋白条带，但由于包涵体等原因，蛋白表达和纯化条件仍需要进一步摸索。下一步，我们将对可能起黄酮类生物合成途径的关键SDRs进行深入的生物学特性特别是酶结合位点的研究，为更好地阐释SDRs的生物学功能、利用分子生物育种技术培育高HSYA含量的红花新品种奠定基础。
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表 1 缺血性脑卒中伴血脂异常患者SLCO1B1和APOE各基因型频率
基因型 野生型
纯合型（TT）突变
杂合型（TC）突变
纯合型（CC）等位基因
（频率/%）T C SLCO1B1 521 T>C 166
（79.05）40
（19.05）4
（1.90）372
（88.57）48
（11.43）APOE 526 C>T 169
（80.47）38
（18.10）3
（1.43）376
（89.52）44
（10.48）388 T>C 5
（2.38）28
（13.33）177
（84.29）38
（9.05）382
（90.95）
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表 2 缺血性脑卒中伴血脂异常患者APOE基因分型及频率
基因分型 等位基因 数量（例） 合计（例） 频率（%） E2 e2/e2（TT/TT） 5 30 14.28 e2/e3（TT/CT） 25 E3 e3/e3（TT/CC） 139 142 67.62 e2/e4（TC/TC） 3 E4 e3/e4（CT/CC） 35 38 18.10 e4/e4（CC/CC） 3 合计 210 210 100
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表 3 APOE基因不同分型阿托伐他汀治疗3个月后血脂水平变化率比较（
$ \bar x$ ±s）APOE分型 血脂水平变化率（%） TC TG HDL−C LDL−C E2（n=30） −5.14±43.07 −10.33±20.52 −3.66±17.97 −15.93±24.38 E3（n=142） −22.06±10.95 −10.54±6.08 10.75±7.31 −17.85±6.39 E4（n=38） −7.30±13.12 5.86±24.18 −0.38±15.50 −5.85±16.27 F 15.3615 22.0550 29.8886 13.6252 P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
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表 4 患者SLCO1B1基因多态性对阿托伐他汀安全性影响（
$ \bar x$ ±s）组别 安全性指标变化（%） TBil ALT ALP CK TT（n=166） 30.06±25.83 36.27±50.22 23.68±42.32 8.39±32.28 TC+CC(n=44) 22.62±31.01 20.36±45.22 35.49±54.63 28.62±29.66 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05
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表 5 有肌痛症状和无肌痛症状组患者携带SLCO1B1基因型情况
基因位点 基因型 无肌痛 肌痛 SLCO1B1（n=210） TT（n=166） 164 2 TC+CC(n=44) 36 8 合计 200 10
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